ES2660248T3 - Detección de ácidos nucleicos - Google Patents

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ES2660248T3 ES13751988.0T ES13751988T ES2660248T3 ES 2660248 T3 ES2660248 T3 ES 2660248T3 ES 13751988 T ES13751988 T ES 13751988T ES 2660248 T3 ES2660248 T3 ES 2660248T3
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Elisa Mokany
Samantha WALKER
Cortny DONALD
Dina Lonergan
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Abstract

Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido diana en una muestra, comprendiendo el método: proporcionar un oligonucleótido cebador que comprende un primer componente de cebador que termina en el extremo 5' del oligonucleótido y es capaz de hibridarse con una primera porción de una cadena del polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, y un segundo componente de cebador que termina en el extremo 3' del oligonucleótido y es capaz de hibridarse con una segunda porción de la cadena de polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias; poner en contacto una muestra que comprende potencialmente el polinucleótido diana con el oligonucleótido cebador en condiciones adecuadas para la hibridación del primer componente de cebador y el segundo componente de cebador con la cadena polinucleotídica diana para formar de este modo un dúplex bicatenario, en el que al menos una cadena de una sección intermedia del dúplex comprende una secuencia de al menos cuatro nucleótidos que permanece sin hibridar con una cadena opuesta de la sección intermedia debido a la ausencia de una secuencia de nucleótidos en la cadena opuesta de la sección intermedia que comparte la complementariedad de pares de bases con la secuencia de al menos cuatro nucleótidos, poner en contacto la muestra con una enzima polimerasa capaz de usar la cadena polinucleotídica diana como plantilla para extender la longitud del oligonucleótido cebador del dúplex y generar de ese modo un amplicón que comprende un componente interno intermedio con respecto al primer y segundo componentes terminales, en el que el primer componente terminal del amplicón es capaz de hibridarse por emparejamiento de bases complementarias con dicha primera porción de la cadena polinucleotídica diana, el segundo componente terminal del amplicón es capaz de hibridarse por emparejamiento de bases complementarias con dicha segunda porción de la cadena polinucleotídica diana, y dicha hibridación del primer y segundo componentes terminales del amplicón con la cadena polinucleotídica diana posiciona el componente interno del amplicón para oponerse a una secuencia intermedia de nucleótidos en la cadena polinucleotídica diana localizada entre la primera y segunda porciones de la cadena polinucleotídica diana que no comparte la complementariedad de pares de bases con el componente interno; y detectar si se genera el amplicón, en donde la detección del amplicón indica la presencia del polinucleótido diana en la muestra, y el fallo en la detección del amplicón indica la ausencia del polinucleótido diana en la muestra.

Description

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dichas formas múltiples del oligonucleótido cebador en las condiciones adecuadas para la hibridación; y en el que cada una de las formas múltiples del oligonucleótido cebador comprende dicho tercer componente de cebador localizado entre el primer componente de cebador y el segundo
5 componente de cebador y que consiste en una secuencia de nucleótidos que no comparte complementariedad de pares de bases con dicha secuencia intermedia de nucleótidos en la cadena de polinucleótidos diana.
Realización 44. El método de acuerdo con la realización 43, en el que dicha detección comprende usar una 10 MNAzima que comprende un primer componente de brazo sensor, un segundo componente de brazo sensor y un tercer componente de brazo sensor, en el que
el primer componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con el componente interno del amplicón, y opcionalmente con el primer componente terminal del amplicón, mediante el
15 emparejamiento de bases complementarias; y el segundo componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con el segundo componente terminal del amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias; y el tercer componente de brazo sensor está ubicado entre el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor y no es capaz de hibridarse con dicha región polimórfica
20 o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicha región polimórfica mediante el emparejamiento de bases complementarias cuando el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor se hibridan con el amplicón.
Realización 45. El método de acuerdo con la realización 44, en el que
25 se generan formas múltiples del amplicón que comprende la región polimórfica mediante dicho contacto de la muestra con una enzima polimerasa, en donde la región polimórfica de cada una de dichas formas del amplicón difiere; y el brazo sensor comprende o consiste en un primer componente de brazo sensor, un segundo componente de brazo sensor, y un tercer componente de brazo sensor que no es complementario con una secuencia de
30 nucleótidos en el amplicón que comprende o consiste en la región polimórfica, en donde
el primer componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con cualquier forma de dicho amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias aguas arriba de la región polimórfica,
35 el segundo componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con cualquier forma de dicho amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias aguas abajo de la región polimórfica, el tercer componente de brazo sensor está ubicado entre el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor, y no es capaz de hibridarse por el emparejamiento de
40 bases complementarias con la región polimórfica de cualquiera de dichas formas del amplicón.
Realización 46. El método de acuerdo con la realización 43, en el que se generan formas múltiples del amplicón que comprende la región polimórfica mediante dicho contacto de la muestra con una enzima polimerasa, en donde la región polimórfica de cada una de dichas formas del
45 amplicón difiere; y el brazo sensor comprende o consiste en un primer componente de brazo sensor y un segundo componente de brazo sensor, en donde
el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor hibridan
50 mediante el emparejamiento de bases complementarias para separar componentes no contiguos de cualquier forma dada de dicho amplicón, yuxtaponiendo de este modo los componentes no contiguos y creando una porción de bucle en el amplicón que comprende nucleótidos no hibridados, y los nucleótidos no hibridados de la porción de bucle comprenden la región polimórfica del
55 amplicón.
Realización 47. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 43 a 46, en el que la región polimórfica comprende una cualquiera o más de las inserciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos, de tal forma que dichos dos o más miembros individuales de la población de polinucleótidos
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diana pueden diferir. Realización 48. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 47, en el que el oligonucleótido cebador y/o el polinucleótido diana y/o el amplicón comprenden o consisten en desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de los mismos.
5 Realización 49. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 48, en el que el polinucleótido diana y/o amplicón es ADN genómico, ADN complementario (ADNc) o ARN. Realización 50. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 29, 32, 36 a 41, 43 o 46, en el que el oligonucleótido cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico catalítico funcionalmente activo.
10 Realización 51. El método de acuerdo con la realización 50, en el que dicho amplicón comprende dicho ácido nucleico catalítico funcionalmente activo, y dicha detección de si el amplicón se genera comprende detectar la actividad catalítica de dicho ácido nucleico catalítico funcionalmente activo presente en el amplicón. Realización 52. El método de acuerdo con la realización 50 o la realización 51, en el que el ácido nucleico
15 catalítico funcionalmente activo es una DNAzima o una ribozima. Realización 53. El método de acuerdo con la realización 51 o la realización 52, en el que dicha detección de la actividad catalítica de dicho ácido nucleico catalítico funcionalmente activo presente en el amplicón comprende poner en contacto el amplicón con un sustrato de dicho ácido nucleico catalítico funcionalmente activo.
20 Realización 54. Un oligonucleótido cebador o de partzima aislado que comprende
un primer componente que termina en el extremo 5' del oligonucleótido y capaz de hibridarse con una primera porción de un segundo polinucleótido por emparejamiento de bases complementarias, un segundo componente que termina en el extremo 3' del oligonucleótido y capaz de hibridarse
25 con una segunda porción del segundo polinucleótido por emparejamiento de bases complementarias, y un tercer componente localizado entre el primer y segundo componentes que comprende una secuencia de al menos cuatro nucleótidos que no comparten complementariedad de pares de bases con una secuencia opuesta de nucleótidos en el segundo polinucleótido cuando el primer y
30 segundo componentes se hibridan con el segundo polinucleótido; en el que el tercer componente está ubicado parcial o completamente en la mitad 3' del oligonucleótido.
Realización 55. El oligonucleótido de acuerdo con la realización 54, en el que el tercer componente
35 comprende una secuencia de al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o al menos ocho nucleótidos no comparten complementariedad de pares de bases con la secuencia opuesta de nucleótidos en el segundo polinucleótido. Realización 56. El oligonucleótido de acuerdo con la realización 54 o la realización 55, en el que el número de nucleótidos en el primer componente es:
40 inferior al número de nucleótidos en el tercer componente; o superior al número de nucleótidos en el tercer componente.
Realización 57. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 54 a 56, en el que el
45 oligonucleótido comprende ADN, ADN complementario (ADNc), ARN o cualquier combinación de los mismos. Realización 58. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 54 a 57, en el que el oligonucleótido es un componente de un brazo sensor de partzima. Realización 59. Uso del oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 54 a 58 en el
50 método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 53. Realización 60. Un dúplex de ácido nucleico bicatenario aislado que comprende el oligonucleótido de una cualquiera de las realizaciones 54 a 58 hibridado con un segundo polinucleótido por emparejamiento de bases complementarias, en el que
55 un primer componente del oligonucleótido termina en el extremo 5' del oligonucleótido y se hibrida con una primera porción de un segundo polinucleótido por emparejamiento de bases complementarias, un segundo componente del oligonucleótido termina en el extremo 3' del oligonucleótido y se hibrida con una segunda porción del segundo polinucleótido por emparejamiento de bases
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nucleótidos, 10 y 200 nucleótidos, 10 y 150 nucleótidos, 10 y 100 nucleótidos, 10 y 100 nucleótidos, 10 y 75 nucleótidos, 10 y 50 nucleótidos, o 10 y 25 nucleótidos, inferior al número de nucleótidos no hibridados en el polinucleótido facilitador del ensamblaje ubicado entre las porciones del polinucleótido facilitador del ensamblaje hibridadas con el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo
5 sensor. Realización 71. La MNAzima de acuerdo con la realización 66, en la que el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor son capaces de hibridar para separar componentes no contiguos del polinucleótido facilitador del ensamblaje mediante el emparejamiento de bases complementarias, yuxtaponiendo de este modo los componentes no contiguos y creando una porción de
10 bucle que comprende nucleótidos no hibridados en el polinucleótido facilitador del ensamblaje. Realización 72. La MNAzima de acuerdo con la realización 71, en la que la porción de bucle del polinucleótido facilitador del ensamblaje comprende entre 1 y 50 nucleótidos, 1 y 40 nucleótidos, 1 y 30 nucleótidos, 1 y 20 nucleótidos, 1 y 10 nucleótidos, 1 y 5 nucleótidos, 5 y 50 nucleótidos, 5 y 40 nucleótidos, 5 y 30 nucleótidos 5 y 20 nucleótidos, 5 y 10 nucleótidos, 10 y 50 nucleótidos, 10 y 40 nucleótidos, 10 y 30
15 nucleótidos, o 10 y 20 nucleótidos. Realización 73. La MNAzima de acuerdo con una cualquiera de 66 a 72, en la que el polinucleótido facilitador del ensamblaje es un polinucleótido diana para la detección por la MNAzima. Realización 74. Un complejo de ácido nucleico que comprende la MNAzima de una cualquiera de las realizaciones 66 a 73 hibridada con dicho polinucleótido facilitador del ensamblaje mediante el
20 emparejamiento de bases complementarias. Realización 75. Uso de MNAzima de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 66 a 73 para detectar la presencia o ausencia de un polinucleótido diana en una muestra, en el que la diana polinucleotídica es dicho facilitador del ensamblaje. Realización 76. Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido diana en una
25 muestra, comprendiendo el método:
proporcionar un oligonucleótido cebador capaz de hibridarse con el polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, poner en contacto una muestra que comprende potencialmente el polinucleótido diana con el
30 oligonucleótido cebador en condiciones adecuadas para la hibridación del oligonucleótido cebador con el polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias para formar de este modo un dúplex bicatenario, poner en contacto la muestra con una enzima polimerasa capaz de usar el polinucleótido diana como plantilla para extender la longitud del oligonucleótido cebador del dúplex y generar de este
35 modo un amplicón, y detectar si se genera el amplicón usando una MNAzima de acuerdo con la realización 66, en donde la detección del amplicón indica la presencia del polinucleótido diana en la muestra, y el fallo en la detección del amplicón indica la ausencia del polinucleótido diana en la muestra.
40 Realización 77. El método de acuerdo con la realización 76, en el que dicho primer componente de brazo sensor comprende una secuencia de nucleótidos que comparte complementariedad de pares de bases con:
(i)
el amplicón o un componente del mismo, o
(ii)
una secuencia de nucleótidos complementaria al amplicón o un componente del mismo;
45 y dicha detección comprende determinar si dicho primer componente de brazo sensor se hibrida por emparejamiento de bases complementarias con cualquiera de (i) o (ii) anteriores. Realización 78. El método de acuerdo con la realización 76, en el que el polinucleótido diana comprende una región polimórfica que varía entre dos o más miembros individuales
50 de una población de los polinucleótidos diana se proporcionan una serie de oligonucleótidos cebadores capaces de hibridarse con al menos uno de dicho polinucleótido diana de la población de polinucleótidos diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, en el que cada oligonucleótido cebador comparte complementariedad de pares de bases con una forma específica de la región polimórfica presente solo en algunos de dichos miembros de la
55 población de polinucleótidos diana; y cada dicho oligonucleótido cebador comprende una secuencia de nucleótidos de porción de etiqueta idéntica que se incorpora a cada una de una población de dichos amplicones después de dicho contacto de la muestra con una enzima polimerasa, en donde cada miembro de la población de amplicones comprende una región polimórfica presente solamente en algunos de dichos miembros de la población de amplicones;
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y en el que dicha detección comprende determinar si dicho primer brazo sensor de la MNAzima hibrida con dicha porción de etiqueta de miembros de la población de amplicones mediante el emparejamiento de bases complementarias. Realización 79. Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido diana en una
5 muestra, en el que el polinucleótido diana comprende una región polimórfica que varía entre dos o más miembros individuales de una población de los polinucleótidos diana, comprendiendo el método:
proporcionar un oligonucleótido cebador capaz de hibridarse con el polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, en el que el oligonucleótido cebador comparte la
10 complementariedad de pares de bases con una forma específica de la región polimórfica presente solamente en algunos de dichos miembros de la población, o, con una porción del polinucleótido diana adyacente o sustancialmente adyacente a la forma específica de la región polimórfica; poner en contacto una muestra que comprende potencialmente el polinucleótido diana con el oligonucleótido cebador en condiciones adecuadas para la hibridación del oligonucleótido cebador
15 con el polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias para formar de este modo un dúplex bicatenario, poner en contacto la muestra con una enzima polimerasa capaz de usar el polinucleótido diana como plantilla para extender la longitud del oligonucleótido cebador del dúplex y generar de este modo un amplicón que comprende la forma específica de la región polimórfica; y
20 detectar si se genera el amplicón usando una MNAzima de acuerdo con la realización 66, en donde la detección del amplicón indica la presencia del polinucleótido diana en la muestra, y el fallo en la detección del amplicón indica la ausencia del polinucleótido diana en la muestra.
Realización 80. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 76 a 79, que comprende
25 producir copias de dicho amplicón usando uno cualquiera o más de: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación mediada por transcripción (TMA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA), o reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).
30 Realización 81. El método de acuerdo con la realización 79 u 80, en el que dicho suministro comprende proporcionar múltiples formas del oligonucleótido cebador, en donde diferentes formas del oligonucleótido cebador comparten complementariedad de pares de bases con diferentes formas de la región polimórfica, o una porción del polinucleótido diana adyacente o sustancialmente adyacente a una o más formas de la región polimórfica;
35 dicho contacto con el oligonucleótido cebador comprende poner en contacto una muestra que comprende potencialmente uno o más miembros de la población de polinucleótidos diana con las formas múltiples del oligonucleótido cebador en dichas condiciones adecuadas para la hibridación; y dicha detección comprende detectar si se generan múltiples formas del amplicón que comprenden diferentes regiones polimórficas usando dicho MNAzima.
40 Realización 82. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 79 a 81, en el que se generan múltiples formas del amplicón mediante dicho contacto de la muestra con una enzima polimerasa, en el que la región polimórfica de dichas formas del amplicón difiere; y el brazo sensor de la MNAzima comprende o consiste en un primer componente de brazo sensor y un segundo componente de brazo sensor que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a
45 diferentes porciones del amplicón, y un tercer componente de brazo sensor situado entre el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor, en el que
el primer componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con cualquier forma de dicho amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias aguas arriba de la región
50 polimórfica, el segundo componente de brazo sensor es capaz de hibridarse con cualquier forma de dicho amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias aguas abajo de la región polimórfica, el tercer componente de brazo sensor está ubicado entre el primer componente de brazo sensor y
55 el segundo componente de brazo sensor, y no es capaz de hibridarse por emparejamiento de bases complementarias con la región polimórfica de dicha forma del amplicón debido a la ausencia de una secuencia de nucleótidos en el tercer componente de brazo sensor que comparte la complementariedad de pares de bases con la región polimórfica de cualquiera de dichas formas del amplicón.
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Realización 83. El método de acuerdo con la realización 82, en el que el número de nucleótidos en el tercer componente de brazo sensor es igual o superior al número de nucleótidos no hibridados en el amplicón que comprende la región polimórfica.
5 Realización 84. El método de acuerdo con la realización 82, en el que el número de nucleótidos en el tercer componente de brazo sensor es inferior al número de nucleótidos no hibridados en el amplicón que comprende la región polimórfica. Realización 85. El método de acuerdo con la realización 84, en el que el número de nucleótidos en el tercer componente de brazo sensor se encuentra entre 1 y 50 nucleótidos, 1 y 40 nucleótidos, 1 y 30 nucleótidos 1
10 y 20 nucleótidos, 1 y 10 nucleótidos, 5 y 50 nucleótidos, 5 y 40 nucleótidos, 5 y 30 nucleótidos 5 y 20 nucleótidos, 5 y 10 nucleótidos, 10 y 50 nucleótidos, 10 y 40 nucleótidos, 10 y 30 nucleótidos, o 10 y 20 nucleótidos, inferior al número de nucleótidos no hibridados en el polinucleótido facilitador del ensamblaje situado entre las porciones del polinucleótido facilitador del ensamblaje hibridadas con el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor.
15 Realización 86. El método de acuerdo con la realización 79 o la realización 80, en el que se generan formas múltiples del amplicón que comprende la región polimórfica mediante dicho contacto de la muestra con una enzima polimerasa, en donde la región polimórfica de cada una de dichas formas del amplicón difiere; y el brazo sensor comprende o consiste en un primer componente de brazo sensor y un segundo
20 componente de brazo sensor, en donde el primer componente de brazo sensor y el segundo componente de brazo sensor hibridan mediante el emparejamiento de bases complementarias para separar componentes no contiguos de cualquier forma dada de dicho amplicón, yuxtaponiendo de este modo los componentes no contiguos y creando una porción de bucle que comprende nucleótidos no hibridados en el amplicón, y
25 los nucleótidos no hibridados en el amplicón comprenden la región polimórfica. Realización 87. El método de acuerdo con la realización 86, en el que la porción de bucle que comprende nucleótidos no hibridados en el polinucleótido diana comprende entre 1 y 200 nucleótidos, 1 y 150 nucleótidos, 1 y 100 nucleótidos, 1 y 75 nucleótidos, y 50 nucleótidos, 1 y 25 nucleótidos, 5 y 200 nucleótidos, 5 y 150 nucleótidos, 5 y 100 nucleótidos, 5 y 100 nucleótidos, 5 y 75 nucleótidos, 5 y 50
30 nucleótidos 5 y 25 nucleótidos, 10 y 200 nucleótidos, 10 y 150 nucleótidos, 10 y 100 nucleótidos, 10 y 100 nucleótidos, 10 y 75 nucleótidos, 10 y 50 nucleótidos, o 10 y 25 nucleótidos. Realización 88. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 81 a 87, que comprende además usar una reacción enzimática para proporcionar copias amplificadas de uno o más de los polinucleótidos diana.
35 Realización 89. El método de acuerdo con la realización 88, que comprende amplificar uno o más de los polinucleótidos nacientes usando un segundo oligonucleótido que es sustancialmente complementario a un componente diferente del polinucleótido diana que los oligonucleótidos cebadores. Realización 90. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 78 a 89, en el que la región polimórfica comprende una cualquiera o más de las inserciones, deleciones y/o sustituciones de
40 nucleótidos, de tal forma que dichos miembros individuales de la población de polinucleótidos diana pueden diferir. Realización 91. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 76 a 90, en el que el oligonucleótido cebador y/o el polinucleótido diana y/o el amplicón y/o la MNAzima comprenden o consisten en desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de los mismos.
45 Realización 92. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 76 a 91, en el que el polinucleótido diana y/o amplicón es ADN genómico, ADN complementario (ADNc) o ARN. Realización 93. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 42 o 76 a 92, en el que dicha MNAzima es capaz de modificar un sustrato que comprende una porción detectable y una porción inactivadora, en el que se proporciona un efecto detectable por la escisión del sustrato mediante la
50 MNAzima que separa dichas porciones detectables e inactivadoras, indicando de este modo la presencia del polinucleótido diana en la muestra. Realización 94. El método de acuerdo con la realización 93, que comprende además amplificar el efecto detectable producido tras la modificación del sustrato por la MNAzima. Realización 95. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 42 o 76 a 93, en el que
55 el polinucleótido diana es de una bacteria, virus, hongo/levadura, protista o nematodo. Realización 96. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 42 o 76 a 93, en el que el polinucleótido diana es de un enterovirus. Realización 97. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 53 o 76 a 96, en el que el método se realiza in vitro o ex vivo.
14
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amplicón mediante el emparejamiento de bases complementarias. Realización 117. El método de acuerdo con la realización 50, en el que el tercer componente del oligonucleótido cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico catalítico funcionalmente activo.
5 La presente descripción también se refiere, al menos en parte, a las siguientes realizaciones 1-33:
Realización 1. Un método para determinar la presencia o ausencia en una muestra de un polinucleótido diana que es un componente de: 10
(i)
un gen de tipo salvaje del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS);
(ii)
un gen del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación G12V o G12S; o
(iii) un enterovirus,
15 comprendiendo el método:
proporcionar un oligonucleótido cebador que comprende un primer componente de cebador que termina en el extremo 5' del oligonucleótido y es capaz de
20 hibridarse con una primera porción de una cadena del polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, y un segundo componente de cebador que termina en el extremo 3' del oligonucleótido y es capaz de hibridarse con una segunda porción de la cadena de polinucleótido diana mediante el emparejamiento de bases complementarias;
25 poner en contacto una muestra que comprende potencialmente el polinucleótido diana con el oligonucleótido cebador en condiciones adecuadas para la hibridación del primer componente de cebador y el segundo componente de cebador con la cadena polinucleotídica diana para formar de este modo un dúplex bicatenario, en el que al menos una cadena de una sección intermedia del dúplex comprende una
30 secuencia de al menos cuatro nucleótidos que permanece sin hibridar con una cadena opuesta de la sección intermedia debido a la ausencia de una secuencia de nucleótidos en la cadena opuesta de la sección intermedia que comparte la complementariedad de pares de bases con la secuencia de al menos cuatro nucleótidos; poner en contacto la muestra con una enzima polimerasa capaz de usar la cadena polinucleotídica diana
35 como plantilla para extender la longitud del oligonucleótido cebador del dúplex y generar de ese modo un amplicón que comprende un componente interno intermedio con respecto al primer y segundo componentes terminales, en el que
el primer componente terminal del amplicón es capaz de hibridarse por emparejamiento de bases
40 complementarias con dicha primera porción de la cadena polinucleotídica diana, el segundo componente terminal del amplicón es capaz de hibridarse por emparejamiento de bases complementarias con dicha segunda porción de la cadena polinucleotídica diana, y dicha hibridación del primer y segundo componentes terminales del amplicón con la cadena polinucleotídica diana posiciona el componente interno del amplicón para oponerse a una
45 secuencia intermedia de nucleótidos en la cadena polinucleotídica diana localizada entre la primera y segunda porciones de la cadena polinucleotídica diana que no comparte la complementariedad de pares de bases con el componente interno; y
detectar si se genera el amplicón, en donde la detección del amplicón indica la presencia del polinucleótido
50 diana en la muestra, y el fallo en la detección del amplicón indica la ausencia del polinucleótido diana en la muestra. Realización 2. El método de acuerdo con la realización 1, en el que el polinucleótido diana es un componente de un gen del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación G12V,
55 el oligonucleótido cebador comprende un tercer componente de cebador localizado entre el primer componente de cebador y el segundo componente de cebador, en el que el tercer componente de cebador consiste en una secuencia de nucleótidos que no comparte la complementariedad de pares de bases con dicha secuencia intermedia de nucleótidos en la cadena de polinucleótidos diana, y es idéntica a una secuencia de nucleótidos en el componente interno del amplicón,
17
y el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en cualquiera de las SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296, 301, 66, 87, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o 99.
5 Realización 3. El método de acuerdo con la realización 2, que comprende poner en contacto la muestra con un segundo oligonucleótido cebador que comparte complementariedad de pares de bases con una segunda cadena de polinucleótidos diana que es el complemento de dicha primera cadena de polinucleótidos diana, en el que dicho contacto es en condiciones adecuadas para la hibridación del segundo oligonucleótido cebador y la segunda cadena de polinucleótidos diana mediante el
10 emparejamiento de bases complementarias, y usar una enzima polimerasa para extender la longitud del segundo oligonucleótido cebador usando la segunda cadena de polinucleótidos diana como plantilla y de este modo generar un segundo amplicón, en el que
15 (i) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 50, 59, 60, 61, 62, 172, 173, 174, 175, 176, 292, 297, 293, 298, 294, 299, 295, 300, 296, o 301, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 26;
(ii) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ
20 ID NO: 66 o 87, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 65;
(iii) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 70-79 o 99, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 69; o
25 (iv) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 87, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 26 o 171.
Realización 4. El método de acuerdo con la realización 1, en el que
30 el polinucleótido diana es un componente de un gen del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación G12V, el primer componente de cebador y el segundo componente de cebador se hibridan mediante el emparejamiento de bases complementarias para separar componentes no contiguos de la cadena de polinucleótidos diana, yuxtaponiendo de este modo los componentes no contiguos y creando una porción
35 de bucle que comprende nucleótidos no hibridados en la cadena de polinucleótidos diana; y el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en cualquiera de las SEQ ID NOs: 177, 178 o 171. Realización 5. El método de acuerdo con la realización 4, que comprende poner en contacto la muestra con un segundo oligonucleótido cebador que comparte complementariedad de
40 pares de bases con una segunda cadena de polinucleótidos diana que es el complemento de dicha primera cadena de polinucleótidos diana, en el que dicho contacto es en condiciones adecuadas para la hibridación del segundo oligonucleótido cebador y la segunda cadena de polinucleótidos diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, y usar una enzima polimerasa para extender la longitud del segundo oligonucleótido cebador usando la
45 segunda cadena de polinucleótidos diana como plantilla y de este modo generar un segundo amplicón, en el que:
(i) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ
ID NO: 177 o 178, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia 50 como se define en la SEQ ID NO: 26; o
(ii) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 171, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 87.
55 Realización 6. El método de acuerdo con la realización 3 o la realización 5, en el que dicha detección de si se genera el amplicón comprende usar una primera y segunda partzimas, en el que
(i) la primera partzima comprende una secuencia como se define en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 22, 24, 23, 47, 53, 54, 64, 164, 165, 287, 288, 289, 290, o 291, y la segunda partzima
18
comprende una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 18;
(ii) la primera partzima comprende una secuencia como se define en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 64, 24, 67, 68 o 88, y la segunda partzima comprende una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 63; o
5 (iii) la primera partzima comprende una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 24, y la segunda partzima comprende una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 18.
Realización 7. El método de acuerdo con la realización 1, en el que:
10 el polinucleótido diana es un componente de un gen del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación G12S, el oligonucleótido cebador comprende un tercer componente de cebador localizado entre el primer componente de cebador y el segundo componente de cebador, en el que
15 el tercer componente de cebador consiste en una secuencia de nucleótidos que no comparte la complementariedad de pares de bases con dicha secuencia intermedia de nucleótidos en la cadena de polinucleótidos diana, y es idéntica a una secuencia de nucleótidos en el componente interno del amplicón, y
20 el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en cualquiera de las SEQ ID NOs: 166-169.
Realización 8. El método de acuerdo con la realización 7 que comprende poner en contacto la muestra con un segundo oligonucleótido cebador que comparte complementariedad de
25 pares de bases con una segunda cadena de polinucleótidos diana que es el complemento de dicha primera cadena de polinucleótidos diana, en el que dicho contacto es en condiciones adecuadas para la hibridación del segundo oligonucleótido cebador y la segunda cadena de polinucleótidos diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, y usar una enzima polimerasa para extender la longitud del segundo oligonucleótido cebador usando la
30 segunda cadena de polinucleótidos diana como plantilla y de este modo generar un segundo amplicón, en el que
(i) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en una
cualquiera de las SEQ ID NOs: 166-169, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o 35 consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 26; o
(ii) el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 166, y el segundo oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 171.
40 Realización 9. El método de acuerdo con la realización 1, en el que:
el polinucleótido diana es un componente de un gen del homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten (KRAS) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mutación G12S,
45 el primer componente de cebador y el segundo componente de cebador se hibridan mediante el emparejamiento de bases complementarias para separar componentes no contiguos de la cadena de polinucleótidos diana, yuxtaponiendo de este modo los componentes no contiguos y creando una porción de bucle que comprende nucleótidos no hibridados en la cadena de polinucleótidos diana; y
50 el oligonucleótido cebador comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 170 o 171.
Realización 10. El método de acuerdo con la realización 9 que comprende poner en contacto la muestra con un segundo oligonucleótido cebador que comparte complementariedad de
55 pares de bases con una segunda cadena de polinucleótidos diana que es el complemento de dicha primera cadena de polinucleótidos diana, en el que dicho contacto es en condiciones adecuadas para la hibridación del segundo oligonucleótido cebador y la segunda cadena de polinucleótidos diana mediante el emparejamiento de bases complementarias, y usar una enzima polimerasa para extender la longitud del segundo oligonucleótido cebador usando la
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Realización 30. El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 29, en el que el primer o segundo polinucleótido diana es ADN, ARN o ADNc. Realización 31. Un oligonucleótido que comprende tres componentes, en el que:
5 un primer y un tercer componente del oligonucleótido son sustancialmente complementarios a diferentes componentes de un polinucleótido diana; y un segundo componente del oligonucleótido situado entre el primer y segundo componentes no es complementario al polipéptido diana.
10 Realización 32. El oligonucleótido de acuerdo con la realización 31, en el que el segundo componente tiene más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. Realización 33. El oligonucleótido de acuerdo con la realización 31 o la realización 32, en el que el primer componente tiene más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. Realización 34. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 33, en el que el
15 tercer componente tiene más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. Realización 35. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 33, en el que el número de nucleótidos en el primer y tercer componentes es menor que el número de nucleótidos en el segundo componente. Realización 36. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 33, en el que el
20 número de nucleótidos en el primer y tercer componentes es igual al número de nucleótidos en el segundo componente. Realización 37. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 33, en el que el número de nucleótidos en el primer y tercer componentes es superior al número de nucleótidos en el segundo componente.
25 Realización 38. El oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 35, en el que el segundo componente forma un bucle tras la unión del oligonucleótido a la diana polinucleotídica. Realización 39. El oligonucleótido de una cualquiera de las realizaciones 31 a 38, en el que el oligonucleótido es ADN, ARN o ADNc. Realización 40. Uso del oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 31 a 39 en el
30 método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 30.
Breve descripción de los dibujos
Las realizaciones preferidas de la presente invención se describirán ahora, a modo de ejemplo solamente, con 35 referencia a las Figuras 1-16 adjuntas, tal como se expone a continuación.
Figura 1: Cebador de conmutación de secuencia asistida por polinucleótidos (PASS) con lectura de MNAzima: Se ilustra una estrategia de PCR PASS ejemplar que implica un cebador PASS que contiene una porción de secuencia única que no es complementaria con la secuencia diana de interés. La secuencia 40 única (US) se encuentra entre dos secuencias (S1 y S2) en el cebador PASS, ambas de las cuales son en gran parte complementarias a la diana. S1 es la región del cebador PASS que es complementaria a la diana y 5' a la US. S2 es la región del cebador PASS que es complementaria en gran medida a la diana y está 3' con respecto a la US. Los cebadores PASS pueden diseñarse para producir diferentes conformaciones cuando se unen a la secuencia diana. Por ejemplo, cuando el número de bases en la secuencia diana entre 45 los sitios de unión de S1 y S2 (diana-hueco) es menor que el número de bases en la US, entonces la US se "arrollará" cuando el cebador PASS se una a la diana (Panel (i)). Cuando el número de bases en la diana entre los sitios de unión de S1 y S2 es el mismo que el número de bases en la US, entonces la US no se arrolla, sino que forma una región no complementaria "planar" (Panel (ii)). En otra realización, el número de bases en la secuencia diana entre los sitios de unión de S1 y S2 puede ser mayor que el número de bases 50 en la US, en este escenario, la secuencia diana se arrollará cuando el cebador PASS se une a la secuencia diana. A través de rondas sucesivas de PCR, la US se incorpora en una cadena del amplicón de PCR y el complemento de la US (cUS) se incorpora en la cadena opuesta del amplicón de PCR. Los amplicones generados por los cebadores PASS con un bucle (Panel (i)) o una región plana (Panel (ii)) de la US pueden detectarse mediante muchas estrategias. A modo de ejemplo, esta figura muestra la detección utilizando
55 MNAzimas (Panel (iii)). Cuando los cebadores PASS se combinan con qPCR de MNAzima, la MNAzima puede comprender una partzima que se une al complemento de la secuencia única (cUS) como se ilustra, o como alternativa, la secuencia única, mientras que la otra partzima se une de forma adyacente a la secuencia diana amplificada de interés. La formación de MNAzimas activas a partir de los componentes de la partzima puede dar como
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resultado la escisión de una sonda universal marcada con un fluoróforo y un inactivador, produciendo una señal que puede controlarse en tiempo real.
Figura 2: Cebadores PASS diseñados para discriminar polimorfismos de nucleótido único (SNP) y/o mutaciones puntuales adquiridas: Los cebadores PASS pueden diseñarse para mejorar la discriminación
5 de cambios de base individual, tales como SNP o mutaciones puntuales. En una realización, se puede usar S2 de un cebador PASS de bucle (Panel (i)) o un cebador PASS planar (Panel (ii)) para dirigirse y unirse específicamente al SNP o la mutación puntual. La base emparejada al SNP o la mutación puntual en S2 del cebador PASS puede estar ubicada en el extremo 3' del cebador, o puede colocarse en otras posiciones dentro del S2 (parte superior de los Paneles
10 (i) y (ii)). Además, las bases adicionales pueden no estar emparejadas entre S2 y la diana de interés para ayudar a una mejor discriminación del SNP (parte inferior de los paneles (i) y (ii)).
Figura 3: Uso de cebadores PASS para discriminar entre cambios de base individual con una lectura de MNAzima múltiple: Los cebadores PASS pueden diseñarse para mejorar la discriminación entre secuencias variantes, tales como SNP o mutaciones. Esto se puede realizar en reacciones de qPCR de 15 MNAzima múltiples. La detección de, y la discriminación entre, dos secuencias que varían en solamente una base individual se ilustra en esta figura con la variante 1 representada por un círculo en el panel de la izquierda y la variante 2 representada por un triángulo en el panel de la derecha. S2 del cebador PASS 1 está específicamente emparejado con la variante 1, y la US del cebador PASS 1 es una primera secuencia única no diana 1 (US1) en un formato de bucle (Bucle 1). S2 del cebador PASS 2 está específicamente
20 emparejado con la variante 2, y la US del cebador PASS 2 es una segunda secuencia única no diana (US2) en un formato de bucle (Bucle 2). El uso de estos cebadores PASS da como resultado amplicones para cada variante que difieren tanto por (a) la base de variante como (b) la US incorporada a través del cebador PASS. La detección de amplicones resultantes puede estar mediada por MNAzimas. A modo de ejemplo, la
25 MNAzima 1 puede diseñarse para detectar amplicones de variante 1 mediante el diseño de un brazo sensor de partzima que está compuesto por una secuencia que es específica tanto para la variante 1 como para el complemento de US1. La MNAzima 1 puede diseñarse para escindir una sonda universal 1 (Sub 1) marcada con el fluoróforo 1 solamente en presencia de amplicones con la variante 1. La MNAzima 2 puede diseñarse para detectar amplicones de variante 2 mediante el diseño de un brazo sensor de partzima que
30 está compuesto por una secuencia que es específica tanto para la variante 2 como para el complemento de US2. La MNAzima 2 puede diseñarse para escindir una sonda universal 2 (Sub 2) marcada con el fluoróforo 2 solamente en presencia de amplicones con la variante 2. En esta estrategia, la detección en tiempo real, la discriminación y la cuantificación de ambas variantes 1 y 2 podría producirse simultáneamente en el tubo de reacción.
35 Figura 4: Combinación de cebadores PASS con qPCR de MNAzima: Los cebadores PASS se combinaron en qPCR con una lectura de MNAzima. El cebador directo, que en este ejemplo también podría ser el cebador PASS, se colocó en diferentes posiciones en relación con la unión de partzima. El extremo 3' del cebador directo/PASS se localizó en (i) 5 bases de la unión de partzima, (ii) 3 bases de la unión de partzima, o (iii) en la unión de partzima
40 En las reacciones de qPCR, las MNAzimas se diseñaron para dirigirse a cada uno de los 3 escenarios creados por los cebadores PASS (i - iii). Para cada escenario, los cebadores PASS con una US en bucle (triángulo de color negro - Ensayo 1) o una US planar (cuadrado de color blanco - Ensayo 2) se compararon con un cebador estándar (no PASS) con MNAzima emparejada (círculo de color negro - control positivo) o el cebador estándar (no PASS) combinado con las partzimas diseñadas para detectar la US (cruz - control
45 negativo). Figura 5: Uso de cebadores PASS para omitir una secuencia altamente variable: La US incorporada en amplicones mediante el uso de un cebador PASS también se puede usar para omitir las áreas de variación genética no informativa que existen entre las secuencias conservadas a detectar. Los cebadores PASS pueden diseñarse de tal forma que S1 y S2 sean complementarios a dos secuencias conservadas,
50 no adyacentes de una diana. El hueco en la secuencia diana entre las áreas que se hibridan con S1 y S2 (diana-hueco) contendría diferencias en la secuencia entre tres variantes a detectar. La US del cebador PASS pueden diseñarse para contener el mismo número de nucleótidos en la diana-hueco entre S1 y S2. La US puede no coincidir con las tres variantes. Una única MNAzima podría diseñarse con un brazo sensor de partzima que hibridaría el complemento de la US y escindiría una única sonda para detectar las
55 Variantes 1, 2 y/o 3. Figura 6: Uso de cebadores PASS para arrollar una secuencia altamente variable: La US incorporada en amplicones mediante el uso de un cebador PASS también se puede usar para eliminar las áreas de variación genética no informativa que existen entre las secuencias conservadas a detectar. Los cebadores PASS de bucle diana pueden diseñarse de tal forma que la US del cebador PASS contenga menos
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nucleótidos que aquellos en la diana-hueco entre S1 y S2. La amplificación de ADN de la Variante 1 utilizando el cebador PASS de bucle diana reemplazaría la secuencia variante en la diana-hueco con un número menor de nucleótidos en la US del cebador PASS. Una única MNAzima podría diseñarse con un brazo sensor de partzima que hibridaría el complemento de la US y escindiría una única sonda para
5 detectar cualquier amplicón generado a partir del cebador PASS.
Figura 7: Diseños de cebadores PASS usados para discriminar polimorfismos de nucleótido único (SNP) y/o mutaciones puntuales adquiridas: Los cebadores PASS pueden diseñarse para discriminar cambios de base individual, tales como SNP o mutaciones puntuales. En una realización, se puede usar S2 de un cebador PASS en bucle o planar para dirigirse y unirse específicamente al SNP o la mutación 10 puntual. A modo de ejemplo, la base emparejada al SNP o la mutación puntual en S2 del cebador PASS puede estar situada en el extremo 3' del cebador (Diseño 1), 3 bases del extremo 3' (Diseño 2), en el extremo 3' del cebador con una base desemparejada insertada 3 bases desde el extremo 3' (Diseño 3) o 3 bases desde el extremo 3' con una base desemparejada insertada 5 bases desde el extremo 3' (Diseño 4). Los brazos sensores diana de partzima A para MNAzimas están diseñados para emparejar con cada diseño
15 de cebador PASS, mientras que la Partzima B es constante para todos los diseños.
Figura 8: Uso de partzimas PASS para detectar cepas variantes con lectura de qPCR de MNAzima:
Las secuencias dianas de interés pueden contener una cadena de bases de variantes, donde las variantes en cada una pueden ser diferentes entre sí, por ejemplo, secuencias variantes 1 (VI), variantes 2 (V2) y variantes 3 (V3). Los conjuntos de cebadores pueden diseñarse para ser específicos para cada secuencia 20 variante, V1, V2 y V3, y producir amplicones para cada una. El uso de partzimas PASS proporciona una estrategia para detectar las secuencias en tiempo real sin discriminar entre las cepas variantes. Esto implica el uso de qPCR MNAzima, por lo que la MNAzima puede comprender una partzima PASS. La partzima PASS contiene una porción de secuencia única (US) que no es complementaria a la secuencia o secuencias diana/amplicón o amplicones de interés. La US está contenida dentro del brazo sensor de
25 partzima PASS entre dos regiones específicas diana complementarias que son en gran medida complementarias con la diana. La US en la partzima está alineada con la región variante en V1, V2 y V3 que contiene las bases de variantes. La US dentro de las partzimas PASS no afecta a la formación de las MNAzimas activas y, por lo tanto, la presencia de cualquier variante, o combinación de las mismas, puede dar como resultado la escisión de una
30 sonda universal marcada con un fluoróforo y un inactivador, produciendo una señal que puede controlarse en tiempo real.
Figura 9: Uso de partzimas PASS con cebadores PASS para detectar cepas variantes con lectura de qPCR de MNAzima: Las secuencias dianas de interés pueden contener una cadena de bases de variantes, donde las variantes en cada una pueden ser diferentes entre sí, por ejemplo, secuencias variantes 1 (VI), 35 variantes 2 (V2) y variantes 3 (V3). Los conjuntos de cebadores PASS pueden diseñarse para ser específicos para cada secuencia variante, V1, V2 y V3, pero contienen la misma US (US1), lo que da como resultado amplicones para cada uno que contienen las bases de variantes pero también la secuencia del complemento para la misma US (cUS1). El uso de partzimas PASS proporciona una estrategia para detectar las secuencias en tiempo real sin discriminar entre las cepas variantes. Esto implica utilizar qPCR 40 de MNAzima, por lo que la MNAzima puede comprender una primera partzima PASS y una partzima "estándar" totalmente emparejada que se une de forma adyacente a las secuencias diana amplificadas de interés. El primer brazo sensor de partzima PASS contiene (i) una región completamente emparejada con la secuencia conservada de todos los amplicones de variantes, (ii) una secuencia única (US2) que no es complementaria a ninguno de los amplicones de variantes y que está alineada con las regiones que difieren
45 entre los amplicones de variantes, y (iii) una región que contiene US1, que se une a la cUS1 en todos los amplicones generados mediante el uso de los conjuntos de cebadores PASS específicos de variante (conteniendo todos cUS1). Esta MNAzima puede reconocer y unirse a todas las variantes. Las secuencias de US dentro de las partzimas PASS no afectan a la formación de las MNAzimas activas y, por lo tanto, la presencia de cualquier secuencia variante, o combinaciones de las mismas, puede dar como
50 resultado la escisión de una sonda universal marcada con un fluoróforo y un inactivador, produciendo una señal que puede controlarse en tiempo real.
Figura 10: Uso de partzimas PASS para detectar cepas de deleción de variantes con lectura de qPCR de MNAzima: Las secuencias diana variantes de interés pueden derivarse de secuencias de tipo salvaje donde se han eliminado regiones diferentes (Panel i, Deleción 1 y Deleción 2). Los conjuntos de 55 cebadores pueden diseñarse para ser específicos para cada secuencia variante de deleción y producir amplicones para cada uno. El uso de partzimas PASS proporciona una estrategia para detectar las secuencias en tiempo real sin discriminar necesariamente entre las deleciones específicas. Esto puede conseguirse usando qPCR de MNAzima, por lo que la MNAzima puede comprender una primera partzima PASS y una segunda partzima ("estándar") totalmente emparejada que se une de forma adyacente a las
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AGTTCTTCTTGGATGGTCATAGACATACTACTCCAGA SEQ ID NO: 11 Cebador PASS directo 5CCB_1i2Planar CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTAGACATACTACTCCAGA SEQ ID NO: 12 Cebador directo 5CCB_2:
5 GGATGGTCATCTCCAGAGC SEQ ID NO: 13 Cebador PASS directo 5CCB_2i2Loop: TTCTTCTTGGATGGTCATCTAGACATACTACCAGAGC SEQ ID NO: 14 Cebador PASS directo 5CCB_2i2Planar: CTTGTCTCAGTTCTTCTTGGAGACATACTACCAGAGC
10 SEQ ID NO: 15 Cebador directo 5CCB_3: TGGTCATCTCCAGAGCCCA SEQ ID NO: 16 Cebador PASS directo 5CCB_3i2Loop: CTTCTTGGATGGTCATCTCCAAGACATACTAGAGCCCA SEQ ID NO: 17 Cebador PASS directo 5CCB_3i2Planar:
15 GTCTCAGTTCTTCTTGGATGAGACATACTAGAGCCCA 1.4. Secuencia diana
Se usó ADNg humano extraído de la línea celular IM9 (Promega) como plantilla para la amplificación del gen CCB. 20
1.5. Componentes de reacción: Amplificación y detección de la secuencia diana
La amplificación en tiempo real y la detección de la secuencia diana se realizó en un volumen de reacción total de 25 μl. Las reacciones se realizaron en un Mx3005p (Stratagene). Los parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 2 25 minutos, 5 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 52 °C durante 60 segundos (datos recogidos en la etapa de 52 °C). Todas las reacciones se realizaron por duplicado y contenían 40 nM de cebador directo, 100 nM de partzima A (las combinaciones como se enumeran en la Tabla 1), 200 nM de cebador inverso (3CCB), 200 nM de partzima B (CCBB/72-P), 200 nM de sustrato (Sub72-FIB), 8 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNAse (Bioline), 1x ImmoBuffer
30 (Bioline), 2 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline) y plantilla de ADNg (50 ng) o sin diana (H2O libre de nucleasa (NF H2O)).
Tabla 1: Combinaciones de cebador directo y partzima A
Tipo de reacción
Contenido Cebador directo Partzima A
(i) El extremo 3' del cebador directo es de 5 bases desde la unión de partzima
1_Control positivo
Estándar (sin cebador PASS) con emparejamiento de partzima A 5CCB_1 CCBA/72-P
1_Control negativo
Estándar (sin cebador PASS) con partzima A que contiene US 5CCB_1 CCB_li2A/72-P
1_Ensayo 1 Bucle
Cebador PASS en bucle con emparejamiento de partzima A 5CCB_1i2Loop
1_Ensayo 2 Planar
Cebador PASS Planar con emparejamiento de partzima A SCCB_1i2Planar
(ii) El extremo 3' del cebador directo es de 3 bases desde la unión de partzima
2_Control positivo
Estándar (sin cebador PASS) con emparejamiento de partzima A 5CCB_2 CCBA/72-P
2_Control negativo
Estándar (sin cebador PASS) con partzima A que contiene US SCCB_2 CCB_ 2i2A/72-P
2_Ensayo 1 Bucle
Cebador PASS en bucle con emparejamiento de partzima A 5CCB_2i2Loop
2_Ensayo 2 Planar
Cebador PASS Planar con emparejamiento de partzima A 5CCB_2i2Planar
(iii) El extremo 3' del cebador directo está en la unión de partzima
3_Control positivo
Estándar (sin cebador PASS) con emparejamiento de partzima A 5CCB_3 CCBA/72-P
3_Control negativo
Estándar (sin cebador PASS) con partzima A que contiene US SCCB_3 CCB_3i2A/72-P
52
imagen40
imagen41
imagen42
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 2
5G12_2i1Loop K562 Ensayo
SW620
Control negativo
Base de variante (tipo salvaje) 3ª desde extremo 3'
H2O Sin plantilla
5G12_2i1Planar
K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 3
5G12_LM3i1Loop G12_LMi1A/55-P K562 Ensayo
Variante (tipo salvaje)
SW620 Control negativo
H2O
Sin plantilla
base en extremo y desemparejamiento 2 bases 5' de variante
5G12_LM3ilPlanar K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 4
5G12_M4i1Loop G12_Mi1A/55-P K562 Ensayo
SW620
Control negativo
Base de variante (tipo salvaje) 3ª desde el extremo 3' y desemparejamiento 2 bases 5' de variante
H2O Sin plantilla
SG12_M4i1Planar
K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
G12V (sistemas de mutantes)
Diseño 1
5G12V_1i2Loop G12V_i2N55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
Base de variante (mutante) en extremo
H2O Sin plantilla
5G12V_1i2Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 2
5G12V_2i2Loop SW620 Ensayo
K562
Control negativo
Base de variante (mutante) 3ª desde extremo 3'
H2O Sin plantilla
5G12V_2i2Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 3
5G12V_LM3i2Loop G12V _LMi2A/55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
Base de variante (mutante) en extremo y desemparejamiento 2 bases 5' de variante
H2O Sin plantilla
5G12V_LM3i2Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Diseño 4
5G12V_M4i2Loop G12V_Mi2A/55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
Base de variante (mutante) 3ª desde extremo 3' y desemparejamiento 2 bases 5' de variante
H2O Sin plantilla
5G12V_M4i2Planar
SW620 Ensayo
56
imagen43
Control negativo
Sin Ct
Base de variante (tipo salvaje) en extremo; Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Sin plantilla
Planar
Ensayo 20,8 >19,2
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Diseño 4
Bucle Ensayo 24,7 12,9
Control negativo
37,6
Base de variante (tipo salvaje) 3ª desde el extremo 3'; Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Sin plantilla Sin Ct
Planar
Ensayo 24,8 >15,2
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
G12V mutante
Diseño 1 Bucle Ensayo 22,9 14,0
Control negativo
36,9
Sin plantilla
Sin Ct
Base de variante (mutante) en extremo
Planar Ensayo 22,6 13,7
Control negativo
36,4
Sin plantilla
Sin Ct
Diseño 2
Bucle Ensayo 20,0 7,1
Control negativo
27,1
Base de variante (mutante) 3ª desde extremo 3'
Sin plantilla Sin Ct
Planar
Ensayo 20,0 6,6
Control negativo
26,6
Sin plantilla
Sin Ct
Diseño 3
Bucle Ensayo 25,3 >14,7
Control negativo
Sin Ct
Base de variante (mutante) en extremo; Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Sin plantilla Sin Ct
Planar
Ensayo 22,8 13,9
Control negativo
36,7
Sin plantilla
Sin Ct
Diseño 4
Bucle Ensayo 25,0 10,4
Control negativo
35,4
Base de variante (mutante) 3ª desde el extremo 3'; Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Sin plantilla Sin Ct
Planar
Ensayo 24,3 12,1
Control negativo
36,5
Sin plantilla
Sin Ct
N.B. Cuando no se produjo Ct para una muestra de control negativo, se usó el Ct final de 50 para producir el ∆Ct y un símbolo mayor de (>) colocado delante para indicar que se esperaba que el ∆Ct fuera mayor que este valor.
Ejemplo 3: Comparación de la especificidad de los cebadores PASS con los cebadores ARMS mejorados con titubeo ambos combinados con MNAzimas para detectar cambios de bases individuales en la secuencia
5 En este ejemplo, la mutación puntual de KRAS en el codón 12 denominada G12V se ensaya frente a la secuencia de KRAS de tipo salvaje, G12. Los cebadores PASS planares se diseñaron para ser específicos para la secuencia G12V o la secuencia G12. La base de variante (G para tipo salvaje y T para mutante) se ubicó en la región específica diana 3' (S2), en el extremo 3' y se insertó un desemparejamiento 2 bases 5' de la base de variante
58
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Algunos cebadores directos tienen una región específica diana más larga (L). En las siguientes secuencias las bases en negrita hibridan con la secuencia diana, las bases subrayadas son las secuencias únicas que no están emparejadas con respecto a la plantilla de partida, las bases en negrita y subrayadas son la base de variante y las bases en cursiva representan una base adicional desemparejada (M) para ambas dianas. Todas las secuencias se
5 escriben de 5' a 3'.
SEQ ID NO: 26 Cebador inverso 3KRAS:
GGTCCTGCACCAGTAATATGC
SEQ ID NO: 32 Cebador PASS directo 5G12_LM3i1Planar:
10 CTGAAAATGACTGAATATAAACCACAATCAGTTGGAGCAGG SEQ ID NO: 40 Cebador PASS directo 5G12V_LM3i2Planar: CTGAAAATGACTGAATATAAACAGACATACTATGGAGCCGT SEQ ID NO: 45 Cebador WE-ARMS directo 5G12_M: TTGTGGTAGTTGGAGCAGG
15 SEQ ID NO: 46 Cebador WE-ARMS directo 5G12V_M:
CTTGTGGTAGTTGGAGCCGT
3.4. Secuencias diana
20 El ADNg humano extraído de la línea celular K562 se usó como plantilla para la amplificación in vitro del gen de tipo salvaje y el ADNg extraído de la línea celular SW620 se usó para la amplificación in vitro de la mutación puntual G12V.
3.5. Componentes de reacción: Amplificación y detección de la secuencia diana
25 La amplificación en tiempo real y la detección de la secuencia diana se realizó en un volumen de reacción total de 25 μl. Las reacciones se realizaron en un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96™ (BioRad). Los parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 64 °C durante 60 segundos (menos 1 °C por ciclo), 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 54 °C durante 50 segundos (datos
30 recogidos en la etapa de 54 °C). Todas las reacciones se realizaron por duplicado y contenían 40 nM de cebador directo y 100 nM de partzima A (combinaciones descritas en la Tabla 4), 200 nM de cebador inverso (3KRAS), 200 nM de partzima B (KRAS_B/55-P), 200 nM de sustrato (Sub55-FIB), 8 mM de MgCh, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNAase (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline) y la plantilla de ADNg K562 o SW620 (50 ng) o sin diana (NF H2O).
35
Tabla 4: Combinaciones de cebador/partzima para tipo salvaje y variante
Diseño
Cebador directo Partzima A Plantilla Tipo de reacción
G12
Diseño 3
5G12_LM3i1 Planar G12_LMi1A/55-P K562 Ensayo
Base de variante de tipo salvaje en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
SW620 Control negativo
H2O
Sin plantilla
WE-ARMS
5G12_M G12_MA/55-P K562 Ensayo
Base de variante de tipo salvaje en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
SW620 Control negativo
H2O
Sin plantilla
Control de reactividad cruzada
5G12_LM3i1 Planar G12V_LMi2A/55-P K562 Ensayo
Cebador PASS de tipo salvaje con partzima A de variante
SW620 Control negativo
H2O
Sin plantilla
G12V
Diseño 3
5G12V_ LM3 i2Planar G12V_LMi2A/55-P SW620 Ensayo
Base de variante (mutante) en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
K562 Control negativo
H2O
Sin plantilla
WE-ARMS
5G12V_M G12V_MA/55-P SW620 Ensayo
Base de variante (mutante) en extremo
K562 Control
60
Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
negativo
H2O
Sin plantilla
Control de reactividad cruzada
SW620 Ensayo
Cebador PASS de variante con partzima A de tipo salvaje
5G12V _LM3 i2Planar G12_LMilA/55-P K562 Control negativo
H2O
Sin plantilla
3.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
Los resultados de la amplificación usando cebadores PASS y cebadores WE-ARMS seguido de la detección usando 5 partzimas específicas de cebador se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Valores Ct para combinaciones de G12 y G12V
Diana
Diseño US insertada Tipo de reacción Ct (Prom.) ∆Ct
G12
PASS Diseño 3 Planar Ensayo 22,3 >17,7
Base de variante de tipo salvaje en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Control negativo Sin Ct
Sin plantilla
WE-ARMS
n/a Ensayo 28,3 >11,7
Base de variante de tipo salvaje en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Control negativo Sin Ct
Sin plantilla
Reactividad cruzada
Planar Ensayo Sin Ct n/a
Cebador PASS G12 con partzima G12V
Control negativo
Sin plantilla
G12V
PASS Diseño 3 Planar Ensayo 24,0 15,4
Base de variante mutante en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Control negativo 39,4^
Sin plantilla
Sin Ct
WE-ARMS
n/a Ensayo 21,6 14,8
Base de variante mutante en extremo Desemparejamiento 2 bases 5' de variante
Control negativo 36,4
Sin plantilla
Sin Ct
Reactividad cruzada
Planar Ensayo Sin Ct n/a
Cebador PASS G12V con partzima G12
Control negativo
Sin plantilla
^ Solo una de las 2 réplicas produjo una señal, por lo tanto, se usó el número de ciclo final de 40 para promediar el valor Ct. N.B. Cuando no se produjo Ct para una muestra de control negativo, se usó el Ct final de 50 para producir el ∆Ct y un símbolo mayor de (>) colocado delante para indicar que se esperaba que el ∆Ct fuera mayor que este valor.
El cebador PASS emparejado con la variante de tipo salvaje amplificó el alelo G12 en ADN de Ensayo K562 y esto
10 se detectó por la MNAzima que contenía una partzima A emparejada con amplicón de tipo salvaje y US1. Este sistema de cebador PASS de tipo salvaje/partzima fue específico para el alelo de tipo salvaje y no se generó ninguna señal cuando se usó una plantilla de Control negativo (SW620). No se observó reactividad cruzada cuando la partzima A específica para la variante mutante y la US2 se usaron junto con el cebador PASS de tipo salvaje.
15 El cebador WE-ARMS emparejado con la variante de tipo salvaje amplificó el alelo G12 en el ADN de Ensayo K562 que se detectó por la MNAzima que contenía una partzima A emparejada con amplicón de tipo salvaje. Este sistema de cebador ARMS de tipo salvaje/partzima fue específico para el alelo de tipo salvaje y no se generó ninguna señal cuando se usó una plantilla de Control negativo (SW620).
20 El cebador PASS emparejado con la variante mutante amplificó el alelo G12V en el ADN de Ensayo SW620 y se detectó por la partzima emparejada con el amplicón mutante y la US2. Este sistema de cebador PASS mutante/partzima amplificó preferiblemente y detectó el alelo mutante y la señal solamente se generó tarde en la
61
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imagen49
imagen50
imagen51
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
5G12_1i2Planar
K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Inserción 3 o 3a
5G12_1i3Loop G12_i3A/55-P K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
5G12_1i3aPlanar
K562 Ensayo
SW620
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Mutante G12V
Inserción 1 5G12V_1i1Loop G12V_i1A/55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
5G12V_1i1Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Inserción 2
5G12V_1i2Loop G12V_i2A/55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
5G12V_1i2Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
Inserción 3
5G12V_1i3Loop Gi2V_i3A/55-P SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
5G12V_1i3Planar
SW620 Ensayo
K562
Control negativo
H2O
Sin plantilla
6.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
Se usaron cebadores PASS que contenían diferentes US para producir amplicones para la detección en tiempo real
5 del KRAS de tipo salvaje y la mutación puntual (G12V). Esta reacción mostró un aumento en la fluorescencia en el tiempo cuando la secuencia diana utilizada fue ADNg humano de Ensayo (K562 y SW620, respectivamente) amplificado a través de PCR. La fluorescencia del control sin plantilla fue menor que la de las reacciones que contienen el diana de ADN y no aumentó durante la reacción. Esto demuestra que el aumento de la fluorescencia producida en las reacciones que contienen la diana se debe al ensamblaje dependiente de la diana de la MNAzima
10 catalíticamente activa que después escindió el sustrato indicador.
En reacciones que contenían cebador PASS G12 de tipo salvaje (Planar o Bucle) que comprendía las inserciones de US, i1, i2, i3 (Bucle) o i3a (Planar), los valores Ct para el ADN de "Ensayo" (K562) indicaron una amplificación y detección exitosas del alelo KRAS de tipo salvaje en K562, mientras que la falta de señal para el Control negativo
15 (SW620) indicó que el alelo mutante no se detecta con estos sistemas. Los ensayos de cebadores PASS (Bucle y Planar) que contenían las inserciones de US, i3 o i3a tenían un Ct inferior que para las inserciones de US, i1 y i2 (Tabla 10).
Tabla 10: Valores Ct para las combinaciones de cebador PASS y partzima para ensayos de tipo salvaje y 20 mutante
Diana
Diseño US insertada Tipo de reacción Ct (prom.) ∆Ct de Ensayo
Tipo salvaje G12
Inserción 1 Bucle Ensayo 24,8 n/a
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Planar
Ensayo 24,1 n/a
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Inserción 2
Bucle Ensayo 25,4 n/a
69
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Planar
Ensayo 26,6 n/a
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Inserción 3 o 3a
Bucle Ensayo 22,7 n/a
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Planar
Ensayo 23,7 n/a
Control negativo
Sin Ct
Sin plantilla
Mutante G12V
Inserción 1 Bucle Ensayo 21,5 12,6
Control negativo
34,1
Sin plantilla
Sin Ct
Planar
Ensayo 21,5 11,2
Control negativo
32,7
Sin plantilla
Sin Ct
Inserción 2
Bucle Ensayo 22,7 13,5
Control negativo
36,2
Sin plantilla
Sin Ct
Planar
Ensayo 22,5 13,9
Control negativo
36,4
Sin plantilla
Sin Ct
Inserción 3
Bucle Ensayo 20,8 12,7
Control negativo
33,5
Sin plantilla
Sin Ct
Planar
Ensayo 21,0 12,8
Control negativo
33,8
Sin plantilla
Sin Ct
En reacciones que contenían cebador PASS G12V (Planar o Bucle) que comprendía inserciones de US, i1, i2 o i3, los valores Ct para el ADN de "Ensayo" (SW620) indicaron una amplificación y detección exitosas del alelo KRAS mutante en SW620. La señal para el Control negativo (K562) alcanzó valores Ct de umbral como se muestra en la
5 Tabla 10 que indicaban que se produjo cierta señal de fondo cuando se usó una plantilla de tipo salvaje, sin embargo, los valores ∆Ct fueron lo suficientemente altos para permitir una clara discriminación de las secuencias mutantes y de tipo salvaje. Los ensayos de cebadores PASS (Bucle y Planar) que contenían la inserción de US i3 tenían Ct ligeramente inferiores que para las inserciones de US, i1 y i2 (Tabla 10), sin embargo el ∆Ct fue mayor con la inserción de US, i2.
10 En general, las tres inserciones de US fueron adecuadas para el análisis de las secuencias diana KRAS tanto de tipo salvaje como mutante. Hubo diferencias en los resultados con ligeramente más variabilidad observada en el ensayo de tipo salvaje que en el mutante evidente por el mayor rango de valores Ct obtenidos. Para ambos ensayos, la incorporación de la inserción de US, i3, dio como resultado valores Ct más bajos, mientras que la inserción de US,
15 i2 dio como resultado valores Ct más elevados. Sin embargo, el experimento demostró que se puede usar una diversidad de secuencias de inserción únicas diferentes para la amplificación y detección de la misma diana, o en diferentes dianas. Como tal, las secuencias únicas también se pueden considerar como secuencias únicas universales ya que pueden incorporarse en una amplia gama de ensayos analíticos.
20 Ejemplo 7: Comparación de la especificidad y la sensibilidad de un cebador PASS diseñado para amplificar la cadena del complemento a la obtenida usando un cebador PASS diseñado para amplificar el complemento inverso de KRAS en condiciones de termociclado estándar y rápidas.
En ejemplos previos, el cebador PASS diseñado para amplificar específicamente la mutación puntual KRAS en el
25 codón 12 denominado G12V se dirigió a la cadena del complemento. Esto dio como resultado que el cebador PASS terminara con una timina (T) y que tuviera un desemparejamiento T:C con la secuencia KRAS de tipo salvaje. Si el cebador PASS está diseñado para dirigirse a la cadena inversa, el cebador PASS terminaría con A cambiando el desemparejamiento con el tipo salvaje a un A:G.
70
imagen52
imagen53
1 en 10
26,1 23,7
1 en 100
29,3 27,2
1 en 1000
32,4 30,9
K562 (WT)
35,7 12,6 39,7 19,4
NTC
Sin Ct Sin Ct -
Calu1 (G12C)
34,3 11,3 48,5^ 28,2
A549 (G12S)
37,7 14,6 Sin Ct -
MB231 (G13D)
40,8 17,8 42,9^ 22,6
HCT116 (G13D)
37,7 14,7 Sin Ct
Eficiencia
109 % 91,4 %
Linealidad
0,999 0,992
Termociclado rápido
SW480 (G12V)
25,1 22,8
1 en 10
28,2 26,3
1 en 100
31,4 29,5
1 en 1000
34,9 24,5
K562 (WT)
39,6 14,5 45,4 22,6
NTC
Sin Ct - Sin Ct -
Calul (G12C)
38,2 13,1 Sin Ct -
A549 (G12S)
41,4 16,3 Sin Ct -
MB231 (G13D)
43,9 18,8 Sin Ct -
HCT116 (G13D)
42,1 16,9 48,1^ 25,3
Eficiencia
103 % 85 %
Linealidad
0,997 0,989
^ Solamente una de las 2 réplicas produjo una señal; Valor Ct no promediado
La plantilla de ADN SW480, específica para G12V, se diluyó en serie 10 veces en un fondo de la plantilla de K562 de tipo salvaje. Las diluciones en serie de ADN se amplificaron con el complemento o el cebador directo PASS de complementario inverso. Ambos conjuntos de cebadores fueron capaces de detectar la secuencia de G12V cuando
5 se diluyeron 1 en 1000 en un fondo de plantilla de tipo salvaje. Se generaron curvas estándar para ambos cebadores PASS representando el logaritmo de la concentración de ADN contra el ciclo umbral dando como resultado una representación lineal, el Ct de cada dilución se muestra en la Tabla 12. Los valores Ct mostrados en la tabla son un promedio de los resultados para las reacciones por duplicado. El coeficiente de correlación (R2), y la eficiencia de la reacción para cada diana también se muestran en la Tabla 12.
10 En condiciones de termociclado estándar, la diferencia en Ct (∆Ct) para el cebador PASS diseñado para la cadena del complemento entre el estándar superior (35 ng) y la señal de los controles negativos de tipo salvaje (K562), G12C (Calu1), G12S (A549) y G13D (MDA-MB231 y HCT116), era menor que para el cebador PASS diseñado para la cadena del complemento inverso (rcG12V). Además, algunos de los controles negativos para el ensayo de
15 rcG12V no produjeron un valor de Ct (Tabla 12). Esto indica que el ensayo de cebador PASS rcG12V puede ser más específico en estas condiciones experimentales.
Cuando los valores Ct generados en condiciones de termociclado rápido se compararon con las condiciones de termociclado estándar tanto para los ensayos G12V como rcG12V, hay un aumento en los ACt, lo que indica que los
20 tiempos de ciclo más cortos mejoran la especificidad de ambas reacciones (Tabla 12) en estas condiciones experimentales. Sin embargo, para el ensayo rcG12V, los tiempos de ciclado más rápidos redujeron la eficiencia y la linealidad de la reacción (Tabla 12).
El complemento y los ensayos de cebador PASS del complemento inverso para la amplificación y detección de 25 G12V presentan buena sensibilidad, detectando hasta 1 G12V (~10 copias) en un fondo de 1000 de tipo salvaje (
10.000 copias) tanto en termociclado estándar como rápido. En general, el ensayo rcG12V fue más específico que el ensayo G12V. La reducción de los tiempos de ciclado disminuyó la linealidad y la eficiencia de la reacción rcG12V, mientras que los tiempos de ciclado más rápidos aumentaron la especificidad del ensayo G12V sin afectar a la linealidad y la eficiencia.
30 Este ejemplo demuestra que la especificidad de un ensayo para un cambio de base individual puede verse influenciado por la cadena a la que el cebador PASS se une y se amplifica. Se pueden usar condiciones experimentales modificadoras adicionales tales como tiempos de ciclado para mejorar la especificidad de la
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minutos, 5 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 52 °C durante 60 segundos (datos recogidos en la etapa de 52 °C). Todas las reacciones se realizaron por duplicado y contenían 40 nM de cebador directo y 200 nM de partzima A (combinaciones enumeradas en la Tabla 17), 200 nM de cebador inverso (3CCB), 200 nM de partzima B (CCBB/2-P), 200 nM de sustrato (Sub2-FIB), 8
5 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNAase (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline) y plantilla de ADNg (50 ng) o sin diana (NF H2O).
Tabla 17: Combinaciones de cebador PASS directo y partzima A
Diseño
Tamaño (pb) S2 Cebador PASS Partzima A
Bucle original
7 5CCB_2i2Loop CCB_2i2A/2-P
Planar original
7 5CCB_2i2Planar
Reducción de S2 del cebador PASS desde el extremo 3' Partzima A emparejada para todos los cebadores
6 5CCB_2i2Loop3_6
5
5CCB_2i2Loop3_5
4
5CCB_2i2Loop3_4
3
5CCB_2i2Loop3_3
6
5CCB_2i2Planar3_6
5
5CCB_2i2Planar3_5
4
5CCB_2i2Planar3_4
3
5CCB_2i2Planar3_3
Reducción de S2 del cebador PASS desde el extremo 5' Partzima A emparejada para todos los cebadores
6 5CCB_2i2Loop5_6 CCB_2i2L5_6A/2-P
5
5CCB_2i2Loop5_5 CCB_2i2L5_5A/2-P
6
5CCB_2i2Planar5_6 CCB_2i2P5_6A/2-P
5
5CCB_2i2Planar5_5 CCB_2i2P5_5A/2-P
Controles
Bucle original, partzima A desemparejada
7 5CCB_2i2Loop CCB_2i2L5_6A/2-P
CCB_2i2L5_5A/2-P
Planar original, partzima A desemparejada
7 5CCB_2i2Planar CCB_2i2P5_6A/2-P
CCB_2i2P5_5A/2-P
Reducción de S2 del cebador PASS desde el extremo 5' Partzima A desemparejada para todos los cebadores
6 5CCB_2i2Loop5_6 CCB_2i2A/2-P
5
5CCB_2i2Loop5_5
6
5CCB_2i2Loop5_6
5
5CCB_2i2Loop5_5
10 10.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
Los cebadores PASS se usaron para producir amplicones para la detección en tiempo real y la cuantificación de CCB y las partzimas unidas tanto a la cUS como a la secuencia específica diana amplificada. Esta reacción mostró un aumento en la fluorescencia en el tiempo cuando la secuencia diana utilizada fue ADNg humano amplificado a
15 través de qPCR. La fluorescencia del control diana sin ADN fue menor que la de las reacciones que contienen el diana de ADN y no aumentó durante la reacción. Esto demuestra que el aumento de la fluorescencia producida en las reacciones que contienen la diana se debe al ensamblaje dependiente de la diana de la MNAzima catalíticamente activa que después escindió el sustrato indicador.
Tabla 18: Valores Ct para combinaciones de cebador PASS y partzima
Diseño
Partzima A Cebador PASS tamaño S2 Ct (prom.) ∆Ct de original
Original - 7 pb
21,5
Bucle
Emparejamiento extremo 3' - 6 pb 26,7 5,2
extremo 3' - 5 pb
30,2 8,7
82
extremo 3' - 4 pb
Sin Ct -
extremo 3' - 3 pb
Sin Ct -
extremo 5' - 6 pb
24,0 2,5
extremo 5' - 5 pb
Sin Ct -
Bucle de 1 base a partir del amplicón (5_6)
Original - 7 pb 22,6 1,1
Bucle de 2 bases a partir del amplicón (5_5)
Original - 7 pb 26,8 5,3
Bucle de 1 base a partir de la partzima 7
extremo 5' - 6 pb 24,6 3,1
Bucle de 2 bases a partir de la partzima (7)
extremo 5' - 5 pb Sin Ct -
Planar
Emparejamiento Original - 7 pb 21,3
extremo 3' - 6 pb
21,8 0,5
extremo 3' - 5 pb
22,5 1,3
extremo 3' - 4 pb
23,1 1,8
extremo 3' - 3 pb
25,6 4,3
extremo 5' - 6 pb
21,6 0,3
extremo 5' - 5 pb
22,7 1,4
Bucle de 1 base a partir del amplicón (5_6)
Original - 7 pb 22,2 0,9
Bucle de 2 bases a partir del amplicón (5_5)
Original - 7 pb 27,6 6,3
Bucle de 1 base a partir de la partzima (7)
extremo 5' - 6 pb 22,4 1,1
Bucle de 2 bases a partir de la partzima (7)
extremo 5' - 5 pb 27,7 6,4
Cuando la región S2 del cebador directo PASS que contenía la US que se arrolló se disminuyó de longitud desde el extremo 3' de 7, a 6 y 5 bases, los cebadores más cortos aún produjeron una señal detectable, sin embargo, el Ct se aumentó en 5,2 y 8,7 respectivamente (Tabla 18). La disminución de S2 más allá del extremo 3' no produjo una
5 señal detectable en las condiciones de reacción ensayadas. Cuando la región S2 del cebador PASS de bucle disminuyó desde el extremo 5' desde 7 bases a 6 bases, el Ct se aumentó en 2,5, sin embargo, la disminución de la longitud dio como resultado adicionalmente una señal no detectable en las condiciones de reacción ensayadas.
Cuando la región S2 del cebador PASS directo que contenía la US que era planar se disminuyó en longitud desde el
10 extremo 3' de 7, a 6 y 5 bases, todos los cebadores aún producían una señal detectable con poco impacto sobre el valor Ct (Tabla 18). La disminución de S2 adicionalmente desde el extremo 3' a 4 y 3 bases produjo aún una señal detectable, sin embargo, el Ct se aumentó en 1,8 y 4,3, respectivamente (Tabla 18). Cuando la región S2 del cebador PASS planar disminuyó desde el extremo 5' de 7 bases a 6 y 5 bases, se produjo aún una señal detectable sin impactar significativamente en el valor Ct (Tabla 18).
15 Como control, las partzimas específicas para cebadores PASS acortados se combinaron con el cebador PASS más largo y viceversa. Esto dio como resultado que las bases se arrollaran del amplicón o de la partzima. Tanto para los cebadores PASS en bucle como planares cuando solo una base se arrolla del amplicón o la partzima, solo hay un pequeño aumento en Ct en ~1, excepto en el cebador PASS de bucle donde la partzima en bucle de 1 base tenía un
20 Ct aumentado en 3,1 en estas condiciones experimentales. Además, cuando la partzima o amplicón contenían una región en bucle de 2 bases, el Ct se aumentó en ~5 a 6 Ct, a excepción del cebador PASS de bucle donde la partzima en bucle no tenía señal detectable en estas condiciones experimentales.
En general, cuando el cebador PASS contenía una US en formación planar, la región S2 podía reducirse a 4 bases
25 sin afectar excesivamente a la eficiencia de la reacción (valor Ct). Sin embargo, cuando el cebador PASS contenía una US en la formación de bucle que disminuía la región S2 incluso en 1 base, esto tuvo un impacto significativo en el valor Ct. Cabe apreciar que para los cebadores PASS de bucle no hay hueco entre S1 y S2 bajo la región de bucle que podría estar aumentando la rigurosidad de la reacción.
30 Las observaciones de este experimento demuestran que existe una flexibilidad considerable en el diseño de las regiones de los cebadores PASS que siguen el formato en Bucle o Planar. La longitud óptima para cualquier región dependerá de la secuencia diana, incluyendo la aplicación específica y las condiciones experimentales, pero sin limitación, el tampón, la concentración de sal, la temperatura de reacción, los tiempos de ciclo y otros factores.
35 Ejemplo 11: Investigación en la variación de la longitud de la inserción de US contenida en un cebador PASS
En este ejemplo, se investigó la longitud de la inserción de US en el cebador PASS para determinar la influencia
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plásmido v4 (1/100)
Ensayo
EGFR_1B/56-P y EGFR_1A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
EGFR v13 22392248>C
5EGFRv13 PASS plásmido v13 Ensayo
EGFR_2B/56-P y EGFR_2US15A/56-P
plásmido v13 (1/100) Ensayo
plásmido WT
Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Estándar
plásmido v13 Ensayo
plásmido v13 (1/100)
Ensayo
EGFR_1B/56-P y EGFR_1A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
EGFR v15 22392253del15
5EGFRv15 PASS plásmido v15 Ensayo
plásmido v15 (1/100)
Ensayo
EGFR_2B/56-P y EGFR_2US15A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Estándar
plásmido v15 Ensayo
plásmido v15 (1/100)
Ensayo
EGFR_1B/56-P y EGFR_1A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
EGFR v20 22402257del18
5EGFRv20 PASS plásmido v20 Ensayo
plásmido v20 (1/100)
Ensayo
EGFR_2B/56-P y EGFR_2US15A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Estándar
plásmido v20 Ensayo
plásmido v20 (1/100)
Ensayo
EGFR_1B/56-P y EGFR_1A/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
12.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
88
Para todas las reacciones, la fluorescencia del control sin plantilla fue menor que la de las reacciones que contenían la diana de ADN. Esto demuestra que el aumento de la fluorescencia producida en las reacciones que contienen la diana se debe al ensamblaje dependiente de la diana de las MNAzimas catalíticamente activas que después
5 escindió los sustratos indicadores universales.
Los cebadores directos específicos de deleción se usaron para producir amplicones para la detección en tiempo real de las variantes de deleción EGFR. El ∆Ct se utilizó como una medida de la especificidad de las combinaciones del cebador/partzima A y se calcula como la diferencia de Ct entre la de los amplicones de deleción a la de la
10 amplificación de fondo de la plantilla de tipo salvaje. Los cebadores diseñados para amplificar las deleciones v4 y v15 presentaron una alta especificidad para las deleciones con ∆Ct a 9,6 o mayor en todas las reacciones. Por el contrario, el cebador diseñado para ser específico para la deleción v20 se comportó de forma no específica, amplificando tanto v20 como la secuencia de tipo salvaje. El cebador diseñado para ser específico para v13 produjo ∆Ct de 6,6 y 4,8 para el ADNg de plásmido de tipo salvaje y de IM9 respectivamente al usar la partzima estándar.
15 Para los ensayos de partzima PASS v4 y v15, no se produjo una señal cuando se utilizó una plantilla de ADNg (IM9) en solitario y el plásmido WT produjo ∆Ct >15 Ct después de la plantilla de variante. Para v20, el ADNg plasmídico WT e IM9 produjo ∆Ct de 4,6 y 5,5, respectivamente, y para v13, el ADNg plasmídico WT e IM9 produjeron ∆Ct de 10,3 y 10,2 respectivamente (Tabla 21).
20 Tabla 21: Valores Ct para qPCR de MNAzima realizada usando cebadores específicos de deleción y una MNAzima universal
Diseño
Tipo de partzima A Plantilla Tipo de reacción Ct (Prom.) ∆Ct
EGFR v4
PASS plásmido v4 Ensayo 22,6
plásmido v4 (1/100)
Ensayo 31,8 -
plásmido WT
Control negativo 38,4 15,8
IM9
Control negativo Sin Ct >17,4
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
Estándar
V4 Ensayo 17,2
plásmido V4 (1/100)
Ensayo 23,9 -
WT
Control negativo 26,8 9,6
IM9
Control negativo 27,6 10,4
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
EGFR v13
PASS plásmido v13 Ensayo 20,1
plásmido v13 (1/100)
Ensayo 26,9 -
plásmido WT
Control negativo 30,3 10,3
IM9
Control negativo 30,4 10,2
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
Estándar
plásmido v13 Ensayo 18,2
plásmido v13 (1/100)
Ensayo 22,4 -
plásmido WT
Control negativo 24,6 6,6
IM9
Control negativo 23,0 4,8
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
EGFR v15
PASS plásmido v15 Ensayo 20,6
plásmido v15 (1/100)
Ensayo 28,2 -
plásmido WT
Control negativo 35,6 15
IM9
Control negativo Sin Ct >19,4
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
Estándar
plásmido v15 Ensayo 18,0
plásmido v15 (1/100)
Ensayo 24,4 -
plásmido WT
Control negativo 32,1 14,1
IM9
Control negativo 36,2 18,3
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
EGFR v20
PASS plásmido v20 Ensayo 20,1
plásmido v20 (1/100)
Ensayo 25,1
plásmido WT
Control negativo 24,7 4,6
IM9
Control negativo 25,7 5,5
89
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La amplificación en tiempo real y la detección de la secuencia diana se realizó en un volumen de reacción total de 25 μl. Las reacciones se realizaron en un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96™ (BioRad). Los parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 61 °C durante 60 5 segundos (menos 1 °C por ciclo), 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 52 °C durante 60 segundos (datos recogidos en la etapa a 52 °C). Cada conjunto de condiciones de reacción se ensayó por duplicado y contenía 40 nM de cebador directo específico de deleción, 100 nM de partzima A y 200 nM de partzima B como se describe en la Tabla 22. Todas las reacciones contenían 200 nM de cebador inverso (3EGFR), 200 nM de sustrato (Sub56-FIB), 8 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNase (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2
10 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline) y la plantilla de ADN plasmídico para v2 (104 copias), la plantilla de plásmido v2 (102 copias) diluida ~1 en 100 en un fondo constante de la plantilla de ADNg IM9 (35 ng) o ADNg plasmídico de tipo salvaje (WT) (104 copias), o IM9 (35 ng) o sin plantilla (NF H2O).
Tabla 22: Combinaciones de cebador, partzima y plantilla para los ensayos de variante
Reacción
Cebador directo Partzimas Plantilla Tipo de reacción
Cebador estándar/MNAzima estándar Sin US
5EGFRv2 EGFR_1 A/56-P plásmido v2 Ensayo
plásmido v2 (1/100)
Ensayo
plásmido WT
Control negativo
EGFR_1B/56-P
IM9 Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Cebador estándar/Partzima A en bucle US2 PASS únicamente
EGFR_2US15A/56-P plásmido v2 Ensayo
plásmido v2 (1/100)
Ensayo
plásmido WT
Control negativo
EGFR_ 2B/56-P
IM9 Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Cebador estándar/Partzima A planar US2 PASS únicamente
EGFR_ 2US9A/56-P plásmido v2 Ensayo
plásmido v2 (1/100)
Ensayo
EGFR_2B/56-P
plásmido WT Control negativo
IM9
Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
Cebador PASS/Partzima A en bucle US1 y US2 PASS
5EGFRv2_i4 EGFR_2i4US15 A/56-P plásmido v2 Ensayo
plásmido v2 (1/100
Ensayo
plásmido WT
Control negativo
EGFR_2B/56-P
IM9 Control negativo
NF H20
Sin plantilla
Cebador PASS/Partzima A Planar US1 y US2 PASS
EGFR_2i4US9A/56-P plásmido v2 Ensayo
plásmido v2 (1/100)
Ensayo
plásmido WT
Control negativo
EGFR_2B/56-P
IM9 Control negativo
NF H2O
Sin plantilla
13.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
92
Para todas las reacciones, la fluorescencia del control sin plantilla fue menor que la de las reacciones que contenían la diana de ADN. Esto demuestra que el aumento de la fluorescencia producida en las reacciones que contienen la diana se debe al ensamblaje dependiente de la diana de las MNAzimas catalíticamente activas que después
5 escindió el sustrato indicador universal.
Todas las combinaciones de cebadores y MNAzimas que contenían una partzima PASS dieron como resultado una mayor especificidad cuando se compararon con los ensayos que contenían cebadores estándar y MNAzima estándar (Tabla 23). El ∆Ct para la detección "estándar" totalmente emparejada de v2 varió de 6 a 7 Ct con la señal
10 de tipo salvaje solamente ~1 a 2 Ct detrás de la muestra diluida 1 en 100.

Tabla 23: Valores Ct para qPCR de MNAzima realizada usando cebadores específicos de variante y una MNAzima universal
Cebador directo
Partzima A Plantilla Tipo de reacción Ct (Prom.) ∆Ct
Estándar
Estándar
plásmido v2 Ensayo 16,6
plásmido v2 (1/100
Ensayo 21,9 -
plásmido WT
Control negativo 23,7 7,1
IM9
Control negativo 22,7 6,1
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
PASS en bucle (US2)
plásmido v2 Ensayo 25,3
plásmido v2 (1/100)
Ensayo 35,0 -
plásmido WT
Control negativo Sin Ct >14,7
IM9
Control negativo Sin Ct >14,7
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
PASS planar (US2)
plásmido v2 Ensayo 23,3
plásmido v2 (1/100)
Ensayo 31,8 -
plásmido WT
Control negativo 37,9 14,6
IM9
Control negativo 37,6 14,3
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
PASS (US1)
PASS en bucle (US2 y US1) plásmido v2 Ensayo 19,0
plásmido v2 (1/100)
Ensayo 26,3 -
plásmido WT
Control negativo 36,4 17,4
IM9
Control negativo 35,8 16,8
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
PASS planar (US2 y US1)
plásmido v2 Ensayo 18,2
plásmido v2 (1/100)
Ensayo 25,2 -
plásmido WT
Control negativo 36,0 17,8
IM9
Control negativo 35,9 17,7
NF H2O
Sin plantilla Sin Ct
N.B. Cuando no se produjo Ct para una muestra de control negativo, se usó el Ct final de 50 para producir el ∆Ct y un símbolo mayor de (>) colocado delante para indicar que se esperaba que el ∆Ct fuera mayor que este valor.
La combinación de un cebador estándar y una MNAzima compuesta por una partzima PASS que contenía
15 solamente US2 que forma una alineación planar con la secuencia diana detectó la v2 diana más temprana (Ct 23,3) en comparación con la partzima PASS que forma una alineación en bucle con la secuencia diana (Ct 25,3). Las partzimas PASS de bucle y planas mostraron una alta especificidad similar cuando se ensayaron con la plantilla de tipo salvaje (plásmido y ADNg), ∆Ct de ~14,5 (Tabla 23). Cuando la plantilla variante se diluyó 1 en 100, los ensayos v2 que contenían un cebador estándar y una partzima PASS que contenía solamente US2 podrían detectarlo y
20 discriminar la señal de la amplificación no específica del tipo salvaje con un ∆Ct de ~5 a 6 (Tabla 23).
La combinación de un cebador PASS y una MNAzima compuesta por una partzima PASS que contenía US2 y US1 que forma una alineación planar con la secuencia diana detectó la v2 diana ligeramente más temprana (Ct 18,2) en comparación con la partzima PASS que forma una alineación en bucle con la secuencia diana (Ct 19,0). El ensayo 25 que contenía las partzimas PASS planas mostró una especificidad ligeramente mayor en comparación con la partzima PASS en bucle cuando se ensayó con la plantilla de tipo salvaje (plásmido y ADNg). Cuando la plantilla
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variante KRAS G12S y el ADNg humano extraído de las líneas celulares IM9 y Calul se usaron como la plantilla de control negativo para la variante KRAS G12V.
17.5. Componentes de reacción: Amplificación y detección de la secuencia diana
La amplificación en tiempo real y la detección de la secuencia diana se realizó en un volumen de reacción total de 25 μl. Las reacciones se realizaron en un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96™ (BioRad). Los parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 64 °C durante 60 segundos, 50 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 54 °C durante 50 segundos (datos recogidos en la etapa de 54 10 °C). Las reacciones se realizaron por duplicado y contenían 40 nM de cebador PASS directo, 100 nM de partzima A, 200 nM de cebador inverso y 200 nM de partzima B (las combinaciones se enumeran en la Tabla 28). Todas las reacciones contenían 200 nM de sustrato (Sub55-FIB), 8 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNAase (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline). Se usaron 35 ng de la plantilla de ADNg A549 como un control positivo para la diana KRAS G12S y se usaron 35 ng
15 de SW480 (G12V), IM9 (WT), Calul (G12C) y MDA-MB231(MDA) (G13D) como controles negativos, se usaron 35 ng de la plantilla de ADNg SW480 como control positivo para la diana KRAS G12V y se usaron 35 ng de IM9 (WT) como control negativo y los controles adicionales no contenían diana (NF H2O).
Tabla 28: Combinaciones cebador/partzima para los ensayos de variantes
Diseño de cebador
Partzima A Cebador directo PASS Partzima B y cebador inverso N.º de bases diana entre S1 y S2 Tipo de US Nombre de diseño
Variante KRAS G12S
Cebadores PASS con USI
G12S_gi2A/55-P 5G12S_gi2Planar KRAS_B/55-P & 3KRAS 10 USI Planar/10
5G12S_LTi2(20)
20 USI Bucle/20
5G12S_LTi2(40)
40 USI Bucle/40
5G12S_LTi2(60)
60 USI Bucle/60
Cebador PASS de pinzamiento con USJ
G12S_LT10A/55-P SG12S_LT10 10 USJ Pinzamiento/10
Variante KRAS G12V
Cebadores PASS con USI
rcG12V_LMi1A/55-P 5rcG12V_LM3i1Loop rcKRAS_B/55-P y 3rcKRAS 1 USI Bucle/1
5rcGI2V_LTi1(20)
20 USI Bucle/20
5rcG12V_LTi1(40)
40 USI Bucle/40
5rcG12V_LTi1(60)
60 USI Bucle/60
5rcG12V_LTi1(100)
100 USI Bucle/100
SrcG12V_LTi1(200)
200 USI Bucle/200
Cebador PASS de pinzamiento con USJ
rcG12V_LT10A/55-P 5rcG12V_LT10 10 USJ Pinzamiento/10
rcG12V_LT100A/55-P
5rcG12V_LT100 100 USJ Pinzamiento/100
20
17.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
Los resultados de la amplificación y la detección se resumen en la siguiente Tabla 29. 25 Tabla 29: Valores Ct para combinaciones de cebador PASS y
partzima
Diseño
Nombre de diseño Ensayo Plantilla Ct (Prom.) ∆Ct de positivo
Variante KRAS G12S
Cebador PASS planar con USI (sin diana en bucle)
Planar/10 Positivo G12S (A549) 20,2
Negativo
WT (IM9) 33,7 13,4
Negativo
G12C 39,5 19,3
104
(Calul)
Negativo
G12V (SW480) 31,9 11,7
Negativo
G13D (MDA) 34,0 13,7
Cebadores PASS de bucle diana con USI (diana en bucle)
Bucle/20 Positivo G12S (A549) 23,2
Negativo
WT (IM9) 35,2 12,0
Negativo
G12C (Calul) 39,8 16,6
Negativo
G12V (SW480) 35,9 12,7
Negativo
G13D (MDA) 40,3 17,0
Bucle/40
Positivo G12S (A549) 26,4
Negativo
WT (IM9) 40,5 14,1
Negativo
G12C (Calul) 40,4* 14,1
Negativo
G12V (SW480) 39,8 13,4
Negativo
G13D (MDA) 41,4 15,0
Bucle/60
Positivo G12S (A549) 27,3
Negativo
WT (IM9) 39,9 11,6
Negativo
G12C (Calul) 41,2* 13,9
Negativo
G12V (SW480) 36,7 9,4
Negativo
G13D (MDA) 38,8 11,5
Cebador PASS de pinzamiento con una USJ (diana en bucle)
Pinzamiento/10 Positivo G12S (A549) 20,9
Negativo
WT (IM9) Sin Ct >29,1
Negativo
G12C (Calul) Sin Ct >29,1
Negativo
G12V (SW480) Sin Ct >29,1
Negativo
G13D (MDA) Sin Ct >29,1
Variante KRAS G12SV
Cebador PASS de bucle con USI (cebador en bucle)
Bucle/1 Positivo G12V (SW480) 18,5
Negativo
WT (IM9) 38,1 19,6
Cebador PASS de bucle diana con USI (diana en bucle)
Bucle/20 Positivo G12V (SW480) 21,5
Negativo
WT (IM9) 47,3 25,8
Bucle/40
Positivo G12V (SW480) 25,0
Negativo
WT (IM9) 46,6* 21,6
Bucle/60
Positivo G12V (SW480) 31,5
Negativo
WT (IM9) Sin Ct >18,5
Bucle/100
Positivo G12V (SW480) 32,9
Negativo
WT (IM9) Sin Ct >17,1
Bucle/200
Positivo G12V (SW480) 36,7
Negativo
WT (IM9) Sin Ct >13,3
Cebador PASS de pinzamiento con una USJ (diana en bucle)
Pinzamiento/10 Positivo G12V (SW480) 19,3
Negativo
WT (IM9) 37,0 17,7
Pinzamiento/100
Positivo G12V (SW480) 32,6
105
imagen78
imagen79
imagen80
imagen81
alelos
1 en 10 37,7 37,6
1 en 100
40,9 42,0
1 en 1000
43,6 50,2
35 ng K562
Sin Ct 49,1
∆Ct 35 ng de SW480 para K562
- 16,9
MNAzima genérica
35 ng de SW480 29,1 28,1
1 en 10
33,7 32,8
1 en 100
37,1 35,6
1 en 1000
39,8 36,4
35 ng K562
41,4 36,8
∆Ct 35 ng de SW480 para K562
12,3 8,7
Sonda TaqMan®
35 ng de SW480 26,4 25,7
1 en 10
31,2 30,1
1 en 100
34,8 32,3
1 en 1000
38,1 32,9
35 ng K562
38,7 32,7
∆Ct
12,3 7,0
35 ng de SW480 para K562

Ejemplo 19: Comparación de diferentes secuencia únicas (US) en cebadores PASS combinados con una lectura de MNAzima
5 En este ejemplo, se insertaron quince secuencias únicas (US) diferentes en el cebador PASS específico para el gen CCB. Los cebadores PASS que contenían la inserción de la US en una formación en bucle o planar contenida en la US i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, i4, i5, i5a, i6, i7, i8, i9, i10 o i11 (Tabla 32).
Los cebadores PASS se combinan con qPCR de MNAzima, por lo que las MNAzimas comprenden una primera
10 partzima que se une al complemento de la secuencia única (cUS), así como la secuencia diana amplificada que está adaptada para CCB. La segunda partzima se une de forma adyacente a la primera partzima en la secuencia diana amplificada de interés.
Los cebadores PASS y las partzimas se diseñaron para cada US para determinar si las diversas secuencias únicas 15 eran compatibles con la amplificación y detección de un gen.
Tabla 32: Número y secuencia para cada inserción de US
Número de inserción
Secuencia (5' a 3')
i1 (SEQ ID NO: 182)
CACAATCAGT
i1a (SEQ ID NO: 183)
CACAATGATG
i2 (SEQ ID NO: 184)
AGACATACTA
i2a (SEQ ID NO: 185)
AGACAGTTAC
i2b (SEQ ID NO: 186)
AGAGTCATTC
i3 (SEQ ID NO: 187)
CGTTGGCTAC
i4 (SEQ ID NO: 188)
TCAATACCAT
i5 (SEQ ID NO: 189)
GATTCGAGAA
i5a (SEQ ID NO: 190)
GATTCGAGTT
i6 (SEQ ID NO: 191)
GTTACCTGAA
i7 (SEQ ID NO: 192)
CATTAGTGCC
i8 (SEQ ID NO: 193)
CATTGACAGA
i9 (SEQ ID NO: 194)
CGAAAGCGAC
i10 (SEQ ID NO: 195)
CGTCTCATCA
i11 (SEQ ID NO: 196)
GGATTAGATC
19.1. Oligonucleótidos de partzima
110
imagen82
imagen83
SEQ ID NO: 239 Cebador PASS directo 5CCB_Pi11: CTCTTGTCTCAGTTCTTCTTGGGGATTAGATCCCAGAGC SEQ ID NO: 240 Cebador PASS directo 5CCB_Li11: TCAGTTCTTCTTGGATGGTCATGGATTAGATCCCAGAGC
5
19.4. Secuencia diana
El ADNg humano extraído de la línea celular IM9 se usó como la plantilla para la amplificación in vitro del gen CCB.
10 19.5. Componentes de reacción: Amplificación y detección de la secuencia diana
La amplificación en tiempo real y la detección de la secuencia diana se realizó en un volumen de reacción total de 25 μl. Las reacciones se realizaron en un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96™ (BioRad). Los parámetros de ciclado fueron 95 °C durante 2 minutos, 5 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 30
15 segundos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 52 °C durante 50 segundos (datos recogidos a 52 °C). Todas las reacciones se realizaron por duplicado y contenían 40 nM de cebador directo y 200 nM de partzima A (como se describe en la Tabla 33), 200 nM de cebador inverso (3CCB), 200 nM de partzima B (CCBB/2-P), 200 nM de sustrato (Sub2-FIB), 8 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe RNAase (Bioline), 1x ImmoBuffer (Bioline), 2 unidades de ADN polimerasa MyTaq™ HS (Bioline) y la plantilla de ADNg IM9 (50 ng) o
20 sin diana (NF H2O).
Tabla 33: Combinaciones de cebador directo PASS y partzima A.
Secuencia única
Partzima A Cebador directo PASS Tipo PASS
Inserción 1
CCB_2i1A/2-P 5CCB_Li1 Bucle
5CCB_Pi1
Planar
Inserción 1a
CCB_2i1aA/2-P 5CCB_Li1a Bucle
5CCB_Pi1a
Planar
Inserción 2
CCB_2i2A/2-P 5CCB_Li2 Bucle
5CCB_Pi2
Planar
Inserción 2a
CCB_2i2aA/2-P 5CCB_Li2a Bucle
5CCB_Pi2a
Planar
Inserción 2b
CCB_2i2bA/2-P 5CCB_Li2b Bucle
5CCB_Pi2b
Planar
Inserción 3
CCB_2i3A/2-P 5CCB_Li3 Bucle
5CCB_Pi3
Planar
Inserción 4
CCB_2i4A/2-P 5CCB_Li4 Bucle
5CCB_Pi4
Planar
Inserción 5
CCB_2i5A/2-P 5CCB_Li5 Bucle
5CCB_Pi5
Planar
Inserción 5a
CCB_2i5aA/2-P 5CCB_Li5a Bucle
5CCB_Pi5a
Planar
Inserción 6
CCB_2i6A/2-P 5CCB_Li6 Bucle
5CCB_Pi6
Planar
Inserción 7
CCB_2i7A/2-P 5CCB_Li7 Bucle
5CCB_Pi7
Planar
Inserción 8
CCB_2i8A/2-P 5CCB_Li8 Bucle
SCCB_Pi8
Planar
Inserción 9
CCB_2i9A/2-P 5CCB_Li9 Bucle
5CCB_Pi9
Planar
Inserción 10
CCB_2i10A/2-P 5CCB_Li10 Bucle
5CCB_Pi10
Planar
Inserción 11
CCB_2i11A/2-P 5CCB_Li11 Bucle
5CCB_Pi11
Planar
19.6. Resultados: Amplificación de diana y escisión del sustrato indicador
En reacciones que contenían el cebador PASS CCB (Planar y Bucle) que comprendían la US, i1, i1a, i2, i2a, i2b, i3, 113
imagen84
imagen85
imagen86
imagen87
imagen88
Control negativo
30,4
Planar
Ensayo 18,8 9,1
Control negativo
27,9
Inserción 2b
Bucle Ensayo 18,8 12,3
Control negativo
31,1
Planar
Ensayo 19,0 8,8
Control negativo
27,8
Inserción 3
Bucle Ensayo 19,5 15,3
Control negativo
34,8
Planar
Ensayo 19,5 8,0
Control negativo
27,5^
Inserción 4
Bucle Ensayo 19,0 12,4
Control negativo
31,4
Planar
Ensayo 18,9 11,1
Control negativo
30^
Inserción 5
Bucle Ensayo 18,6 11,4
Control negativo
30,0
Planar
Ensayo 19,8 10,5
Control negativo
30,2
Inserción 5a
Bucle Ensayo 18,6 12,6
Control negativo
30,5
Planar
Ensayo 18,8 9,9
Control negativo
28,7
Inserción 6
Bucle Ensayo 18,6 11,5
Control negativo
30,1
Planar
Ensayo 22,1 11,8
Control negativo
33,9
Inserción 7
Bucle Ensayo 18,9 18,5
Control negativo
37,4
Planar
Ensayo 17,9 8,2
Control negativo
26,1
Inserción 8
Bucle Ensayo 21,0 14,1
Control negativo
35,1
Planar
Ensayo 18,7 9,4
Control negativo
28,1
Inserción 9
Bucle Ensayo 21,3 16,0
Control negativo
37,3
Planar
Ensayo 18,4 8,6
Control negativo
27,0
Inserción 10
Bucle Ensayo 19,4 12,8
Control negativo
32,3
Planar
Ensayo 18,7 8,9
Control negativo
27,6
Inserción 11
Bucle Ensayo 19,0 10,7
Control negativo
29,7
Planar
Ensayo 20,9 10,1
Control negativo
31,0
^ solamente una réplica funcionó debido a un error experimental

Ejemplo 21: Comparación de la especificidad de una reacción de cebador PASS con una que combina un
En general, las quince US fueron adecuadas para el análisis de la secuencia diana de tipo salvaje. Hubo diferencias en los resultados con una variabilidad ligeramente mayor observada en los ensayos de cebadores PASS de Bucle que en los ensayos de cebadores PASS Planares, evidentes por el mayor rango de valores Ct obtenidos. Sin
5 embargo, el experimento demostró que puede usarse una diversidad de diferentes secuencias de inserción únicas para la amplificación y la detección de la misma diana y el cribado para encontrar la mejor combinación de cebador PASS/inserción de US puede ayudar a mejorar la especificidad de la reacción.
119
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imagen92
imagen93
más específico que el desemparejamiento A:A con un ∆Ct entre el ensayo y el control negativo de 15,4/14,2 (Bucle/Planar) frente a 12,6/14,0 (Bucle/Planar) para el desemparejamiento A:A (Tabla 40).
El cebador PASS con un desemparejamiento G:A en la posición 3 no pudo distinguir entre el ensayo y la plantilla de
5 control negativo, con ∆Ct negativos para los diseños de bucle y planares (Tabla 40). El análisis adicional de la secuencia de cebador PASS creada al tener una "G" insertada en la posición 3, opuesta a una "C" o "A" mostró que las 3 primeras bases en el extremo 3' de S2 podrían unirse a la plantilla de tipo salvaje 1 base 3' de donde la región S2 se unirá en la plantilla de variante, esta unión fue lo suficientemente fuerte como para que el cebador PASS ya no fuera específico para la variante. Esta es una característica importante que debe investigarse cada vez que se
10 diseña un cebador PASS, y es para verificar cualquier posible cebado erróneo que pueda surgir debido a la base de desemparejamiento seleccionada, en cualquier Ensayo o plantilla de control negativo.
Los cebadores PASS que contenían la base de desemparejamiento en la posición 2 desde el extremo 3' de S2, demostraron una especificidad aumentada con un ∆Ct que variaba de 15,0 a >24,0 (Tabla 40). Sin embargo, la 15 colocación del desemparejamiento en la posición 2 es más desestabilizador que en la posición 3 ya que los valores Ct de las reacciones de Ensayo también se aumentaron. El desemparejamiento C:C en la posición 2 fue más desestabilizador que C:A aumentando el Ct a 32,1/31,7 (bucle/planar), y también se aumento en casi 10 Ct más que los desemparejamientos de la posición 3 (Tabla 40). Se observó que el desemparejamiento A:C era menos desestabilizador y aumentaba solamente el Ct a ~25 para ambos cebadores PASS de bucle y planar, que es solo 3
20 Ct más que el mejor desemparejamiento en la posición 3. Cabe apreciarse que, con los cebadores PASS que contenían un desemparejamiento A:C en la posición 2 fue el único diseño en el que la US en formación de bucle mostró una ventaja sobre la US en formación planar con un ∆Ct de >24,3 en comparación con 15,0 para la formación planar (Tabla 40).
25 Los cebadores PASS con un desemparejamiento en la posición 4 también demostraron una buena especificidad en comparación con tener un desemparejamiento en la posición 3 con ∆Ct de 13,1/14,4 (bucle/planar) (Tabla 40).
Este ejemplo demuestra que la base desemparejada puede ubicarse en diversas posiciones en la región S2 del cebador PASS y aún mantener la eficacia, y que el tipo de desemparejamiento se puede adaptar para evitar
30 cualquier posible cebado erróneo o estructura secundaria.
Tabla 40: Valores Ct para cebador G12V PASS frente a WE-ARMS
Posición de desemparejamiento y desemparejamiento
US insertada Tipo de reacción Ct ∆Ct de Ensayo
3 y C:A
Bucle Ensayo 22,7 15,4
Control negativo
38,0
Planar
Ensayo 22,5 14,2
Control negativo
36,6
3 y G:A
Bucle Ensayo 27,8 -1,0
Control negativo
26,8
Planar
Ensayo 27,0 -0,5
Control negativo
26,5
3 y A:A
Bucle Ensayo 24,2 12,6
Control negativo
36,8
Planar
Ensayo 23,9 14,0
Control negativo
37,8
2 y C:C
Bucle Ensayo 32,1 >17,9
Control negativo
Sin Ct
Planar
Ensayo 31,7 >18,3
Control negativo
Sin Ct
2 y A:C
Bucle Ensayo 25,8 >24,3
Control negativo
Sin Ct
Planar
Ensayo 25,3 15,0
Control negativo
40,3
4 y A:G
Bucle Ensayo 23,7 13,1
Control negativo
36,8
Planar
Ensayo 23,0 14,4
Control negativo
37,4
125
imagen94
imagen95
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imagen97
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imagen99
imagen100

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    imagen6
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