KR101875662B1 - 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법 - Google Patents

등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법에 관한 것으로, 본 발명은 LAMP의 핵산 증폭 반응을 위해 4~6종의 올리고뉴클레오타이드 외에 추가적으로 설계되는 올리고뉴클레오타이드는 필요 없으며, DNA와 RNA에 대한 target 유전자 특이적 서열의 핵산 증폭에 따른 형광량을 검출하며 반응 종료 후 검출도 가능하며, 실시간으로도 형광량을 검출할 수 있는 방법으로 target 유전자에 따라 리포터 염료를 달리하여 하나의 튜브에서 반응 종료 후 또는 실시간으로 형광량을 측정하여 동시 다중 검사가 가능한 효과가 있다.

Description

등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법{AN ISOTHERMAL BASED-DUAL FUNCTIONAL OLIGONUCLEOTIDE INCLUDING REPORTER DYE, AND QUENCHER FOR ISOTHERMAL NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND MEASUREMENT METHODS USING SAME}
본 발명은 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 등온 핵산 증폭 반응 시 실시간 형광 모니터링을 통해 반응 시간마다 핵산 증폭 여부 측정 및 end-point 단계에서 형광량 측정을 통해 반응산물의 핵산 증폭 반응 여부를 검출하는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드의 용도와 이를 이용한 핵산 증폭 방법 및 측정 방법에 관한 것이다.
핵산증폭 기술은 분자생물학 및 생명공학 분야에서 주로 사용되는 기술로 소량의 핵산을 검출하고 분석할 수 있는 방법이다. 핵산증폭을 위해 thermostable enzyme을 사용하여 DNA/RNA를 분석하는 PCR(Polymerase chain reaction) 기술이 가장 넓게 사용되는 방법으로 높은 온도조건에서 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시킨 후, 온도를 낮추어 단일가닥에 primer(시발체)가 결합하고 Taq polymerase(thermostable enzyme)가 이중가닥 DNA로 연장시키는 과정이 반복되는 방법이다.
형광물질을 이용한 실시간 PCR 방법은 PCR 과정 중에 형광의 발광세기에 따라 핵산을 검출하는 방법으로 PCR 반응물 중간 위치에 해당하는 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 5‘ 말단에 리포터 염료가 부착시키고, 3’ 말단에 퀀처가 부착된 단일가닥의 probe를 추가하여 Taq polymerase의 5‘->3’ exonuclase 활성에 의해 PCR 반응 시 단일가닥의 probe가 상보적인 서열에 결합하고 Taq polymerase의 연장반응에 의해 probe가 5‘말단부터 가수분해되어 리포터 염료가 퀀처로부터 멀어져 형광을 발광하여 실시간 PCR 장비의 형광 탐지기에 의해 형광량을 표시해준다. 실시간 PCR 장비의 형광 탐지기에 따라 형광 파장을 다르게하여 두 개 이상의 target을 검출하는 동시 다중 검출이 가능하여 병원체 검출 및 돌연변이 검출 등 진단 분야에서 많이 사용되는 기술로 고가의 실시간 PCR 장비와 숙련된 technician이 필요하다는 단점을 가지고 있다.
고가의 실시간 PCR 장비 없이 등온조건에서 DNA/RNA를 검출하고, PCR 방법보다 더 빠른 시간 안에 핵산을 검출하는 등온증폭법(Isothermal amplification method)들이 개발되어지고 있다. RNA 증폭을 위해 RNA polymerase, reverse transcriptase, Rnase H와 같은 enzyme을 사용하는 Transcription Mediated Amplification(TMA), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA) 방법이 있으며, Strand Displacement Amplification(SDA)는 exonuclase-deficient DNA polymerase가 이중 가닥의 핵산을 합성하기 위해 기존 가닥 하나를 displacement시키고 restriction enzyme으로 nick을 형성시켜 이 과정이 반복되면서 핵산이 증폭되는 방법이고, 이와 유사한 Nicking and Extension Amplification Reaction(NEAR)는 restriction enzyme 대신 nicking enzyme을 사용하는 방법이다. Helicase-Dependent Amplification(HDA)는 5‘ 말단과 3’말단부터 이중가닥을 풀어주는 Helicase의 기능을 사용한 것이며 이와 유사한 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)는 이중가닥을 풀어주는 recombinase를 이용한 방법이다.
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)는 4~6개의 specific primer와 strand displacement activity를 갖는 DNA polymerase를 이용하는 핵산 증폭 기술(Patent.No. PCT/JP2000/001919)이다.
LAMP의 측정 방법으로는 아가로즈 겔 전기영동분석을 통해 smeared pattern의 band를 확인하여 특정 유전자 핵산 증폭 반응의 유무를 분석할 수 있지만, 아가로즈 겔 전기영동분석 시, 반응 튜브를 개봉하여 핵산 오염의 근원이 될 수 있다.
따라서, 핵산 오염원 차단을 위하여 반응 튜브를 개봉하지 않고 측정할 수 있는 기술이 개발되고 있으며, 일반적으로 LAMP에서 사용되고 있는 탁도 측정법(Mori.Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 289:150-154)은 등온 핵산 증폭 반응물 증가에 따라 피로인산마그네슘(Magnesium pyrophosphate, Mg2P2O7)에 의한 백색 침전물이 축적되어 400nM의 파장의 탁도를 측정하여 실시간 검출 및 end-point 검출이 가능하여 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인할 수 있다. 하지만, 두 개 이상의 target 구별과 같은 동시 다중 검출은 불가하며 측정하고자 하는 피로인산마그네슘의 침전으로 인해 측정법에 대한 정확도가 낮다는 단점이 있다.
LAMP에서 핵산 증폭 여부를 실시간 측정하기 위한 형광검출법은 반응 튜브 개봉 없이 형광물질만을 측정하여 오염 발생을 제거시켰으며, 침전물 발생으로 인한 정확도 감소 효과도 없앨 수 있는 장점을 가지고 있다.
LAMP에서 SYBR Green I과 같은 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터 (Intercalater)를 반응액에 첨가하여 핵산 증폭 반응물 증가에 따라 형광강도가 증대되어 실시간 측정이 가능하다. 실시간 PCR 증폭 반응에서도 사용되는 SYBR Green I은 핵산 증폭 산물의 서열 특이적으로 확인되지 않기 때문에 primer dimer 발생에도 형광도가 측정되어 비특이 반응의 구별을 위해서는 실시간 측정 이후 온도를 95℃까지 천천히 높여주어 핵산 증폭 반응물의 풀림 온도를 측정하여 비특이 반응 여부를 판단해야 검출 여부를 확인할 수 있으며, 두 개 이상의 target 구별과 같은 동시 다중 검출은 불가능하다.
LAMP에 의한 핵산 증폭 서열 특이적으로 형광을 검출하기 위한 기술들이 개발되었다. 동화 프로브(Assimilating probe)는 핵산 증폭 서열 특이적으로 설계된 두가닥의 probe로 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리를 이용하여 실시간 측정하는 방법(Patent.No. PCR/US11/41540)이다. 두 가닥의 probe 중 한 가닥은 리포터 염료가 5‘ 말단에 부착되고, 다른 한쪽 가닥은 3’ 말단에 퀀처가 위치한다. LAMP 핵산 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 수는 6가지로 다수의 primer가 포함되는데 동화 프로브는 이 중 loop primer의 하나를 대상으로 5‘ 말단에 리포터 염료를 부착시킨 한쪽 가닥의 probe를 설계하고, 이에 상보적인 서열을 일부를 설계하여 3’ 말단에 퀀처를 부착시킨 다른 가닥의 probe를 설계하여 7종의 올리고뉴클레오타이드를 합성해야 하며, 동화 프로브는 LAMP 반응 이전에 두개의 probe를 고온에서부터 저온으로 천천히 온도를 감소시켜 한쌍의 probe로 합성하여 핵산 증폭에 사용되어진다. LAMP에서 유전자 서열 특이적인 실시간 검출을 위해 동화 프로브를 사용하여 핵산 증폭 반응시 LAMP 반응의 억제효과가 나타나 검출 시간과 실시간 측정 시간이 길어진다.
동화 프로브와 유사한 probe를 사용하는 형광 검출법으로 형광 프로브(fluorephore-labeled primer/probe)와 퀀처 프로브(quencher-labeled probe)를 상보적인 서열을 갖도록 설계하여 한쌍의 probe를 사용하는 방법(Patent No. PCT/JP2012/077596)이다. 형광 프로브와 퀀처 프로브의 풀림 온도를 다르게 설계하여 LAMP 핵산 증폭 반응 중에는 형광 프로브만 target 유전자 특이 서열에 어닐링하여 반응되며, LAMP 핵산 증폭 반응 종료 후 온도를 낮추어 잔존하고 있는 형광 프로브가 퀀처 프로브와 결합시킨 후 형광량을 검출하는 방법이다. 이 한쌍의 프로브는 실시간 검출을 확인할 수 없으며, 동화 프로브와 마찬가지로 하나의 올리고뉴클레오타이드가 추가되어 설계되어야 한다.
LAMP 핵산 증폭 반응에서 실시간 검출 및 형광량 측정을 통해 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인하여 오염에 의한 위양성 반응을 해결하고 저농도로 존재하는 target 핵산의 증폭 여부를 민감하게 측정하기 위한 기술들이 개발되어졌지만, 탁도 측정 및 인터칼레이터 형광 측정과 같은 target 핵산 서열에 특이적이지 않은 방법들은 비특이 증폭 여부를 확인할 수 없으며 동시 다중 핵산 검출이 불가하다는 제한점이 있으며, probe를 사용하는 방법들은 target 유전자 서열 특이적으로 설계가 가능하고 다양한 리포터 염료와 퀀처를 사용하므로 동시 다중 핵산 검출의 수행이 가능하다. 하지만, LAMP에 사용되는 6종의 올리고뉴클레오타이드 이외에 한쌍의 probe를 형성시키기 위한 퀀처 프로브라는 올리고뉴클레오타이드의 설계가 필요하며, 한쌍의 probe를 반응물 조제 이전에 합성시켜 반응물에 첨가시켜줘야 하는 과정이 추가된다. 또한 한 쌍의 probe의 설계 위치는 loop primer를 대체하여 형광 probe로 설계하여야 한다. Loop primer는 LAMP 반응시 덤벨 구조의 loop가 형성된 이후에 어닐링하여 다음 과정이 진행되기 때문에 형광이 측정되는 시점은 실제 핵산이 증폭되는 시점보다 형광 검출 시간이 지연되어 측정된다. 동화 프로브는 LAMP의 반응성에 억제효과를 주며, 형광 프로브와 퀀처 프로브를 사용하는 방법의 경우는 실시간 검출을 할 수 없으며 반응 온도 종료 후 온도가 낮아져야 검출할 수 있는 제한점들이 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 LAMP의 핵산 증폭 반응을 위해 4~6종의 올리고뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 설계되는 올리고뉴클레오타이드가 없고, target 유전자 서열 특이적으로 검출이 가능하며 반응 종료 후 검출이 아닌 실시간으로 검출할 수 있는 기술 개발과 LAMP 등온 증폭 과정 중에 나타나는 증폭 산물을 실시간으로 측정하고자 하였으며, 동시 다중 검사가 가능한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,본 발명은 타겟 유전자의 특정 서열에 대한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP)용 프라이머 중 포워드 인너 프라이머(Forward Inner Primer) 또는 리버스 인너 프라이머(Reverse Inner Primer)를 대상으로 3’ 말단을 제외한 서열 중 일부서열을　인터널(internal) dT 또는 인터널(internal) dG, 인터널(internal) dC, 인터널(internal) dA, 인터널(internal) dU, 인터널(internal) dR로 서열을 변형시키고, 이 부위에 리포터 염료 또는 퀀처를 위치시키며, 일정 온도 이하에서 전체 또는 일부분 서열이 이중가닥을 형성하고, 버블 구조가 1개 이상인 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 리포터 염료와 퀀처 간격은 21~33mer 이내로 위치하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포워드 인터널 프로브와 리버스 인터널 프로브를 개별 또는 함께 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 리포터 염료는 FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, TEXAS RED, CY3, 및 CY5 중 하나이거나, 450 ~ 685 nm의 발광 파장대인 것이 바람직하고,
상기 올리고뉴클레오타이드의 퀀처는 TAMRA, DABCYL, Black Hole Quencher 1, 또는 2이거나, 500 ~ 705 nm 흡광 파장대인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나에서 네 개의 버블 구조를 갖는 것이 바람직하고,
상기 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥에서 단일 가닥으로 풀리는 풀림 온도가 30 ~ 70℃인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 5 내지 8 및 서열번호 15 내지 16에 기재된 올리고뉴클레오타이드 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 본 발명의 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온에서 실시간 핵산 증폭형광 검출을 위한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP) 또는 역전사(RT)-LAMP 반응을 수행하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온 또는 두 가지 이상의 온도 조건에서 종결점(end-point) 핵산 증폭 형광 검출을 위한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP) 또는 역전사(RT)-LAMP 반응을 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포워드 인터널 프로브와 리버스 인터널 프로브를 개별 또는 함께 사용하는 것이 바람직하고,
상기 방법의 등온 온도 조건은 50 ~ 75℃의 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 방법은 DNA 및 cDNA 핵산을 대상으로 수행하는 것이 바람직하고, 상기 방법은 RNA 핵산을 대상으로 역전사 반응 후 특정 유전자를 원스텝 반응으로 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 또는 감수성 검체에 대한 특정 유전자를 개별 또는 동시 다중적으로 증폭하는 키트를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 에볼라 바이러스(Ebola virus) 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 등온 핵산 증폭 반응용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 18의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명항의 올리고뉴클레오타이드와 안티-센스 프로브를 함께 사용하여 DNA, RNA, 또는 cDNA에 대한 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 안티-센스 프로브는 55 ~ 65℃이내에 설계 및 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 안티-센스 프로브는 포워드와 리버스 위치에서 개별 또는 함께 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 안티-센스 프로브는 서열번호 19 내지 23에 기재된 서열 중 하나를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 사용된 약어는 다음과 같다:
Internal dT : Internal Amino-C6(or C2)-　deoxythymine　 　
Internal dA :　Internal Amino-C6-　deoxyadenocine
Internal dC :　Internal Amino-C6-　deoxycytidine
Internal dG :　Internal Amino-C6-　deoxyguanosine
Internal dU :　Internal Amino-C6-　deoxyuridine
Internal dR : Internal Amino-C6-　deoxyribose
본 발명은 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 방법의 FIP(Forward Inner Primer)와 RIP(Reverse Inner Primer)는 각각 2개의 target 유전자 부위에 대한 primer가 하나의 올리고뉴클레오타이드로 설계되어 있으며, 이 2개의 target 유전자 부위 간에 1개 이상의 버블 구조를 형성시키고, 3‘ 말단을 제외하고 5’말단 또는 티민(Thymine) 부위를 internal dT로 변형시키고 리포터 염료 또는 퀀처를 부착시키는 구조로 하나의 IB-DFO에는 하나의 리포터 염료와 하나의 퀀처가 위치되어 primer와 probe의 두 가지 기능을 수행하고, 등온 핵산 증폭 반응 시 실시간 형광 모니터링을 통해 반응 시간마다 핵산 증폭 여부 측정 및 end-point 단계의 형광 모니터링을 통해 반응산물의 형광 측정으로 등온 핵산 증폭 반응 여부를 검출하는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드의 용도와 이를 이용한 핵산 증폭 방법 및 측정 방법을 제공한다.
본 발명은 target 유전자의 특정 서열에 대한 LAMP 등온 핵산 증폭 반응용 primer 중 FIP 또는 RIP를 대상으로 3’ 말단을 제외한 서열에 티민(Thymine) 염기를 internal dT 또는 아데닌(Adenine), 티민(Thymine), 구아닌(Guanine), 시토신(Cytosine), 유리딘(Uridine) 염기를 internal dR로 변형시키고 이 부위에 리포터 염료 또는 퀀처를 위치시키며, 일정 온도 이하에서 전체 또는 일부분 서열이 이중가닥을 형성하고, 버블 구조가 1개 이상인 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 target DNA 및 cDNA, RNA의 특정 유전자 서열을 등온 핵산 증폭을 위해 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 등온 핵산 증폭 반응 혼합물을 제공한다.
본 발명은 상기 반응 혼합물의 조성을 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2, MgSO4, Betaine, DTT(Dithiothreitol), Triton X-100, Tween-20, dNTPs, Bovine serum albumin(BSA), DMSO(Dimethyl sulfoxide), Formamide, Single strand binding protein, Pyrophosphate, Pyrophosphatase 등을 포함하고 5‘→3’ exonuclase(-), 3'→5' exonuclase(-), strand displacement 활성을 갖고있는 DNA polymerase와 함께 IB-DFO를 포함하는 LAMP 핵산 증폭 반응용 혼합물이다. 그리고, RNase inhibitor와 Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse transcriptase, Molony Murine Leukemia Virus (MMLV) Reverse transcriptase 등의 Reverse transcriptase와 thermostable Reverse transcritpase, Reverse transcriptase 기능을 가지고 있는 DNA polymerase와 함께 IB-DFO를 포함하는 RT-LAMP 핵산 증폭 반응용 혼합물을 사용하는 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 리포터 염료와 퀀처 간격은 21~33mer 이내로 위치하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 forward probe인 FIP-IB-DFO와 reverse probe인 RIP-IB-DFO를 개별 또는 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 리포터 염료를 FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, TEXAS RED,CY3, CY5 중 하나를 포함하고 450 ~ 685 nm의 발광 파장대를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 퀀처를 TAMRA, DABCYL, Black Hole Quencher 1, 2를 포함하고 500 ~ 705nm의 흡광 파장대를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온에서 실시간 핵산 증폭 형광 검출을 위한 LAMP와 RT-LAMP 반응 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온 또는 두가지 이상의 온도에서 end-point 핵산 증폭 형광 검출을 위한 LAMP와 RT-LAMP 반응 방법을 제공한다.
상기 방법은 올리고뉴클레오타이드의 IB-DFO 농도를 0.2 ~ 1.6 uM을 FIP 또는 RIP와 개별 또는 함께 포함하는 혼합물을 제공하고 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 LAMP 반응 방법의 등온 온도 조건이 50 ~ 75℃의 범위를 갖는 방법을 제공하고 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 DNA 및 cDNA 핵산을 대상으로 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 RNA 핵산을 대상으로 역전사 반응 후 특정 유전자를 원스텝 반응으로 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 하나에서 네 개의 버블 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥에서 단일가닥으로 풀리는 풀림온도가 30 ~ 70℃인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 또는 감수성 검체의 DNA 및 cDNA, RNA에 대한 특정 유전자를 개별 또는 동시 다중으로 증폭하는 키트를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 Ebola virus의 subtype인 Bundibugyo와 Reston에 대한 서열번호 1 ~ 18까지 올리고뉴클레오타이드 서열와 LAMP와 RT-LAMP primer 서열을 제공한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 LAMP의 핵산 증폭 반응을 위해 4~6종의 올리고뉴클레오타이드 외에 추가적으로 설계되는 올리고뉴클레오타이드는 필요 없으며, DNA와 RNA에 대한 target 유전자 특이적 서열의 핵산 증폭에 따른 형광량을 검출하며 반응 종료 후 검출도 가능하며, 실시간으로도 형광량을 검출할 수 있는 방법으로 target 유전자에 따라 리포터 염료를 달리하여 하나의 튜브에서 반응 종료 후 또는 실시간으로 형광량을 측정하여 동시 다중 검사가 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)의 리포터 염료와 퀀처 사이의 mer 수(거리)를 33, 25, 21mer 에 따른 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)의 forward inner primer(FIP)와 reverse inner primer(RIP)로 설계된 IB-DFO를 개별적으로 사용하여 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)의 forward inner primer(FIP)와 reverse inner primer(RIP)로 설계된 IB-DFO를 개별 또는 함께 적용하여 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 4는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 FIP와 FIP의 서열로 설계된 IB-DFO로 FIP : FIP-IB-DFO의 비율을 0 : 1.6 uM / 0.4 : 1.2 uM / 0.8 : 0.8 uM / 1.2 : 0.4 uM / 1.4 : 0.2 uM / 1.6 : 0 uM로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 FIP와 FIP의 서열로 설계된 IB-DFO로 FIP : FIP-IB-DFO의 비율을 0 : 1.6 uM / 0.4 : 1.2 uM / 0.8 : 0.8 uM / 1.2 : 0.4 uM / 1.4 : 0.2 uM / 1.6 : 0 uM로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 end-point 형광 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 end-point 형광 측정 결과이다.
도 8은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 사용하여 RNA transcript를 주형으로 원스텝 RT-LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 9는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 사용하여 RNA transcript를 주형으로 원스텝 RT-LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 end-point 형광 측정 결과이다.
도 10은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)와 온도별(55, 60, 65, 70℃) 설계된 퀀처 포함된 anti-sense probe를 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
도 11은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)와 온도별(55, 60, 65, 70℃) 설계된 퀀처 포함된 anti-sense probe를 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과의 Rn vs min (non-normalization) type의 결과이다.
도 12은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 forward 또는 reverse 또는 forward(F)와 reverse(R)를 사용하고 이에 상보적인 서열을 60℃로 설계한 퀀처 포함된 anti-sense probe를 함께 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 측정 결과이다.
이하, 실시 예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)의 리포터 염료와 퀀처의 거리(mer 수)에 따른 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO의 리포터 염료와 퀀처 사이의 거리(mer 수)에 따른 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 4종 primer를 PrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다.
설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이 부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고, 33(EB_B_FIP_P2, 서열번호 5), 25(EB_B_FIP_P2.5, 서열번호 6), 21mer(EB_B_FIP_P3, 서열번호 7) 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이 부위에 BHQ1 퀀처를 부착하였다. 3가지 IB-DFO가 이중 가닥에서 단일가닥으로 풀리는 온도(Melting temperature)는 54℃로 나타났다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 0.5M Betaine, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM을 사용하였으며, EB_B_FIP는 1.2 uM, EB_B_RIP는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, IB-DFO는 0.4 uM을 추가하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment(gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^7, 1x10^5, 1x10^3, 0 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다.
도 1은 IB-DFO의 리포터 염료와 퀀처 간격에 대한 LAMP 등온 핵산 증폭 반응 결과로 33, 25, 21mer 간격으로 설계된 IB-DFO를 사용하여 1x10^7 copies/reaction에서 각각 11.98분, 12.03분, 12.16분으로 나타났으며, 1x10^5 copies/reaction은 각각 15.3분, 15.28분, 15.73분, 1x10^3 copies/reaction은 각각 20.42분, 20.09분, 22.29분으로 유사 형광 검출 시간이 관찰되었으며 0 copies/reaction으로 D.W.만 첨가한 반응에서는 형광 시그널이 검출되지 않았다. 따라서, IB-DFO의 리포터 염료와 퀀처는 21~33mer 이내에서 형광량이 측정되었으며, 이중 25mer IB-DFO에서 가장 높은 RFU(Relative fluorescence unit)가 확인되었다.
실시예 2 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)의 forward, reverse 위치에서의 사용 효과 분석
본 발명의 IB-DFO를 forward 또는 reverse 위치에서 사용시 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 4종 primer를 PrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 33mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_B_FIP_P2(서열번호 5)와 EB_B_RIP primer 서열에 FAM 리포터 염료와 BHQ1 퀀처를 30mer 간격으로 설계한 EB_B_RIP_P2(서열번호 8)를 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 0.5M Betaine, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM을 사용하였으며, EB_B_FIP는 1.2 또는 1.6 uM, EB_B_RIP는 1.2 또는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, EB_B_FIP_P2와 EB_B_RIP_P2는 개별로 0.4 uM 씩 추가하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment (gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^7, 1x10^5, 1x10^3, 0 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다.
도 2는 FIP와 RIP로 설계된 IB-DFO를 개별로 사용하여 LAMP 등온 핵산 증폭 반응 결과에서 EB_B_FIP_P2를 포함하거나, EB_B_RIP_P2를 포함하는 반응에서 1x10^7 copies/reaction에서 각각 12.3분, 13.02분으로 나타났으며, 1x10^5 copies/reaction은 각각 15.92분, 16.13분, 1x10^3 copies/reaction은 각각 18.94분, 18.59분으로 유사 형광 검출 시간이 관찰되었으며 0 copies/reaction으로 D.W.만 첨가한 반응에서는 형광 시그널이 검출되지 않았다. 따라서, IB-DFO 설계시 FIP와 RIP 위치와 상관없이 유사한 LAMP 등온 핵산 증폭에 대한 실시간 형광 검출을 확인하였다.
실시예 3 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 forward, reverse 위치에서 개별 또는 함께 사용시 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO를 forward 또는 reverse 위치에서 함께 사용시 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Reston의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 6종 primer를 PrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_R_F3(서열번호 9), EB_R_R3(서열번호 10), EB_R_FIP(서열번호 11), EB_R_RIP(서열번호 12), Res_LP(서열번호 13), Res_RLP(서열번호 14)이며, IB-DFO는 EB_R_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 31mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_R_FIP_P2(서열번호 15)와 EB_R_RIP primer의 서열에 FAM 리포터 염료와 퀀처를 33mer 간격의 EB_R_RIP_P2(서열번호 16)를 설계하여 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 0.5M Betaine, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_R_F3와 EB_R_R3를 0.2 uM, Res_LP와 Res_RLP는 0.8 uM을 사용하였으며, EB_R_FIP는 1.2 또는 1.6 uM, EB_R_RIP는 1.2 또는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, EB_R_FIP_P2와 EB_R_RIP_P2는 개별로 0.4 uM 씩 추가하였다. EB_R_FIP_P2와 EB_R_RIP_P2를 함께 사용하는 조건에서는 각각 0.2 uM을 첨가하였으며, EB_R_FIP와 EB_R_RIP primer는 각각 1.4 uM을 사용하였다. Ebola virus의 Reston L segment (gb:JX477166, 410bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^4, 1x10^3, 0 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 30분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다.
도 3은 FIP와 RIP로 설계된 IB-DFO를 개별 또는 함께로 사용하여 LAMP 등온 핵산 증폭 반응 결과에서 EB_R_FIP_P2를 포함하거나, EB_B_RIP_P2를 포함하는 반응과 EB_R_FIP_P2와 EB_B_RIP_P2를 함께 사용하는 반응에서 1x10^4 copies/reaction에서 각각 16.02분, 16.95분, 16.40분으로 나타났으며, 1x10^3 copies/reaction은 각각 18.41분, 18.65분, 20.64분으로 유사 형광 검출 시간이 관찰되었으며 0 copies/reaction으로 D.W.만 첨가한 반응에서는 형광 시그널이 검출되지 않았다. 따라서, FIP와 RIP에 대한 IB-DFO는 개별 또는 함께 사용하여도 유사한 LAMP 등온 핵산 증폭에 대한 실시간 형광 검출을 확인하였다.
실시예 4 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)와 동일 서열로 설계된 inner primer의 비율에 따른 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO와 inner primer는 동일 서열로 설계되어 있으며 이 둘의 비율에 따라 사용 시 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 4종 primer를 PrimerExplorer V4 Software (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 33mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_B_FIP_P2(서열번호 5)를 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM을 사용하였으며, EB_B_RIP는 1.6 uM을 사용하고, EB_B_FIP : EB_B_FIP_P2는 0 : 1.6 uM, 0.4 : 1.2 uM, 0.8 : 0.8 uM, 1.2 : 0.4 uM, 1.6 : 0 uM 비율로 각각 혼합물에 첨가하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment (gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^7 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다. 그리고 end-point 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행 수 30℃에서 1분씩 10cycles 반응하여 형광량을 측정하였다.
도 4와 5의 결과는 inner primer : IB-DFO의 비율이 0 : 1.6 uM로 inner primer를 사용하지 않아도 inner primer가 첨가된 조건과 유사한 형광 검출 시간을 확인하였으며, IB-DFO 농도 감소에 따라 RFU가 감소하는 결과가 관찰되었다.
도 4는 실시간 형광 검출 결과이고, 도 5는 end-point 형광 검출 결과로 IB-DFO의 농도가 감소됨에 따라 RFU가 감소하는 동일 양상을 확인하였다. 따라서, IB-DFO는 primer 및 probe의 두 가지 기능을 함께 수행하는 것으로 확인되었으며, 실시간 형광 검출 및 end-point 형광 검출을 수행할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
실시예 5 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 적용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 등온 핵산 증폭 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO를 FIP 위치에 첨가 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 6종 primer를 PrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4), EB_BLP_F(서열번호 17), EB_B_LP_R(서열번호 18)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 33mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_B_FIP_P2(서열번호 5)를 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM, EB_B_LP_F와 EB_B_LP_R은 0.8 uM을 사용하였으며, EB_B_FIP는 1.2 uM, EB_R_RIP는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, 본 발명의 IB-DFO인 EB_B_FIP_P2는 0.4 uM을 혼합물에 추가하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment (gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^7, 1x10^6, 1x10^5, 1x10^4, 1x10^3, 1x10^2, 1x10^1, 0 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다. 그리고 end-point 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행 수 30℃에서 1분씩 10cycles 반응하여 형광량을 측정하였다.
도 6은 IB-DFO를 사용하여 plasmid DNA에 대한 저농도 구간의 민감도를 실시간 형광 측정을 수행한 결과로 1x10^7 ~1x10^2 copies/reaction 까지 양성 검출을 확인하였으며, 1x10^1과 0 copies/reaction은 음성 검출로 확인되었다. 검출 시간은 고농도부터 각각 6.29분, 8.01분, 9.12분, 10.12분, 11.73분, 13.17분으로 형광 검출 시간이 관찰되었다.
도 7은 end-point 형광 검출 측정 결과로 실시간 형광 측정 결과와 동일하게 1x10^7 ~1x10^2 copies/reaction 까지 양성 검출을 확인하였으며, 1x10^1과 0 copies/reaction은 음성 검출로 확인되었다.
도 6과 7의 결과로 본 발명의 IB-DFO를 사용시 실시간 및 end-point 형광 검출이 주형의 농도에 따라 동일하게 검출 유무를 확인할 수 있으며, 실시간 형광 검출 방법을 사용할 경우 LAMP 핵산 증폭 반응 시간을 단축시킬 수 있다.
실시예 6 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)를 적용하여 RNA transcript를 주형으로 RT-LAMP 등온 핵산 증폭 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO를 FIP 위치에 첨가 사용하여 RNA transcript를 주형으로 RT-LAMP 등온 핵산 증폭 반응에 따른 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 RT-LAMP 등온 핵산 증폭용 6종 primer를 PrimerExplorer V4 Software (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4), EB_BLP_F(서열번호 17), EB_B_LP_R(서열번호 18)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 25mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_B_FIP_P2.5(서열번호 6)를 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 50mM KCl, 10mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 5mM DTT, 5U RNase inhibitor(New England Biolabs, MA, USA), 1.4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM, EB_B_LP_F와 EB_B_LP_R은 0.8 uM을 사용하였으며, EB_B_FIP는 1.4 uM, EB_R_RIP는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, 본 발명의 IB-DFO인 EB_B_FIP_P2.5는 0.2 uM을 혼합물에 추가하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment (gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 plasmid DNA 제작하였으며, 본 plasmid DNA를 MEGAscript T7 Transcription Kit(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 in vitro transcription을 통해 RNA transcript를 합성하였다. Bundibugyo RNA transcript를 1x10^5, 1x10^4, 1x10^3, 0 copies/reaction 농도로 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 30분간 수행되었으며, 1분 단위로 CFX-96(Bio-Rad, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다. 그리고 end-point 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행 수 30℃에서 1분씩 10cycles 반응하여 형광량을 측정하였다.
도 8은 IB-DFO를 사용하여 RNA transcript에 대한 RT-LAMP 등온 핵산 증폭 실시간 형광 측정을 수행한 결과로 1x10^5 ~1x10^3 copies/reaction 까지 양성 검출을 확인하였으며, D.W를 사용한 0 copies/reaction은 음성 검출로 확인되었다. 검출 시간은 고농도부터 각각 8.72분, 10.03분, 10.98분으로 형광 검출 시간이 관찰되었다.
도 9는 end-point 형광 검출 측정 결과로 실시간 형광 측정 결과와 동일하게 1x10^5 ~1x10^3 copies/reaction 까지 양성 검출을 확인하였으며, D.W를 사용한 0 copies/reaction은 음성 검출로 확인되었다.
도 8과 9의 결과로 본 발명의 IB-DFO를 사용하여 원스텝 RT-LAMP 반응시 실시간 및 end-point 형광 검출이 주형의 농도에 따라 동일하게 검출 유무를 확인할 수 있으며, 실시간 형광 검출 방법을 사용할 경우 원스텝 RT-LAMP 핵산 증폭 반응에서도 DNA를 사용하는 LAMP와 마찬가지로 반응시간을 단축시킬 수 있다.
실시예 7 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(IB-DFO)와 온도별(55, 60, 65, 70℃) 설계된 퀀처 포함 anti-sense probe를 적용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 등온 핵산 증폭 형광 검출 효과 분석
본 발명의 IB-DFO를 FIP 위치에 첨가하고 IB-DFO의 리포터 염료 서열부터 3‘ 말단까지 상보적인 anti-sense 서열을 온도별(55, 60, 65, 70℃)로 설계하여 anti-sense 서열의 3’ 말단에 퀀처를 위치시켜 anti-sense probe를 설계하였다. 그리고, IB-DFO를 RIP에 위치에 첨가하고 anti-sense probe를 60℃로 설계하였다. 이를 사용하여 plasmid DNA를 주형으로 LAMP 등온 핵산 증폭 반응에서 anti-sense probe의 온도별 설계에 따른 실시간 형광 검출 효과를 관찰하기 위하여 Ebola virus의 subtype 중 하나인 Bundibugyo의 L segment(Polymerase) 부위 서열에 대해 LAMP 등온 핵산 증폭용 6종 primer를 PrimerExplorer V4 Software (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)로 설계하였다. 설계된 primer는 EB_B_F3(서열번호 1), EB_B_R3(서열번호 2), EB_B_FIP(서열번호 3), EB_B_RIP(서열번호 4), EB_BLP_F(서열번호 17), EB_B_LP_R(서열번호 18)이며, IB-DFO는 EB_B_FIP primer 서열에 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 FAM을 리포터 염료로 변형시키고 25mer 간격 위치의 티민(Thymine)을 internal dT로 변형하고 이부위에 BHQ1 퀀처를 부착한 EB_B_FIP_P2(서열번호 5)를 사용하였다. Anti-sense probe는 55℃로 설계된 EB_B_FIP_P2_Q2_55(서열번호 19), 60℃로 설계된 EB_B_FIP_P2_Q2_60(서열번호 20), 65℃로 설계된 EB_B_FIP_P2_Q2_65(서열번호 21), 70℃로 설계된 EB_B_FIP_P2_Q2_70(서열번호 22)를 사용하였다. 그리고, EB_B_RIP_P2(서열번호 8)의 IB-DFO에 상보적인 anti-sense probe를 60℃로 설계한 EB_B_RIP_P2_Q60(서열번호 23)을 사용하였다.
상기 IB-DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 등온 핵산 증폭 반응은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 10mM KCl, 8mM MgSO4, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween-20, 1.4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase(MCLAB, CA, USA), EB_B_F3와 EB_B_R3를 0.2 uM, EB_B_LP_F와 EB_B_LP_R은 0.4 uM을 사용하였으며, EB_B_FIP는 1.2 uM, EB_R_RIP는 1.6 uM을 혼합물에 첨가하였으며, 본 발명의 IB-DFO인 EB_B_FIP_P2는 0.4 uM과 Anti-sense probe 1.6 uM을 EB_B_FIP_P2_Q2_55, EB_B_FIP_P2_Q2_60, EB_B_FIP_P2_Q2_65, EB_B_FIP_P2_Q2_70을 각각 사용하여 혼합물 제조하였다. 그리고, IB-DFO를 EB_B_RIP_P2로 0.4 uM 대체하고 이에 대한 anti-sense probe인 EB_B_RIP_P2_Q_60을 1.6uM 혼합하였으며, IB-DFO를 EB_B_FIP_P2와 EB_B_RIP_P2를 0.4 uM씩 EB_B_FIP_P2_Q2_60과 EB_B_RIP_P2_Q_60을 1.6 uM 혼합하였다. Ebola virus의 Bundibugyo L segment (gb:FJ217161, 521bp)를 유전자 합성을 통해 제작하여 1x10^5, 1x10^4, 1x10^3 copies/reaction 농도의 plamid DNA를 사용하였다. 등온 핵산 증폭 반응에 대한 실시간 형광 검출을 위해 65℃에서 60분간 수행되었으며, 1분 단위로 AB7500(Applied Biosystems, CA, USA) 실시간 형광 측정장비를 사용하여 형광량을 측정하였다.
도 10은 Anti-sene probe를 온도별로 설계하여 IB-DFO와 함께 사용하여 LAMP 등온 핵산 증폭 실시간 형광 측정을 수행한 결과로 55℃에서 1x10^5 ~1x10^3 copies/reaction 까지의 검출 시간은 고농도부터 각각 13.4분, 15.3분, 18.4분으로 형광 검출 시간이 관찰되었다. 60℃는 각각 20.3분, 22.7분, 24.6분으로 형광 검출되었으며, 65℃는 각각 47.7분, 49.7분으로 검출되었고, 1x10^3은 검출되지 않았다. 70℃는 전체가 형광 검출되지 않았다. 형광량은 60℃Anti-sense probe에 비해 55℃에서 약 50% 정도였지만, 검출시간은 약 6 ~ 7분 빠르게 나타났다. 도 11과 같이 Rn vs Min(non-normalization) type 결과, 55℃Anti-sense probe의 background Rn이 60℃Anti-sense probe에 비해 2배 높게 나타났다. 이와 같이 Anti-sense probe의 설계 온도에 따라 background Rn 및 delta Rn을 조절할 수 있다.
도 12은 IB-DFO를 FIP 또는 RIP 또는 FIP와 RIP를 각각 사용하였으며, 이에 대한 60℃ Anti-sense probe를 포함하여 반응시킨 경우이며, FIP와 RIP를 각각 대체한 경우 형광량은 유사하게 나타났지만, RIP의 IB-DFO가 FIP의 IB-DFO 대비하여 약 10분 빠르게 나타났다.
[서열 목록]
서열번호 1:EB_B_F3
5'-GTGTGTTCAAGTACAGCATT-3'
서열번호 2:EB_B_R3
5'-ATAAGGGAGGATGATCAAGG-3'
서열번호 3:EB_B_FIP
5'-ACCTGGTGTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACATTATTTTGATAGCC-3'
서열번호 4:EB_B_RIP
5'- TACATTAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAATTCCCACAATAA GTCTT-3'
서열번호 5:EB_B_FIP_P2
5'-ACCTGG(internal dT-FAM)GTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACAT TATTT(internal dT-BHQ1)GATAGCC-3'
서열번호 6:EB_B_FIP_P2.5
5'-ACCTGGTGT(internal dT-FAM)AGATGTTTATCTGAGGCCAAACAT (internal dT-BHQ1)ATTTTGATAGCC-3'
서열번호 7:EB_B_FIP_P3
5'-ACCTGGTGTTAGA(internal dT-FAM)GTTTATCTGAGGCCAAACAT (internal dT-BHQ1)ATTTTGATAGCC-3'
서열번호 8:EB_B_RIP_P2
5'- TACA(internal dT-FAM)TAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAAT (internal dT-BHQ1)CCCACAATAA GTCTT-3'
서열번호 9:EB_R_F3
5'-GCCTCACAATGTTAATCTTAGC-3'
서열번호 10:EB_R_R3
5'-GATTGTCTCCCATGACCG-3'
서열번호 11:EB_R_FIP
5'-CCTCTATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCCTCCTGAA-3'
서열번호 12:EB_R_RIP
5'-GATTACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTAACTTAAAACCAGT-3'
서열번호 13:Res_LP
5'-GGTACGAACTCGGGC-3'
서열번호 14:Res_RLP
5'-TGTGCACAAATCTCCTTAGT-3'
서열번호 15:EB_R_FIP_P2
5'-CCTC(internal dT-FAM)ATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCC (internal dT-BHQ1)CCTGAA-3'
서열번호 16:EB_R_RIP_P2
5'-GAT(internal dT-FAM)ACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTA AC(internal dT-BHQ1)TAAAACCAGT-3'
서열번호 17:EB_B_LP_F
5'-ATTACACTATACCATGACCCTT-3'
서열번호 18:EB_B_LP_R
5'-CACTGCCTATGATTAAAGACT-3'
서열번호 19:EB_B_FIP_P2-Q2_55
5'-CCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
서열번호 20:EB_B_FIP_P2-Q2_60
5'-GGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
서열번호 21:EB_B_FIP_P2-Q2_65
5'-TGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
서열번호 22:EB_B_FIP_P2-Q2_70
5'-GGCTATCAAAATAATGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
서열번호 23:EB_B_RIP_P2-Q_60
5'-CGGAAATTGGTTCCTCTTA-BHQ1-3'
<110> SD Biosensor, INC. <120> AN ISOTHERMAL BASED-DUAL FUNCTIONAL OLIGONUCLEOTIDE INCLUDING REPORTER DYE, AND QUENCHER FOR ISOTHERMAL NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND MEASUREMENT METHODS USING SAME <130> HY151431 <150> KR 10-2015-0169857 <151> 2015-12-01 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 gtgtgttcaa gtacagcatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 ataagggagg atgatcaagg 20 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 acctggtgtt agatgtttat ctgaggccaa acattatttt gatagcc 47 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 tacattaaga ggaaccaatt tccgctgata gaattcccac aataagtctt 50 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (7) <223> n= Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (40) <223> n= Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 5 acctggngtt agatgtttat ctgaggccaa acattatttn gatagcc 47 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (10) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (35) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 6 acctggtgtn agatgtttat ctgaggccaa acatnatttt gatagcc 47 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (14) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (35) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 7 acctggtgtt agangtttat ctgaggccaa acatnatttt gatagcc 47 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (5) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (35) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 8 tacantaaga ggaaccaatt tccgctgata gaatncccac aataagtctt 50 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 gcctcacaat gttaatctta gc 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 gattgtctcc catgaccg 18 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 cctctatgcc tcctaagtgc caatcgagaa tatcctcctg aa 42 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 gattacaaca aaaactgtgg acgagctgat cgtaacttaa aaccagt 47 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 ggtacgaact cgggc 15 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 tgtgcacaaa tctccttagt 20 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (5) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (36) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 15 cctcnatgcc tcctaagtgc caatcgagaa tatccncctg aa 42 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> mutation <222> (4) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <220> <221> mutation <222> (37) <223> n=Amino-C6(or C2)-deoxythymine <400> 16 gatnacaaca aaaactgtgg acgagctgat cgtaacntaa aaccagt 47 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 attacactat accatgaccc tt 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 cactgcctat gattaaagac t 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 cctcagataa acatctaac 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 ggcctcagat aaacatctaa c 21 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 tgtttggcct cagataaaca tctaac 26 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 ggctatcaaa ataatgtttg gcctcagata aacatctaac 40 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 23 cggaaattgg ttcctctta 19

Claims (23)

  1. 타겟 유전자의 특정 서열에 대한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP)용 포워드 인너 프라이머 (Forward Inner Primer) 또는 리버스 인너 프라이머 (Reverse Inner Primer) 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 프라이머는 두개의 타겟 유전자 부위를 가지며, 상기 두 타겟 유전자 부위 중 5’ 말단 방향의 타겟 유전자에 대한 프라이머 서열 중 하나의 서열을 리포터 염료로 위치시키고, 3’ 말단 방향의 타겟 유전자에 대한 프라이머 서열 중 하나의 서열을 퀀처로 위치시키며, 해당 리포터 염료 또는 퀀처가 위치한 서열은 인터널(internal) dT 또는 인터널 (internal) dG, 인터널 (internal) dC, 인터널 (internal) dA, 인터널 (internal) dU, 인터널 (internal) dR로 변형되고, 상기 리포터 염료와 상기 퀀처는 서로 위치 교환이 가능하며, 서열 간격은 21머 (mer) ∼ 33머 (mer) 서열 간격 이내로 위치시키는 프라이머와 프로브 활성을 동시에 갖는 올리고뉴클레오타이드.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포워드 인터널 프로브와 리버스 인터널 프로브를 개별 또는 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 리포터 염료는 FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, TEXAS RED, CY3, 및 CY5 중 하나이거나, 450 ~ 685 nm의 발광 파장대인 염료인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 퀀처는 TAMRA, DABCYL, Black Hole Quencher 1, 또는 2이거나, 500 ~ 705 nm 흡광 파장대인 퀸처인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나에서 네 개의 버블 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥에서 단일 가닥으로 풀리는 풀림 온도가 30 ~ 70℃인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 5 내지 8, 및 서열번호 15 내지 16에 기재된 올리고뉴클레오타이드 중 하나인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온에서 실시간 핵산 증폭형광 검출을 위한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP) 또는 역전사(RT)-LAMP 반응을 수행하는 방법.
  10. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 등온 또는 두 가지 이상의 온도 조건에서 종결점(end-point) 핵산 증폭 형광 검출을 위한 루프 매개 등온 핵산 증폭 반응(LAMP) 또는 역전사(RT)-LAMP 반응을 수행하는 방법.
  11. 제 9항 및 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포워드 인터널 프로브와 리버스 인터널 프로브를 개별 또는 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항 및 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 등온 온도 조건은 50 ~ 75℃의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9항 및 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 DNA 및 cDNA 핵산을 대상으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9항 및 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 RNA 핵산을 대상으로 역전사 반응 후 특정 유전자를 원스텝 반응으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 또는 감수성 검체에 대한 특정 유전자를 개별 또는 동시 다중적으로 증폭하는 키트.
  16. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 등온 핵산 증폭 반응용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 18의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 등온 핵산 증폭 반응용 조성물.
  18. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 에볼라 바이러스(Ebola virus) 핵산 증폭용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 18의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 에볼라 바이러스(Ebola virus) 핵산 증폭용 조성물.
  20. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드와 안티-센스 프로브를 함께 사용하여 DNA, RNA, 또는 cDNA에 대한 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 안티-센스 프로브는 55 ~ 65℃ 이내에서 설계 및 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 안티-센스 프로브는 포워드와 리버스 위치에서 개별 또는 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 상기 안티-센스 프로브는 서열번호 19 내지 23에 기재된 서열 중 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.

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