CN103540660B - 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒 - Google Patents

基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN103540660B
CN103540660B CN201310469839.5A CN201310469839A CN103540660B CN 103540660 B CN103540660 B CN 103540660B CN 201310469839 A CN201310469839 A CN 201310469839A CN 103540660 B CN103540660 B CN 103540660B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
lamp
taqman probe
primer
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310469839.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103540660A (zh
Inventor
刘威
黄留玉
袁静
杨展
李环
崔茜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Original Assignee
Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Disease Control and Prevention of PLA filed Critical Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority to CN201310469839.5A priority Critical patent/CN103540660B/zh
Publication of CN103540660A publication Critical patent/CN103540660A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103540660B publication Critical patent/CN103540660B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明一种基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒，用于检测目的基因。本发明将TaqMan探针与LAMP技术相结合，从根本上解决了非特异扩增的问题，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到目的基因，为核酸检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测致病菌（如“超级细菌”等）等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其在目的基因（核酸）检测中的应用。
背景技术
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
TaqMan荧光探针PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团包括FAM、TET、VIC、HEX等。
2000年Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)，中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1LAMP试剂盒的研制。通过近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在lh内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30min均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5mg/mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
LAMP技术目前的检测方法主要为以下几种：一是普通电泳法，将LAMP扩增产物进行普通凝胶电泳，但此检测方法无特异性，因为只要发生了LAMP反应，电泳条带均一样。二是荧光染色法，染料主要包括：SYBR Green I、羟基萘酚蓝（Hydroxynaphtholblue，HNB）、钙黄绿素。但是，SYBR Green I染料只要扩增出核酸便显示阳性，无特异性；羟基萘酚蓝与钙黄绿素均是指示LAMP的副产物镁离子的变化，也无特异性。三是浊度法，此法主要是检测LAMP的副产物焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，只要发生LAMP反应溶液即变浑浊，此法也无特异性。
综合以上三种检测方法，均不能对扩增产物进行特异检测，均为间接检测，这也就带来了一个非常大的问题，如果LAMP发生了非特异性扩增，那么用这些检测方法获得的结果均是假阳性，因此，需要对LAMP技术进行改进，从根本上解决检测结果假阳性的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物和Taqman探针。
本发明所提供的LAMP引物，是首先从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引物。
如图1所示，所述LAMP保守靶序列包括以下几个部分：F1-F3和B1-B3为引物设计区，F1和B1之间为延伸区，引物设计区主要用于LAMP引物和Taqman探针的设计，延伸区也可用于Taqman探针的设计，但不是Taqman探针设计的优选区域。
如图2所示，所述LAMP引物包括一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP（FIP=F1c+F2）、一条反向内引物BIP（BIP=B1c+B2）。
本发明还提供一种用在线LAMP引物设计软件设计LAMP引物的方法，是先登录LAMP引物设计软件Primer Explorer V4的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，然后导入LAMP保守靶序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤：
1）单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件：普通文本格式（仅含序列）、FASTA格式和GenBank格式文件；
2）从下面三个选项中选择定参数设定条件（引物设计条件），基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45％，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60％，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态；
3）整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。
本发明还提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针，具体设计原则如下：
1）探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在F1和F3之间（将该探针命名为TF），或者B1和B3之间（将该探针命名为TB）；
2）探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)之间，以保证结合特异性；
3）检测探针的DNA折叠和二级结构；
4）Tm值在60-65℃之间，GC含量在40％-70％之间；
5）探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
6）整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
7）为确保探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计探针。
此外，本发明所提供的TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等，优选为FAM；所述荧光淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse等，优选为BHQ1。
本发明还提供了一种用上述LAMP引物、Taqman探针及环介导恒温扩增法检测待测样品中是否含有目的基因的方法，可包括以下步骤：
1）配制23μL LAMP反应液,其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mMdNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物及Taqman探针量为：40pmol FIP和BIP各，5pmol F3和B3，4pmol TF或者4pmol TB；
2）按常规方法提取待测样品中的核酸；
3）取2μL核酸提取液加入步骤1)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，混匀反应液；
4）置60-65℃（优选63℃）恒温55-65min（优选60min）进行LAMP扩增；
5）进行结果判读，方法为：曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
本发明的另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法（LAMP）检测试剂盒。
本发明所提供的用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法（LAMP）检测试剂盒，包含上述由一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP（FIP=F1c+F2）和一条反向内引物BIP（BIP=B1c+B2）组成的LAMP引物组合，以及Taqman探针TF或TB。
本发明的试剂盒还包含LAMP反应液，与LAMP引物和Taqman探针共同构成LAMP检测体系；23μL LAMP反应液中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA。
具体来讲，当待测目的基因为NDM-1基因时，首先从美国基因数据库GenBank检索获得NDM-1基因的核苷酸序列（GenBank号：FN396876），通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，
再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引物。
所述LAMP引物组合及序列如下：
正向外引物CJXJ1F3：5'-GCATAAGTCGCAATCCCCG-3'（序列表中序列2）；
反向外引物CJXJ1B3：5'-GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3'（序列表中序列3）；
正向内引物CJXJ1FIP：5'-CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3'（序列表中序列4）；
反向内引物CJXJ1BIP：5'-CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3'（序列表中序列5）。
所述Taqman探针序列如下：
FAM-TF：5’FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’（序列表中序列6）；
FAM-TB：5’FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’（序列表中序列7）。
本发明还提供了一种用上述LAMP引物、Taqman探针及环介导恒温扩增法检测待测样品中是否含有NDM-1基因的方法，可包括以下步骤：
1）配制23μL LAMP反应液，反应液中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量及Taqman探针量为：40pmolCJXJ1FIP和CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3和CJXJ1B3，4pmol FAM-TF或者4pmol FAM-TB；
2）按常规方法提取待测样品中的核酸；
3）取2μL核酸提取液加入步骤1)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，混匀反应液；
4）置60-65℃恒温60min进行LAMP扩增；
5）进行结果判读，方法为：曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
本发明提供了一种用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法（LAMP）检测方法及其专用引物、Taqman探针与试剂盒。本发明具有以下优点：
1)高特异性：4条引物对目的基因靶序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，并增加了一条探针，可以对扩增产物直接检测；
2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍，与普通LAMP检测方法的灵敏度相当；
3)解决了因LAMP非特异扩增而造成的假阳性问题；
4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入荧光定量仪器中60-65℃保持60分钟就可以判断结果；
5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL。
综上所述，本发明将TaqMan探针与LAMP技术相结合，从根本上解决了非特异扩增的问题，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到目的基因，为核酸检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测致病菌（如“超级细菌”等）等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为LAMP靶基因的组成示意图
图2为LAMP引物与靶基因的位置关系
图3为Taqman探针的组成示意图
图4为在反应体系中添加FAM-TF探针或FAM-TB探针，以确定最佳Taqman探针的检测结果（NDM-1基因）
图5为在反应体系中添加不同浓度（0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM）的Taqman探针FAM-TB，以确定最佳Taqman探针反应浓度的检测结果（NDM-1基因）
图6为在反应体系中添加相同浓度（4μM）的Taqman探针FAM-TB，平行检测6次，以确定结果重现性的检测结果（NDM-1基因）
具体实施方式
（一）本发明将Taqman探针应用于LAMP的技术原理
1.LAMP靶基因的组成
如图1所示，LAMP靶基因被人为分为以下几个部分：F1-F3和B1-B3为引物设计区，F1和B1之间为延伸区，引物设计区主要用于LAMP引物和Taqman探针的设计，延伸区也可用于Taqman探针的设计，但不是Taqman探针设计的优选区域。
2.LAMP引物
如图2所示，LAMP引物主要由FIP、BIP、F3、B3组成，其中FIP=F1c+F2,BIP=B1c+B2。
3.LAMP技术的原理
60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。
第一阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。迅速以3'末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第二阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
4.Taqman探针
如图3所示，TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团（R）连接在探针的5’末端，而淬灭剂（Q）则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团是FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等，常见的淬灭基团有TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。
（二）LAMP引物的设计
用在线LAMP引物设计软件可进行LAMP引物的设计，先登录LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，然后导入LAMP保守靶序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤：
1）单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件：普通文本格式（仅含序列）、FASTA格式和GenBank格式文件；
2）从下面三个选项中选择定参数设定条件（引物设计条件），基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45％，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60％，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态；
3）整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。
（三）Taqman探针的设计
用于LAMP的Taqman探针的设计和用于PCR的Taqman探针设计基本一致，略有不同，具体设计原则如下：
1）探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在F1和F3之间（将该探针命名为TF），或者B1和B3之间（将该探针命名为TB）；
2）探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)之间，以保证结合特异性；
3）检测探针的DNA折叠和二级结构；
4）Tm值在60-65℃之间，GC含量在40％-70％之间；
5）探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
6）整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
7）为确保探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，需重新设计探针。
此外，本发明所提供的TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等，优选为FAM；所述荧光淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse等，优选为BHQ1。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物和TaqMan探针均由上海生工生物公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、用基于Taqman探针的LAMP法检测NDM-1基因
以NDM-1基因为例详细说明本发明基于Taqman探针的LAMP法，具体检测方法包括以下步骤：
一、对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物设计
从美国基因数据库检索获得NDM-1基因序列（GenBank号：FN396876.1），通过BLAST软件进行同源性分析，获得NDM-1基因的特异性保守靶序列（序列表中序列1），再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）设计用于对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物，引物序列如下：
正向外引物CJXJ1F3：5'-GCATAAGTCGCAATCCCCG-3'（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第390-408位碱基的特异区域设计，序列表中序列2）；
反向外引物CJXJ1B3：5'-GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3'（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第564-583位碱基的特异区域设计，序列表中序列3）；
正向内引物CJXJ1FIP：5'-CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3'（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第411-426位碱基的特异区域与NDM-1基因靶序列的自5’端第451-469位碱基的特异区域设计，序列表中序列4）；
反向内引物CJXJ1BIP：5'-CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3'（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第470-488位碱基的特异区域与NDM-1基因靶序列的自5’端第531-548位碱基的特异区域设计，序列表中序列5）。
以上4条引物的组合为本发明用于对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物。
二、对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的Taqman探针设计
根据前述（三）的设计原则得到的Taqman探针序列如下：
FAM-TF：5’FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第431-449位碱基的特异区域设计，序列表中序列6）；
FAM-TB：5’FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’（针对NDM-1基因靶序列的自5’端第499-516位碱基的特异区域设计，序列表中序列7）。
三、建立本发明NDM-1基因的基于Taqman探针的LAMP检测方法
用步骤一获得的用于对NDM-1基因进行LAMP检测的四条引物和步骤二获得的两条Taqman探针对含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌（来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心）进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：
1、用不同的Taqman探针进行检测
在相同反应条件（置63℃恒温60min）下，在反应体系中添加FAM-TF探针或FAM-TB探针，以确定最佳Taqman探针，包括以下步骤：
1）以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA（用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸）为模板，在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针的引导下进行LAMP扩增，其中，25uLLAMP反应体系内物质浓度为：含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2μL，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量为：40pmol CJXJ1FIP和CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3和CJXJ1B3，4pmol FAM-TF或者4pmolFAM-TB；反应条件为置于63℃荧光定量PCR仪60min。
2）用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图4（横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光积累量）所示，可以看出两条探针的曲线均上升，表明Taqman探针可以应用到LAMP之中，所设计的两个探针均有效。
2、用不同浓度的Taqman探针FAM-TB进行检测
在相同反应条件（置63℃恒温60min）下，在反应体系中添加不同引物量（0.5pmol、1pmol、2pmol、3pmol、4pmol、6pmol、8pmol、10pmol、12pmol）的Taqman探针FAM-TB，以确定最佳Taqman探针的反应浓度，包括以下步骤：
1）以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA（用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸）为模板，在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针FAM-TB的引导下进行LAMP扩增，其中，25uL LAMP反应体系内物质浓度为：含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2μL，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量为：40pmol CJXJ1FIP和CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3和CJXJ1B3，不同浓度（0.5pmol、1pmol、2pmol、3pmol、4pmol、6pmol、8pmol、10pmol、12pmol）的Taqman探针FAM-TB；反应条件为置63℃恒温水浴锅中60min。
2）用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图5（横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光积累量）所示，可以看出当添加探针量为4pmol时，荧光上升的曲线最高，表明4pmol的探针量为最佳浓度。
3、同一Taqman探针（FAM-TB）及相同添加量（4pmol）的结果重现性（6次）
在相同反应条件（置63℃恒温60min）下，在反应体系中添加相同量（4pmol）的Taqman探针FAM-TB，平行检测6次，以确定结果的重现性，包括以下步骤：
1）以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA（用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸）为模板，在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针FAM-TB的引导下进行LAMP扩增，其中，25uL LAMP反应体系内物质浓度为：含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2μL，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量为：40pmol CJXJ1FIP和CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3和CJXJ1B3，4pmol Taqman探针FAM-TB；反应条件为置63℃恒温水浴锅中60min。
2）用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图6（横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光累积量）所示，可以看出同一探针浓度下，曲线上升时间和高度基本一致，表明Taqman探针应用到LAMP具有很好的稳定性和重现性。
实施例3、基于Taqman探针的LAMP检测试剂盒
将以下物质浓度的反应液：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱（betaine），8mM MgSO4L，1.4mM dNTP each，8U BstDNA聚合酶，以及作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系（双蒸水）共同包装，得到基于Taqman探针的LAMP检测的试剂盒。

Claims (4)

1.一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针，其设计原则如下：
1)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在F1和F3之间，或者B1和B3之间，其中，在位于F1和F3之间时，将探针命名为TF，在位于B1和B3之间将探针命名为TB；
2)探针长度在15-45bp之间；
3)检测探针的DNA折叠和二级结构；
4)Tm值在60-65℃之间，GC含量在40％-70％之间；
5)探针的5’端避免使用G鸟嘌呤；
6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量；
7)将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，需重新设计探针
其中，所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的专用Taqman探针，其特征在于：所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5；所述荧光淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse。
3.根据权利要求2所述的专用Taqman探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM。
4.根据权利要求2或3所述的专用Taqman探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团为BHQ1。
CN201310469839.5A 2013-10-10 2013-10-10 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒 Active CN103540660B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310469839.5A CN103540660B (zh) 2013-10-10 2013-10-10 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310469839.5A CN103540660B (zh) 2013-10-10 2013-10-10 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103540660A CN103540660A (zh) 2014-01-29
CN103540660B true CN103540660B (zh) 2015-10-28

Family

ID=49964508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310469839.5A Active CN103540660B (zh) 2013-10-10 2013-10-10 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103540660B (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232622B (zh) * 2014-09-24 2016-09-14 中国人民解放军疾病预防控制所 一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用
CN104745694A (zh) * 2015-03-17 2015-07-01 苏州华麦生物科技有限公司 一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法
CN104914045B (zh) * 2015-05-29 2017-09-26 重庆大学 便携式致病菌快速检测系统和装置
CN105296643A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 浙江省疾病预防控制中心 一种鸭肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN105296642A (zh) * 2015-11-20 2016-02-03 浙江省疾病预防控制中心 一种猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
KR101875662B1 (ko) * 2015-12-01 2018-08-02 에스디 바이오센서 주식회사 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법
CN105400875B (zh) * 2015-12-02 2018-12-21 上海市计量测试技术研究院 一套用于细菌耐药基因ndm-1检测的多核苷酸、方法和试剂盒
CN105368951B (zh) * 2015-12-04 2019-04-23 中国人民解放军疾病预防控制所 用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tet M）的LAMP试剂盒及其专用引物
CN111684077A (zh) * 2018-02-06 2020-09-18 简·探针公司 远红染料探针调配物
CN108796131B (zh) * 2018-06-29 2020-10-20 广西壮族自治区兽医研究所 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN109750091B (zh) * 2019-03-13 2023-02-03 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
CN111893210A (zh) * 2019-05-06 2020-11-06 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种非洲猪瘟病毒的LAMP-TaqMan快速检测试剂盒及应用
CN110305988A (zh) * 2019-08-15 2019-10-08 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒
CN110643724A (zh) * 2019-10-10 2020-01-03 首都儿科研究所 Raa荧光法检测ndm的引物、探针、试剂盒和检测方法
WO2021095798A1 (ja) * 2019-11-15 2021-05-20 公立大学法人横浜市立大学 未分化マーカー遺伝子高感度検出法
CN113201584B (zh) * 2021-06-09 2022-11-04 湖南融健生物科技有限公司 多重目标核酸的检测方法、试剂盒以及用途
CN113981149A (zh) * 2021-11-23 2022-01-28 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种猪δ冠状病毒检测引物组和探针、试剂盒及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101768641A (zh) * 2010-01-19 2010-07-07 宁波大学 鳗利斯顿氏菌的lamp-lfd检测方法
CN101906473A (zh) * 2010-07-22 2010-12-08 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测转epsps基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法
CN102712944A (zh) * 2009-11-05 2012-10-03 贝克顿·迪金森公司 用于均质、实时检测lamp产物的序列特异性方法
CN102936623A (zh) * 2012-09-28 2013-02-20 中国人民解放军疾病预防控制所 用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示其反应结果的方法
CN103069009A (zh) * 2010-06-22 2013-04-24 夏威夷大学 环介导等温扩增（lamp）的序列特异性实时监测

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2660248T3 (es) * 2012-02-20 2018-03-21 Speedx Pty Ltd Detección de ácidos nucleicos

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102712944A (zh) * 2009-11-05 2012-10-03 贝克顿·迪金森公司 用于均质、实时检测lamp产物的序列特异性方法
CN101768641A (zh) * 2010-01-19 2010-07-07 宁波大学 鳗利斯顿氏菌的lamp-lfd检测方法
CN103069009A (zh) * 2010-06-22 2013-04-24 夏威夷大学 环介导等温扩增（lamp）的序列特异性实时监测
CN101906473A (zh) * 2010-07-22 2010-12-08 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测转epsps基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法
CN102936623A (zh) * 2012-09-28 2013-02-20 中国人民解放军疾病预防控制所 用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示其反应结果的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立;吴兴海等;《食品安全质量检测学报》;20111231;第2卷(第3期);141-145 *
Rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick target to rpoS gene;Surasilp T,et al;《Molecular and cellular probes》;20110415;第25卷(第4期);158-163 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103540660A (zh) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103540660B (zh) 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒
US10544452B2 (en) Method and use of nucleic acid isothermal amplification via a polymerase spiral reaction
US7972786B2 (en) Detection and analysis of influenza virus
CN103014148B (zh) 一种rna的等温检测方法
EP1791982B1 (en) TWO-COLOR REAL-TIME/END-POINT QUANTITATION OF MICRORNAS (MIRNAs)
CN104975013A (zh) 一种加速聚合酶螺旋反应的方法及其应用
CN101506384A (zh) 专一性寡核苷酸和其在核酸扩增与检测中的用途
US11414713B2 (en) Methods of screening for onychomycotic fungi
Ding et al. Fluorogenic bidirectional displacement probe-based real-time isothermal DNA amplification and specific visual detection of products
Zhao et al. Universal Exponential Amplification Confers Multilocus Detection of Mutation-Prone Virus
CN104087655B (zh) 基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法
Itou et al. Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification system for the detection of rabies virus
CN107937617A (zh) 检测塞内加谷病毒的rt‑lamp引物组合物及其试剂盒和方法
KR102435116B1 (ko) CRISPR-Cas 시스템과 멀티플렉스 LAMP 프라이머 세트를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출 방법
Shirshikov et al. Loop-mediated isothermal amplification: from theory to practice
CN105671191A (zh) 一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂
CN101871015B (zh) 基于环介导等温扩增技术的鹅细小病毒检测试剂盒及方法
JP6986015B2 (ja) 断片化核酸を連結するための方法及びキット
CN108531566A (zh) 基于复合编码探针杂交的dna检测方法及复合编码探针
US20240141413A1 (en) Amplicon-free crispr-based one-pot detection with loop-mediated isothermal amplification for point-of-care diagnosis of viral pathogens
EP4053293A1 (en) Protected isothermal nucleic acid amplification (pina) methods for point-of-need diagnosis of emerging infectious diseases
CN111944925A (zh) 用于检测甲型h1n1流感病毒的引物组合及试剂盒
WO2021183897A1 (en) Methods and kits for the detection of mers-cov
CN117286230A (zh) 一种实时单一或多重的pcr核酸扩增检测方法
WO2024015999A1 (en) Methods, systems and compositions for detection of multiple analytes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant