CN117286230A - 一种实时单一或多重的pcr核酸扩增检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实时单一或多重的PCR核酸扩增检测方法。在通用PCR核酸扩增体系基础上，在其一条或两条进行荧光基团和猝灭基团的标记；荧光基团和猝灭基团标记在所选引物除3’端的任何位置。利用所述标记引物进行PCR核酸扩增，在核酸扩增过程中，对荧光基团所发出的荧光进行实时检测，根据所得到的荧光情况以及曲线对核酸扩增情况进行实时判断；亦可利用这一标记方式，对扩增后的产物在不同的荧光通道进行熔解曲线分析。

Description

一种实时单一或多重的PCR核酸扩增检测方法

技术领域

本发明涉及了一种实时核酸扩增检测方法，尤其是涉及了一种实时、单一或多重的特异性聚合酶链式反应(PCR)核酸扩增引物及其扩增产物检测方法，可应用于基因检测、医学诊断、食品安全、分析化学等领域。

背景技术

核酸扩增检测方法通过对目标核酸分子进行扩增达到检测的目的，具有灵敏度高的特点，因此被广泛应用于食品安全、疾病诊断、环境监测等领域。常见的核酸扩增检测方法有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和恒温扩增反应。PCR反应通过变性-退火-延伸三个过程来完成核酸扩增，需要反复的升降温过程。恒温扩增反应在恒定的温度就可以完成扩增反应，对温度依赖性低，常见的恒温扩增有环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)等。但是恒温扩增反应需要设计多条引物，或使用多种蛋白酶，这使得反应体系更加复杂。PCR引物设计简单，反应组分少，基于PCR的扩增检测方法仍然是当前分子检测的主流方法。

PCR扩增后的产物需要进行检测来判断是否为目标产物。常见的检测方法可分为终点检测法和实时检测法。终点检测法在扩增结束后对扩增产物进行检测，凝胶电泳法是常用的终点检测法，通过电泳后核酸产物的长度来判断产物是否为目标产物，但这种检测方法是非特异性的，且在核酸扩增后需要开盖，取出扩增后产物进行检测，此过程易形成扩增子气溶胶污染。实时检测法通过在核酸扩增体系中加入荧光染料(如SYBR Green，SYTO9，Eva Green等)或者探针，使得扩增信号可以被实时监测。基于荧光染料的PCR检测方法特异性较差，且难以实现多重检测。Taqman探针是最常用于实时PCR检测的探针，位于PCR反应的两条引物之间，通常长18-24个碱基，Taqman探针的5’端和3’端分别修饰荧光基团和猝灭基团。检测体系中无目标核酸分子时，荧光基团和猝灭基团距离较近，荧光信号被猝灭；当体系中存在目标核酸分子，PCR反应被触发，在进行PCR反应的过程中，Taqman探针可复性杂交到PCR产物上，Taq酶在DNA链延伸过程中利用5’到3’端的外切酶活性将和模板结合的Taqman探针水解，使荧光基团和猝灭基团分开，从而产生荧光信号。在Taqman探针上修饰不同发射波长的荧光基团，可以实现多重检测。但基于Taqman探针的PCR检测方法需要在反应体系中引入一条新的探针序列，这增加了反应的复杂性；Taqman探针与目标序列结合区域的Tm值(熔解温度，temperature of melting，Tm)一般要比引物的Tm值高5-8℃；Taqman探针的荧光基团和猝灭基团修饰在Taqman探针序列的两端，G碱基一定程度上对荧光有猝灭作用，所以设计Taqman探针时要尽量避免5’端为G碱基。

同时，由于Taqman探针在反应后被水解，因此无法利用其在扩增后进行熔解曲线的分析。

综上，基于Taqman探针的PCR法进行实时多重检测仍存在一定的局限性。因此，急需发展一种设计简单，通用性强，快速，实时的多重PCR扩增检测方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种设计简便的实时PCR扩增检测方法，可实现单一或者多重实时扩增检测。

本发明技术方案和情况是：

方法首先在通用PCR扩增体系/方法基础上，以PCR扩增体系的一条或两条引物作为标记引物，在标记引物上进行荧光基团和猝灭基团的标记/修饰，且荧光基团和猝灭基团标记/修饰在所述标记引物除3’端的任何位置，不影响PCR引物3’端延伸即可；

然后利用所述标记引物进行PCR核酸扩增；

在核酸扩增过程中，对荧光基团所发出的荧光进行实时检测，根据所得到的荧光情况以及曲线对核酸扩增情况进行实时判断。

所述PCR扩增体系/方法中不含有任何能对含有荧光基团和猝灭基团标记的引物本身及其生成的双链进行切割、断裂等的功能酶。

所述标记引物具有5’端延长段，所述荧光基团和猝灭基团分别或全部标记在所述5’端延长段。

所述的5’端延长段是指5’端的序列按照常规设计进行延长设计而形成的一段。

所述5’端延长段选用包含有胸腺嘧啶(T)碱基的合适长度的任意序列，并且不要求延长段本身或延长段和所连接引物形成茎环等二级结构。

具体而言，所述荧光基团和猝灭基团的标记/修饰可以是以下几种：

所述荧光基团和猝灭基团同时修饰在标记引物的中间；

或者荧光基团和猝灭基团中的任意其中一个修饰在标记引物的中间、另一个修饰在标记引物的5’端；

或者荧光基团和猝灭基团中的任意其中一个修饰在标记引物的5’端延长段、另一个修饰在标记引物的中间、5’端或者5’端延长段。

在进行PCR核酸扩增时，当存在目标核酸片段时，标记引物和其互补片段结合，并在仅核酸扩增酶作用下，沿目标核酸片段延伸形成稳定双链。

在进行PCR核酸扩增时，当存在多个目标核酸片段时，对不同目标核酸片段的扩增引物标记/修饰上不同发射波长的荧光基团，实现实时多重核酸检测。

针对不同目标核酸片段进行多重PCR核酸扩增后，采集不同荧光通道的熔解曲线，得到不同目标核酸片段的熔解曲线特征峰，进而实现多种目标核酸片段的多重核酸检测。

由此，本发明提供一种可实现单一或者多重实时PCR核酸扩增检测体系，在PCR引物上修饰荧光基团和及相应的猝灭基团。在无扩增反应时，该引物为单链DNA，“蜷缩”状态的单链DNA使得荧光基团和猝灭基团在空间上较近，荧光信号被猝灭；PCR反应高温变性阶段，目标核酸打开双链结构；退火阶段，修饰有荧光基团和猝灭基团的引物与目标核酸结合；延伸阶段，修饰有荧光基团和猝灭基团的引物沿着3’端延伸，形成双链。由于DNA双链的刚性比单链大，修饰荧光基团和猝灭基团的引物掺入双链中后荧光基团和猝灭基团远离，使得荧光猝灭效应减弱，体系中产生增强的荧光信号(图1)。进一步的，在扩增结束后，也可以利用生成的含有荧光基团的产物，进行熔解曲线的分析，进一步提高检测的可靠性，分辨率。

具体优选地，本发明的PCR核酸扩增体系包括：

1)修饰荧光基团和猝灭基团的引物：该引物可为PCR引物中的一条或两条。荧光基团和猝灭基团可修饰在引物的5’端和中间区域。若中间区域没有碱基T，可将引物5’端进行延长，掺入T碱基；

若所选PCR引物上的碱基序列对荧光基团的信号有影响，也可将引物5’端进行延长，并将荧光基团和猝灭基团中的一个或全部都标记在延长段，从而避免影响。

引物的5’端延长段选用包含有胸腺嘧啶(T)碱基的合适长度的任意序列，并且不要求延长段本身或延长段和所连接引物形成茎环等二级结构。

2)其他引物：PCR扩增体系中的其他引物，若不修饰，则与普通PCR反应引物保持一致即可。

在实时多重PCR扩增检测中也可以根据实际需要对各组引物浓度的反应浓度进行调整。这里充分体现出了本发明的优势，也即除了在PCR引物上进行荧光及猝灭基团的标记外，其他和普通的PCR扩增反应完全一样。也不需要增加额外的酶，不会对已确定的PCR反应体系产生任何影响。

3)聚合酶：耐高温的Taq聚合酶，例如Taq HS聚合酶等。本发明所使用的聚合酶无需具有5’端到3’端的外切酶活性均可。

4)缓冲液：根据体系中的聚合酶类型选择合适的缓冲液。

5)脱氧核苷酸：可以选用dNTPs，也可以选择dNTPs/dUTPs。

6)扩增增强剂：可在扩增体系中加入扩增增强剂，如甜菜碱、海藻糖等。

7)靶标分子：可以为RNA，也可以为DNA。若目标为RNA分子，加入逆转录酶即可。

在本发明中，当体系中存在靶标分子时，标记有荧光基团和猝灭基团的引物和目标序列结合后，由于其3’端没有修饰任何基团，所以将从其3’端开始延伸，形成双链DNA。这样生成的长双链，也有助于带有荧光标记引物和目标链结合，避免脱落。相比于单链，双链DNA序列有更大的刚性从而使得修饰的荧光基团和猝灭基团相互远离，荧光信号增强。

若进行多重PCR扩增检测时，通过在不同靶标的引物上修饰不同的荧光基团，就可以实现单管内的多重检测，而不需要再设计Taqman探针，从而简化多重荧光PCR检测中的引物设计难度。可根据需要，调整体系中的不同靶标引物组浓度之间的浓度。

这样，无需常用的荧光染料，就可以实现扩增过程的实时荧光检测。

基于Taqman探针的PCR检测方法将带有荧光基团和猝灭基团的序列切割，从而使得两者完全分离的情况，本发明中由于单链变成双链所带来的荧光信号增强要弱一些，但是，采用目前常见的荧光扩增仪，如伯乐实时荧光定量CFXConnect PCR仪、赛默飞实时荧光定量QuantStudio3 PCR仪等，扩增过程中由于形成双链所带来的实时荧光信号的增强是清晰可见的。

在本发明中，荧光信号的增强是由于和目标序列结合延伸形成稳定的双链。在高温条件下，当温度高于双链DNA的熔点时，双链被打开，荧光信号将减弱。因此，本发明的标记及检测技术，也可以结合熔解曲线分析。利用Taqman探针的PCR方法，由于扩增过程中，探针被水解，扩增产物上并没有荧光标记，无法进行熔点分析。

相比于现在的技术，本发明具有如下优势：

1)实用性强。本发明的PCR扩增体系不需要引入新的探针，且引物不需要特殊设计，只需要在现有引物的基础上，将其修饰上荧光基团和猝灭基团即可。不需要对引物及反应体系进行额外的优化。

荧光基团和猝灭基团可修饰在PCR引物的5’端和除3’端外的中间区域。

若所选PCR引物上的碱基序列对荧光基团的信号有影响，可将引物5’端进行延长，并将荧光基团和猝灭基团中的一个或全部都标记在PCR引物的延长段，避免影响。

若所选PCR引物中间区域没有胸腺嘧啶T，也可将引物5’端进行延长，引入T碱基，进行标记。

PCR引物的5’端延长段选用包含有胸腺嘧啶(T)碱基的合适长度的任意序列，并且不要求延长段本身或延长段和所连接引物形成茎环等二级结构。

2)操作简便：本发明所提出的扩增检测方法的检测步骤与普通PCR扩增反应步骤一样，无需额外的操作步骤，节约时间。

3)节约成本：本发明所提出的PCR扩增检测方法无需引入额外的探针，也不需要额外酶制剂的参与。

4)特异性强：本发明所提出的PCR扩增检测方法在进行多重检测时，可在不同目标物PCR引物上修饰不同荧光基团，通过不同荧光通道的熔解曲线的特征峰判断特定产物。

附图说明

图1是本发明提出的实时PCR扩增检测原理图；

图2是本发明提出的单重实时PCR扩增检测沙门氏菌DNA片段1。0copies/μL(a)，2copies/μL(b)，20copies/μL(c)，200copies/μL(d)；

图3是本发明提出的单重实时PCR扩增检测沙门氏菌DNA片段1后采集的熔解曲线。0copies/μL(a)，2copies/μL(b)，20copies/μL(c)，200copies/μL(d)；

图4是本发明提出的单重实时PCR扩增检测沙门氏菌DNA片段2。0copies/μL(a)，2copies/μL(b)，20copies/μL(c)，200copies/μL(d)；

图5是本发明提出的单重实时PCR扩增检测沙门氏菌DNA片段2后采集的熔解曲线。0copies/μL(a)，2copies/μL(b)，20copies/μL(c)，200copies/μL(d)；

图6是本发明提出的实时PCR方法同时扩增检测20copies/μL沙门氏菌DNA的片段1和片段2。FAM通道检测信号(a)，HEX通道检测信号(b)；

图7是本发明提出的实时PCR方法同时扩增检测20copies/μL沙门氏菌DNA的片段1和片段2后采集的熔解曲线。FAM通道检测信号(a)，HEX通道检测信号(b)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图来对本发明做进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，并不用来限定本发明的实施范围。

本发明方案下的PCR扩增检测过程如图1所示，具体介绍如下：在正常设计的PCR体系中，对其中一条引物进行荧光标记。在图中，荧光基团F标记在引物的5’端，而相应的猝灭基团标记在引物中间。在本图中，只标记了一条引物，实际中可以根据需要求对另一条引物标记相同或不同的荧光基团及猝灭基团。

标记引物后，进行正常的PCR扩增，经过高温变性后，在退火阶段，引物和目标核酸片段结合，形成双链。相比于单链，双链刚性强，因此增大了荧光集团和猝灭基团之间的距离，荧光信号增强。后续，在延伸过程中，引物不断延伸，和目标链形成更为稳定的双链，保持荧光信号。

在接下来的扩增循环中，带有荧光基团的片段会充当后续扩增的模板，形成新的双链，从而是的荧光信号不断增强，这样，通过检测这一荧光信号，就可以实现PCR扩增的检测。

本发明的实施例如下：

实施例1

本实施例提供一种实时单重PCR扩增检测方法，在PCR的一条引物上修饰荧光基团和猝灭基团(FQ-primer F1)，引物及目标片段具体信息如表1所示。以提取的沙门氏菌Salmonella typhimurium DNA为检测对象，对其片段1进行扩增检测。该PCR扩增体系包含：0.4μM FQ-primer F1,0.4μM primer R1，1×ExTaq buffer(Mg²⁺Plus)，0.8mM dNTPs,0.75UEx Taq HS DNA聚合酶,靶标DNA。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃10s,60℃60s,40cycles。利用伯乐实时荧光定量CFX Connect PCR仪实时采集FAM通道的荧光。检测结果如图2所示，该反应能检测2copies/μL的目标DNA，0copies/μL的样本无扩增曲线，说明该反应无非特异性扩增。相比基于Taqman探针的PCR方法，本发明提出的方法更加简便，不需要再额外引入一条探针。

此外，对PCR扩增后的样本进行熔解曲线分析，结果如图3所示，阳性样本熔解曲线峰值在81℃左右，这提示我们可根据特征熔解曲线来判定扩增产物，而基于Taqman探针的PCR方法在PCR扩增过程中Taqman探针被割断，无法采集熔解曲线。

表1沙门氏菌片段1的PCR扩增引物序列信息

实施例2

本实施例提供一种实时单重PCR扩增检测方法，将PCR的一条引物5’端进行延长，在延长的引物上修饰荧光基团和猝灭基团(FQ-primer F2)，引物及目标片段具体信息如表2所示。以提取的沙门氏菌Salmonella typhimurium DNA为检测对象，对其片段2进行扩增检测。该PCR扩增体系包含：0.4μM FQ-primerF2,0.4μM primer R2，1×Ex Taq buffer(Mg²⁺Plus)，0.8mM dNTPs,0.75U Ex TaqHS DNA聚合酶,靶标DNA。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃10s,60℃60s,40cycles。利用伯乐实时荧光定量CFX Connect PCR仪实时采集HEX通道的荧光。检测结果如图4所示，该反应能检测低至2copies/μL的目标DNA，0copies/μL的样本无扩增曲线，说明该反应无非特异性扩增。相比基于Taqman探针的PCR方法，本发明提出的方法更加简便，不需要再额外引入一条探针。此外，对PCR扩增后的样本采集熔解曲线，结果如图5所示，阳性样本熔解曲线峰值在79℃左右，这提示我们可根据特征熔解曲线来判定扩增产物，而基于Taqman探针的PCR方法在PCR扩增过程中Taqman探针被割断，无法采集熔解曲线。

表2沙门氏菌片段2的PCR扩增引物序列信息

实施例3

本实施例提供一种实时双重PCR扩增检测方法，以提取的沙门氏菌Salmonellatyphimurium DNA为检测对象，同时扩增检测片段1和片段2，引物及目标片段具体信息如表1和表2所示。该双重PCR扩增体系包含：0.2μMFQ-primer F1,0.2μM primer R1，0.2μM FQ-primer F2,0.2μM primer R2，1×ExTaq buffer(Mg²⁺Plus)，0.8mM dNTPs,0.75U Ex TaqHS DNA聚合酶,靶标DNA。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃10s,60℃60s,40cycles。利用伯乐实时荧光定量CFX Connect PCR仪实时采集FAM和HEX通道的荧光。在该扩增体系中加入20copies/μL沙门氏菌，检测结果如图6所示，FAM通道和HEX通道均能检测到实时扩增曲线。对双重PCR扩增后样本采集熔解曲线，结果如图7所示，FAM通道和HEX通道的熔解曲线峰值分别为81℃和79℃左右。与单重PCR扩增检测时熔解曲线峰的位置一致。在PCR双重扩增时，两扩增产物熔解曲线的峰值虽然接近，但是可以通过不同的荧光通道信号将其区分开，这也说明了本发明提出的PCR扩增检测方法的优势，即可通过修饰不同的荧光通道来区分熔解曲线特征峰。

本发明涉及的基因序列如下：

SEQ ID No.1；

名称：扩增片段1

生物体来源：Salmonella typhimurium

CCCGAACGTGGCGATAATTTCACCGGCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGTACTGATCGATAATGCCAGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAACGTTG

SEQ ID No.2；

名称：FQ-primer F1引物

生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct

CAACGTTTCCTGCGGTACTGT(5’端修饰FAM，中间加粗T碱基修饰BHQ1)

SEQ ID No.3；

名称：primer R1引物

生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct

CCCGAACGTGGCGATAATT

SEQ ID No.4；

名称：扩增片段2

生物体来源：Salmonella typhimurium

GGCCTTCAAATCGGCATCAATACTCATCTGTTTACCGGGCATACCATCCAGAGAAAATCGGGCCG

SEQ ID No.5；

名称：FQ-primer F2引物

生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/synthetic construct

TGCAATGATATGGCCTTCAAATCGGCATCAAT(5’端修饰HEX，中间加粗T碱基修饰BHQ1，下划线部分为延长区域)

SEQ ID No.6；

名称：primer R2引物

生物体来源：人工序列(Artificial Sequence)/syntheticconstructCGGCCCGATTTTCTCTGG。

Claims (7)

1.一种实时荧光PCR核酸扩增检测方法，其特征如下：

首先在PCR扩增体系基础上，以一条或两条引物作为标记引物，在标记引物上进行荧光基团和猝灭基团的标记/修饰，且荧光基团和猝灭基团标记/修饰在所述标记引物除3’端的任何位置；

然后利用所述标记引物进行核酸扩增；

在核酸扩增过程中，对荧光基团所发出的荧光进行实时检测，根据所得到的荧光情况对核酸扩增情况进行实时判断。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于：

所述PCR扩增体系中不含有任何能对含有荧光基团和猝灭基团标记的引物本身及其生成的双链进行切割、断裂等的功能酶。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于：

所述标记引物具有5’端延长段，所述荧光基团和猝灭基团分别或全部标记在所述5’端延长段。

4.根据权利要求3所述的核酸扩增方法，其特征在于：

所述5’端延长段选用包含有胸腺嘧啶(T)碱基的任意序列，并且不要求延长段本身或延长段和所连接引物形成茎环等二级结构。

5.根据权利要求1-3任一所述的核酸扩增方法，其特征在于：

在进行核酸扩增时，当存在目标核酸片段时，标记引物和其互补片段结合，并在核酸扩增酶作用下，沿目标核酸片段延伸形成稳定双链。

6.根据权利要求1-3任一所述的核酸扩增方法，其特征在于：

在进行核酸扩增时，当存在多个目标核酸片段时，对不同目标核酸片段的扩增引物标记/修饰上不同发射波长的荧光基团，实现实时多重核酸检测。

7.根据权利要求6所述的核酸扩增方法，其特征在于：

针对不同目标核酸片段进行多重PCR核酸扩增后，采集不同荧光通道的熔解曲线，得到不同目标核酸片段的熔解曲线特征峰，进而实现多种目标核酸片段的多重核酸检测。