CN107034277B

CN107034277B - 一种检测低丰度基因突变的方法

Info

Publication number: CN107034277B
Application number: CN201710284773.0A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 许晔; 梁斌
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN107034277A

Abstract

本发明涉及低丰度基因突变的检测。特别地，本发明提供了一种通过自淬灭探针熔解曲线分析的检测待测核酸样品中的核酸分子是否存在突变的方法。此外，本发明还提供了包含自淬灭探针和引物组的试剂盒，所述试剂盒可用于实施本发明的方法。

Description

一种检测低丰度基因突变的方法

技术领域

背景技术

基因突变是指DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，是一种可遗传的变化，在自然界各物种中普遍存在。细菌在复制繁殖过程中会发生随机突变，某些突变会导致细菌对药物产生抗性，这些突变称为耐药突变。在基因诊断中，检测细菌的耐药突变，尤其在异质性耐药(同时存在敏感菌和耐药菌)样本中检测出低比例的耐药突变，对鉴定耐药患者，指导个体化用药具有重要的意义。例如，在结核分枝杆菌耐药诊断中，作为金标准的传统药敏试验可以检测到1％的耐药菌，但目前的分子方法均无法检测出1％的耐药突变(Folkvardsen D B et al,2013,J.Clin.Microbiol.51(5):1596-9)。再有，肿瘤基因突变多是发生在实体瘤中的体细胞突变，表现为混杂有大量正常野生型基因组的稀有突变，其低比例突变直接影响到靶向药物的治疗效果。因此，在大量野生型基因组背景下检测出低比例突变尤为重要。

虽然有多种分子检测方法，但是在灵敏度和简便性上还无法达到满意的要求。许多检测基因组DNA低频突变的方法是利用聚合酶链式反应(PCR)来扩增突变型和野生型靶序列，扩增产物可用多种方法进行分析，包括测序，限制性酶切、质谱或者等位基因特异探针杂交等方法均可实现从野生背景下鉴定突变型。由于这些方法以相同的扩增效率扩增野生型和突变型模板，加上方法本身的分辨率较低，灵敏度不足以检测低频突变。例如，sanger测序作为分子检测方法的“金标准”，但是在大量野生背景下只能检测出10-20％的突变型。膜杂交方法是利用固定在膜条上特异性野生型探针和突变型探针与PCR产物杂交显色，也只能检测出5％的突变型。

COLD-PCR是指在低变性温度下，富集突变型基因组，扩增产物可用于后续测序检测，大大提高突变检出率。在COLD-PCR的基础上，有研究发展了TT-COLD-PCR用于降低COLD-PCR对于温度的敏感性(Castellanosrizaldos,E.,Liu,P.,Milbury,C.A.,et al.(2012).Clinical Chemistry,58(7),1130-8)，ice-COLD-PCR技术(Milbury C A,Li J,Makrigiorgos G M.2011.Nucleic Acids Research,39(1):50-60)引入寡核苷酸“夹子”压制野生型基因组，可更有效地富集突变型基因组，E-ice-COLD-PCR(How K A,MazaleyratN,Daunay A,et al.2013.Human Mutation,34(11):1568–1580)使用LNA修饰的“夹子”，压制野生基因组扩增，富集突变，效果优于ice-COLD-PCR。这些方法需要结合测序进行检测，提高了检测突变的选择性，降低假阴性，但是仍需PCR后处理，操作繁琐，并容易造成污染。

扩增阻碍突变系统(ARMS)，利用等位基因特异性突变引物进行PCR，引物的3’端与突变型模板匹配，引物得以延伸，而野生型模板与引物的3’端不匹配而无法延伸。但是，ARMS技术只能针对已知突变，对引物的设计要求较高，容易出现假阳性的结果，且难以实现多重检测，反应管数较多。

Huang J F等人(Huang J F,Zeng D Z,Duan G J,et al.2015.Plos One,10(12):e0145698)报道了一种阻抑野生型PCR(WTB-PCR)，利用引物的3’端和阻抑子具有重叠部分引起的结合模板的竞争。由于阻抑子和野生型模板完全匹配而紧密结合，从而阻碍了引物的退火，而对于突变型模板，因为错配导致阻抑子和突变型无法杂交，则引物正常退火得到扩增。在这里，阻抑子只起到阻碍野生扩增的作用，产物的检测仍然需要加入Taqman探针，最终看扩增信号判读突变与否。中国专利申请(201110190758.2)公开了一种检测稀有突变的方法，利用寡核苷酸探针代替上述方法的阻抑子。该探针不仅阻碍引物退火于野生型模板，还用于扩增产物的检测。但是，如果在检测的点突变附近区域有较强的二级结构，引物的杂交效率明显降低，直接影响到引物和阻抑子之间的竞争作用。

因此，提供一个灵敏且简便设计的低丰度突变检测方法对核酸诊断领域，尤其是耐药基因突变及肿瘤相关基因突变的筛查具有重要意义。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“突变”是指，核酸分子在结构上发生的碱基或碱基对组成或排列顺序的改变。突变可以是单个碱基的改变，也可以是两个或两个以上的碱基的改变，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失。

如本文中所使用的，术语“野生型”是指，在自然界或天然繁殖种群中最经常观察到的基因或等位基因。相反地，术语“突变体”或“突变型”是指，与野生型相比其核酸序列表现出差异的基因或等位基因。在本发明中，对于耐药相关基因而言，术语“野生型”意指，对特定药物敏感的菌株的基因或等位基因；相反地，术语“突变型”意指，对该药物耐药的菌株的、且发生了突变的基因或等位基因。

如本文中所使用的，术语“互补”是指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston-Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。如本文中所使用的，术语“完全互补”是指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。

如本文中所使用的，术语“错配”是指，两条核酸序列中所存在的对应位置的碱基不满足碱基配对原则(Waston-Crick原则)的现象。

如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”是指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。

如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“所述第一引物位于所述自淬灭探针的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与所述自淬灭探针与靶序列的杂交区域相比，所述第一引物与该靶序列的杂交区域位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)，且上述两个杂交区域无重叠。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。

如本文中所使用的，术语“待检区域”是指，在PCR扩增过程中，自淬灭探针与待测核酸分子杂交的区域。在本发明中，所述待检区域包含期望检测的基因。

如本文中所使用的，术语“自淬灭探针”是指，一条寡核苷酸，其标记有报告基团和淬灭基团。当该探针未与其他序列杂交时，淬灭基团位于能够吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于报告基团的邻近)，从而吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述探针不发出信号。进一步，当所述探针与其互补序列杂交时，淬灭基团位于不能吸收或淬灭报告基团的信号的位置(例如，淬灭基团位于远离报告基团的位置)，从而无法吸收或淬灭报告基团发出的信号。在这种情况下，所述探针发出信号。

自淬灭探针的设计在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可在所述探针的5'末端标记报告基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述探针的3'末端标记报告基团而在5'末端标记淬灭基团。由此，当所述探针单独存在时，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述探针不发出信号；而当所述探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述探针发出信号。

然而，应当理解的是，报告基团和淬灭基团并非必须标记在自淬灭探针的末端。报告基团和/或淬灭基团也可以标记在探针的内部，只要所述探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。例如，可将报告基团标记在探针的上游(或下游)，而将淬灭基团标记在探针的下游(或上游)，并且二者相距足够的距离(例如相距10-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，或更长的距离)。由此，当所述探针单独存在时，由于探针分子的自由卷曲或者探针的二级结构(例如发夹结构)的形成，所述报告基团与所述淬灭基团彼此接近并相互作用，使得所述报告基团发出的信号被所述淬灭基团吸收，从而使得所述探针不发出信号；并且，当所述探针与其互补序列杂交时，所述报告基团与所述淬灭基团相互分离足够的距离，使得所述报告基团发出的信号不能被所述淬灭基团吸收，从而使得所述探针发出信号。

在某些优选的实施方案中，所述报告基团为荧光基团。在此类实施方案中，报告基团发出的信号即为荧光，并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如，能够吸收所述荧光的另一荧光分子，或者能够淬灭所述荧光的淬灭剂)。在某些优选的实施方案中，所述荧光基团包括但不限于各种荧光分子，例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。在某些优选的实施方案中，所述淬灭基团包括但不限于各种淬灭剂，例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。

在本发明中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的自淬灭探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，自淬灭探针能够通过碱基配对作用与其互补序列形成双链体。在此情况下，探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团彼此分离，淬灭基团无法吸收报告基团发出的信号(例如荧光信号)，此时，能够检测到最强的信号(例如荧光信号)。随着温度的升高，双链体的两条链开始解离(即，探针逐渐从其互补序列上解离)，并且解离下的探针呈单链自由卷曲状态。在此情况下，解离下的探针上的报告基团(例如荧光基团)和淬灭基团互相靠近，由此报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)被淬灭基团所吸收。因此，随着温度的升高，所检测到信号(例如荧光信号)逐渐变弱。当双链体的两条链完全解离时，所有的探针均呈单链自由卷曲状态。在此情况下，所有检测探针上的报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)都被淬灭基团所吸收。因此，基本上无法检测到报告基团(例如荧光基团)发出的信号(例如荧光信号)。因此，对包含探针的双链体在升温或降温过程中发出的信号(例如荧光信号)进行检测，就能观察到探针与其互补序列的杂交和解离过程，形成信号强度随着温度变化而变化的曲线。进一步，对所获得的曲线进行求导分析，可获得以信号强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的曲线(即，该双链体的熔解曲线)。该熔解曲线中的峰即为熔解峰，其所对应的温度即为所述双链体的熔解温度(Tm值)。在本文中，术语“熔解峰”、“熔解温度”和“Tm值”具有相同的含义，并且可互换使用。

如本文中所使用的，术语“熔解温度”或“Tm”是指，在核酸分子(例如DNA)热变性过程中，有50％核酸分子(例如DNA)变性解链时的温度，又称“熔点”，其可通过实验检测或理论计算得到，例如通过DNAMAN、TM Utility、Primer 5.0等软件计算得到。通常而言，探针与靶序列的匹配程度越高(例如，错配的碱基越少，配对的碱基越多)，那么双链体的Tm值就越高。因此，通过检测双链体的Tm值，可确定双链体中与探针互补的靶序列的存在和身份。

如本文中所使用的，术语“核酸样品”是指，含有或推测含有核酸的任何物质，包括从个体分离的组织或流体，或其纯化部分，例如，体液(如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、痰液、胆汁、滑液、尿液、泪液、精液、乳腺分泌物、唾液、关节液、腹水、胸膜积液、羊水)或组织(如全血、正常组织、肿瘤组织或石蜡包埋组织)，并且也包括体外细胞培养物。

在本发明中，所述核酸样品包含或假定包含各种形式的核酸，例如基因组DNA，线粒体DNA，cDNA，mRNA，质粒，粘粒，酵母人工染色体，或人造多核苷酸。在本发明中，所述核酸样品中的核酸可以来自于病毒、细菌、真菌、植物或动物，例如细菌(如结核分枝杆菌)或动物(如哺乳动物，如人)。

本发明的发明人经过大量实验和反复摸索，开发出一种基于自淬灭探针熔解曲线分析技术的低丰度基因突变的检测方法，并进一步提供了基于该检测方法的试剂盒，由此完成了本发明。

因此，在一个方面，本发明提供了一种检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在突变的方法，其包括以下步骤：

1)提供至少一种自淬灭探针，所述自淬灭探针与野生型核酸分子的待检区域完全互补，并且所述自淬灭探针与野生型核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度(Tm1)高于其与存在突变的核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度(Tm2)；

2)提供包含第一引物和第二引物的引物组，所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在突变的核酸分子，且扩增的产物包括所述自淬灭探针与核酸分子的杂交区域；所述第一引物与所述自淬灭探针与待测核酸分子的同一条链杂交，并且，在杂交时，所述第一引物位于所述自淬灭探针的上游，且两者不重叠；

3)将待测核酸分子与步骤1)中所述的自淬灭探针和步骤2)中所述的引物组混合，并进行PCR扩增和熔解曲线分析；和

4)根据熔解曲线分析的结果来判定待测核酸分子是否存在突变；

其中，在步骤3)中，所述PCR扩增的延伸温度不高于Tm1；并且，采用不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶(如KlenTaq)进行PCR扩增。

在某些优选的实施方案中，所述核酸样品中的所述存在突变的核酸分子以低丰度存在，例如所述存在突变的核酸分子在所有待测核酸分子中的比例不高于50％，不高于40％，不高于30％，不高于20％，不高于10％，不高于5％，不高于1％，不高于0.5％，不高于0.1％，或不高于0.01％。

在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含疾病相关基因、耐药相关基因或毒力基因。在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含疾病相关基因，例如肿瘤相关基因，包括但不限于K-ras，H-ras，N-ras，p53，CDKN2A(p16)，PIC3K，PTEN，RB1，表皮生长因子受体基因，BRAF，BRCA1，BRCA2，STK11或VHL。在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含耐药相关基因，例如结核分枝杆菌耐药相关基因,其包括但不限于rrs(如GeneID:2700429),rpoB(如Gene ID:888164)，gyrA(如Gene ID:887105)，rpsL(如Gene ID:888259)，embB(如Gene ID:886126)，pncA(如Gene ID:888260),katG(如GeneID:885638),inhA(如Gene ID:886523)或ahpC(如Gene ID:885717)。在某些实施方案中，所述待检区域包含katG(如GeneID:885638)或inhA(如Gene ID:886523)。

在某些优选的实施方案中，所述突变为单个碱基的转换或颠换。

在某些优选的实施方案中，所述PCR扩增的退火温度低于第一引物和第二引物的Tm值。

在某些优选的实施方案中，所述PCR扩增的延伸温度介于Tm1和Tm2之间；或者，所述PCR扩增的延伸温度不高于Tm2。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，进行不对称PCR扩增。在此类实施方案中，使用不等量的第一引物和第二引物进行扩增。在某些优选的实施方案中，所述第二引物相对于第一引物而言是过量的(例如过量至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，例如过量10-20倍)。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针不具备抵抗DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性的修饰。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针包含能够增强探针结合能力的核苷酸类似物，例如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针在与存在突变的核酸分子发生错配的位点上的核苷酸替换为所述核苷酸类似物。

在某些优选的实施方案中，在步骤4)中，根据熔解曲线分析中是否有相应的熔解峰和/或Tm值的高低来判定待测核酸分子是否存在突变。

在某些优选的实施方案中，所述Tm1值高于所述Tm2值至少5℃，例如为至少8℃，至少10℃，至少15℃；其中，Tm1值和Tm2值均可通过本领域熟知的方法进行实验或理论计算获得。在某些优选的实施方案中，所述Tm1值高于所述Tm2值至少8℃。

在某些优选的实施方案中，在步骤2)中，所述第一引物与待测核酸分子杂交的第一区域位于所述待检区域上游，所述第二引物与待测核酸分子杂交的第二区域位于所述待检区域下游；并且所述第一区域与待检区域不重叠。某些优选的实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔至少1个核苷酸，例如至少2个，至少5个，至少8个或至少10个核苷酸，例如10～1000个核苷酸，例如10～500个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔100～200个核苷酸，例如110～120个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔1～30个核苷酸，例如10～20个核苷酸。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针的长度为10-100个碱基，优选的是15-50个碱基，例如20-30个碱基。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针的5’末端标记荧光基团(或淬灭基团)，其3’末端标记淬灭基团(或荧光基团)。

在本发明中，所述自淬灭探针在5’末端标记荧光基团(或淬灭基团)，3’末端标记淬灭基团(或荧光基团)，因此，探针在没有与待检区域杂交时，荧光基团和淬灭基团互相作用，导致荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，因而探针本身的荧光很弱；探针在与待检区域杂交时，能够形成双链结构，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因而杂交后探针的荧光增加。

在本发明中，所述荧光基团包括目前各种荧光标记物，如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。

在本发明中，所述淬灭基团包括目前各种淬灭剂，如DABCYL、BHQ类(如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针还可以采用有利于熔解曲线分析的二级结构，优选的是采用发夹结构，尤其是探针末端形成臂结构的发夹结构。这种末端形成臂结构的方式，多数情况下需要在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。具体实现方式是，在探针的一端或者两端添加一定数目的靶序列无关碱基，使得两端形成人工发夹结构。添加无关碱基的规则是，发夹结构中的臂序列部分中，需要有部分或者全部与靶序列互补，而且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4－7个或4-6个碱基之间。这样做的目的是保证发夹结构与靶序列之间杂交有足够高的效率，使之可以有效用地于熔解曲线分析。

在某些优选的实施方案中，本发明的自淬灭探针的待检区域可以是一个，所述待检区域包含具有一种或多种突变的待测等位核酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的自淬灭探针的待检区域可以是两个或两个以上，所述各待检区域各包含具有一种或多种突变的待测等位核酸序列，优选针对每个待检区域分别设计并制备相应的自淬灭探针，并对每条自淬灭探针标记不同的荧光基团，通过扩增反应完成后的自淬灭探针熔解曲线分析，根据各个自淬灭探针Tm值的变化情况，判断对应区域的核酸序列是否存在突变。

在本发明中，所述自淬灭探针在一个检测体系中的数目可以是单个，也可以是多个。在使用多个自淬灭探针时，可通过使用不同的荧光标记基团进行标记而实现各自淬灭探针的彼此区分，从而达到增加待检区域数目的目的。在此类实施方案中，所述各自淬灭探针分别与野生型模板所形成的双链杂交体的Tm值(即，各自淬灭探针的Tm1值)相同或基本相同。本领域技术人员理解，术语“基本相同”随相关领域技术人员所理解的情景而变化，例如，在本发明中，表述“各自淬灭探针的Tm1值基本相同”是指，各探针的Tm1值彼此相差不超过3℃，不超过2℃，不超过1℃，不超过0.5℃，不超过0.2℃或不超过0.1℃。

在某些优选的实施方案中，所述核酸样品包含或假定包含各种形式的核酸，例如基因组DNA，线粒体DNA，cDNA，mRNA，质粒，粘粒，酵母人工染色体，或人造多核苷酸；任选地，所述核酸样品还包含从一个或多个个体中分离得到的组织或体液。在某些优选的实施方案中，所述核酸样品中的核酸来自于病毒、细菌、真菌、植物或动物，例如细菌(如结核分枝杆菌)或动物(如哺乳动物，如人)。在某些优选的实施方案中，所述核酸样品可以来自于受试者的体液或组织，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、痰液、胆汁、滑液、尿液、泪液、精液、乳腺分泌物、唾液、关节液、腹水、胸膜积液、羊水、全血、正常组织、肿瘤组织或石蜡包埋组织)，并且也包括体外细胞培养物。

在某些优选的实施方案中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因(例如，katG或inhA)点突变。在某些优选的实施方案中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变和inhA点突变，其中，所述待测核酸分子包括包含katG基因的待检区域以及包含inhA基因的待检区域；在步骤1)中，提供具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第一自淬灭探针，和具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第二自淬灭探针。

在某些实施方案中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变，其中，所述待检区域包含katG基因；所述自淬灭探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并且所述第一引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物任选地具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因inhA点突变，其中，所述待检区域包含inhA基因；所述自淬灭探针具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，并且所述第一引物具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第二引物任选地具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的基本原理如图1所示，当探针与待测核酸分子的待检区域完全互补时，形成的双链结构较为稳定，使DNA双链解开所需温度较高，故Tm值也较高；探针与该待检区域不完全互补时，形成的双链结构较不稳定，使双链解开所需温度较低，故Tm值也较低，而且Tm降低的程度也是依赖不完全互补的具体序列的。

基于上述理论，本发明的自淬灭探针(特别是包含LNA的自淬灭探针)与待检区域杂交形成双链结构，与完全匹配的野生型模板杂交时，则形成的双链结构的Tm值较高，若与不完全匹配的突变体杂交时，形成的双链结构Tm值较低。因此，在适当延伸温度下，探针与野生型模板所形成的双链结构由于Tm值高而无法解开，从而阻滞了引物延伸，抑制野生型模板的扩增；同时，探针与突变体所形成的双链结构由于Tm值低而解开，从而使得突变体正常扩增，已达到富集突变体的目的。

与此同时，自淬灭探针在熔解曲线分析过程中，低温阶段与待检区域杂交，这时探针与待检区域形成刚性、稳定的双链结构，荧光基团与淬灭基团距离较远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因此可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，探针逐渐从待检区域上解离，解离下的探针呈单链自由卷曲状态，探针标记的荧光基团和淬灭基团互相靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团所吸收，此时只能检测到微弱的荧光信号。对自淬灭探针在熔解曲线分析过程中进行荧光信号的检测，就能观察到探针与待检区域的杂交和解离过程，形成荧光强度随着温度变化而变化的曲线，即探针的熔解曲线，对熔解曲线求导分析，就可以找到荧光变化最强的点(即，熔解峰)以及对应的温度(即，Tm值)；当待测核酸样品中突变体以一定比例出现时，熔解曲线中会出现Tm1和Tm2两个熔解峰，当待测核酸样品中仅含有突变型模板时，熔解曲线中只会出现Tm2熔解峰，当待测核酸样品中仅含有野生型模板时，熔解曲线中只会出现Tm1熔解峰，从而判断突变的存在与否。在本发明中，可以在检测体系中加入野生型或突变型核酸分子的参照序列，当待测核酸分子与野生型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认为其为野生型；当与突变型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认为其为突变型。或者，在不含有上述参照序列时，也可以根据实验前预测得到Tm值和熔解峰的位置对结果进行判定。

因此，自淬灭探针在本发明中有双重作用，作为阻滞物抑制野生型模板的扩增以富集突变体，同时作为检测分子，在熔解曲线分析中被测定。

尽管上文描述了本发明假设的原理，但是，本发明的范围并不受到这些原理的限制。

在另一个方面，本发明提供了一种检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在突变的试剂盒，其包含至少一种自淬灭探针、和至少一对引物组，其中：

所述自淬灭探针与野生型核酸分子的待检区域完全互补，并且所述自淬灭探针与野生型核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度(Tm1)高于其与存在突变的核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度(Tm2)；和

所述引物组包含第一引物和第二引物，该引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在突变的核酸分子，且扩增的产物包括所述自淬灭探针与核酸分子的杂交区域；所述第一引物与所述自淬灭探针与待测核酸分子的同一条链杂交，并且，在杂交时，所述第一引物位于所述自淬灭探针的上游，且两者不重叠。

在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含疾病相关基因、耐药基因或毒力基因。在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含疾病相关基因，例如肿瘤相关基因，包括但不限于K-ras，H-ras，N-ras，p53，CDKN2A(p16)，PIC3K，PTEN，RB1，表皮生长因子受体基因，BRAF，BRCA1，BRCA2，STK11或VHL。在某些优选的实施方案中，所述待检区域包含耐药相关基因，例如结核分枝杆菌耐药相关基因,其包括但不限于rrs(如GeneID:2700429),rpoB(如Gene ID:888164)，gyrA(如Gene ID:887105)，rpsL(如Gene ID:888259)，embB(如GeneID:886126)，pncA(如Gene ID:888260),katG(如GeneID:885638),inhA(如Gene ID:886523)或ahpC(如Gene ID:885717)。在某些实施方案中，所述待检区域包含katG(如GeneID:885638)或inhA(如Gene ID:886523)。

在某些优选的实施方案中，所述第二引物相对于第一引物而言是过量的(例如过量至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，例如过量10-20倍)。

在某些优选的实施方案中，所述第一引物与待待测核酸分子杂交的第一区域位于所述待检区域上游，所述第二引物与待测核酸分子杂交的第二区域位于所述待检区域下游；并且所述第一区域的与待检区域不重叠。某些优选的实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔至少1个核苷酸，例如至少2个，至少5个，至少8个或至少10个核苷酸，例如1～1000个核苷酸，例如10～500个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔100～200个核苷酸，例如110～120个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一区域的3’端与待检区域的5’端相隔1～30个核苷酸，例如10～20个核苷酸。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针不具有抵抗DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性的修饰，这种情况下，所述试剂盒任选地还包含不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶(如KlentTaq)。

在某些优选的实施方案中，所述自淬灭探针的5’末端标记荧光基团(或淬灭基团)，探针的3’末端标记淬灭基团(或荧光基团)。

在某些优选的实施方案中，所述荧光基团选自如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL

Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。

在某些优选的实施方案中，所述淬灭基团选自DABCYL、BHQ类(如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

在某些优选的实施方案中，本发明的自淬灭探针的待检区域可以是两个或两个以上，所述各待检区域各包含具有一种或多种突变的待测等位核酸序列，优选针对每个待检区域分别设计并制备相应的自淬灭探针，并对每条自淬灭探针标记不同的荧光基团，通过扩增反应完成后的自淬灭探针熔解曲线分析，根据各个自淬灭探针熔解温度的变化情况，判断对应区域的核酸序列是否存在突变。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含一个或多个本发明的自淬灭探针。在使用多个自淬灭探针时，可通过使用不同的荧光标记基团进行标记而实现各自淬灭探针的彼此区分，从而达到增加待检区域数目的目的。在此类实施方案中，所述各自淬灭探针分别与野生型模板所形成的双链杂交体的Tm值(即，各自淬灭探针的Tm1值)相同或基本相同。本领域技术人员理解，术语“基本相同”随相关领域技术人员所理解的情景而变化，例如，在本发明中，表述“各自淬灭探针的Tm1值基本相同”是指，各探针的Tm1值彼此相差不超过3℃，不超过2℃，不超过1℃，不超过0.5℃，不超过0.2℃或不超过0.1℃。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒用于检测核酸样品中的核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因(例如，katG或inhA)点突变。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒用于检测核酸样品中的核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变和inhA点突变，其中所述试剂盒包含：

第一自淬灭探针，其具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和

第二自淬灭探针，其具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒用于检测核酸样品中的核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变，其中所述试剂盒包含：

1)具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的自淬灭探针；

2)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第一引物；和

3)第二引物；

任选地，所述第二引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒用于检测核酸样品中的核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因inhA点突变，其中所述试剂盒包含：

1)具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的自淬灭探针；

2)具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的第一引物；和

3)第二引物；

任选地，所述第二引物具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含任选的其它核酸扩增反应的必须组分，例如包括耐热核酸聚合酶(如KlenTaq聚合酶)，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等。这些组分的选择、浓度的设定等均为本领域所公知。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含野生型或突变型核酸分子的参照序列。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案至少具有以下有益效果：本发明通过阻碍引物延伸以富集低丰度突变，并通过对PCR产物的熔解曲线分析来判断核酸分子中低丰度突变的有无，并可进一步地采用不同标记的自淬灭探针实现对多种低丰度突变的同时检测，该方法可检测出低至0.01％的基因突变。该方法属于均相检测系统，PCR扩增完成后只需要进行简单的熔解曲线分析就可以完成检测，整个过程可以无需开盖，既可以在同一台荧光PCR仪上完成，也可以在普通扩增仪上扩增后再转移到荧光PCR仪器进行熔解曲线分析，因此操作简便、灵活，而且由于整个过程闭管操作，不易造成PCR产物污染。同时，该方法在引物、探针设计和扩增条件优化上也更为灵活、简便。本发明提供的检测方法克服了现有技术中操作繁琐、耗时长、易污染及检测通量不能满足常规需求等缺点，在低丰度突变检测尤其是结核分枝杆菌耐药突变检测中具有很好的应用前景。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1示意性地描述了本发明方法的一个示例性实施方案，以阐释本发明方法的基本原理。

图2显示了使用阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法对katG基因点突变的熔解曲线分析结果。结果显示，该方法可检测出0.01％的基因突变。

图3显示了使用阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法对inhA基因点突变的熔解曲线分析结果。结果显示，该方法可检测出0.01％的基因突变。

图4显示了使用阻碍引物退火的自淬灭探针熔解曲线法对katG基因点突变的熔解曲线分析结果。结果显示，该方法仅能检测出高于0.1％的基因突变。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

SEQ ID NO:	描述
		1	引物KatG-F1
2	引物KatG-R1
		3	自淬灭探针KatG-p1
4	引物F2
		5	引物inhA-F2
6	引物inhA-R2
		7	自淬灭探针inhA-p2
8	野生型katG基因重组质粒
		9	突变型katG基因重组质粒
10	野生型inhA基因重组质粒
		11	突变型inhA基因重组质粒

序列1(SEQ ID NO:1)：

CGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAAGA

序列2(SEQ ID NO:2)：

TCGTCAGCTCCCACTCGTAGCCGTA

序列3(SEQ ID NO:3)：

TCGATCACCAGCGGCATCGAG

序列4(SEQ ID NO:4)：

CCGGTAAGGACGCGATCACCA

序列5(SEQ ID NO:5)：

CGTTACGCTCGTGGACATACCGATTT

序列6(SEQ ID NO:6)：

TGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCC

序列7(SEQ ID NO:7)：

GCGGCGAGACGATAGGTTGTC

序列8(SEQ ID NO:8)：

CGGTCACACTTTCGGTAAGACCCATGGCGCCGGCCCGGCCGATCTGGTCGGCCCCGAACCCGAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGT

序列9(SEQ ID NO:9)：

CGGTCACACTTTCGGTAAGACCCATGGCGCCGGCCCGGCCGATCTGGTCGGCCCCGAACCCGAGGCTGCTCCGCTGGAGCAGATGGGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGT

序列10(SEQ ID NO:10)：

GCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAAACC

序列11(SEQ ID NO:11)：

GCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGGAGGAAACC

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力考察

结核分枝杆菌的过氧化氢酶编码基因(katG)第315位密码子由丝氨酸(Ser，S)发生碱基突变成为苏氨酸(Thr，T)(AGC→ACC)，就会导致对一线药物异烟肼(INH)的耐药。本实施例以该点突变(katG S315T(AGC→ACC))为例，考察了阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力。

1.1引物和探针的合成

本实例设计了针对katG基因的LNA修饰的自淬灭探针及引物组，确保扩增子中含有该突变位点。正向引物为F1，反向引物为R1，探针为p1。引物和探针序列均委托上海生工合成，引物用ULTRAPAGE纯化，探针用HPLC纯化。探针的5’端FAM标记，3’端BHQ1标记。所用的自淬灭探针、引物序列如下表所示。

表2：检测katG S315T AGC-ACC的引物和探针序列

注：下划线表示用锁核苷酸(LNA)修饰。

1.2DNA模板准备

通过分子克隆的方法分别构建野生型和突变型质粒，克隆载体为PMD-18T(购自TaKaRa)。构建完成后，通过测序验证。

野生型质粒：(SEQ ID NO：8)

突变型质粒：(SEQ ID NO：9)

然后把野生型和突变型质粒分别调整到10⁴copies/μl。按下述方法配置不同浓度的模板：

10％组：取10μl 10⁴copies/μl的突变型质粒并混入90μl同浓度的野生型质粒，振荡混匀。用于后续1％组的制备。

5％组：取5μl 10⁴copies/μl的突变型质粒并混入95μl同浓度的野生型质粒，振荡混匀。

1％组：取10μl 10％组的混合液并混入90μl 10⁴copies/μl的野生型质粒，振荡混匀。

0.5％组：取10μl 5％组的混合液并混入90μl 10⁴copies/μl的野生型质粒，振荡混匀。

0.1％组：取10μl 1％组的混合液并混入90μl 10⁴copies/μl的野生型质粒，振荡混匀。

0.01％组：取10μl 0.1％组的混合液并混入90μl 10⁴copies/μl的野生型质粒，振荡混匀。

野生型对照组：10⁴copies/μl的野生质粒。

1.3PCR反应体系和程序设定

反应体系按表3配置，每次实验均设置野生型对照和无模板对照。1×PCR buffer(75mM Tris-HCl(pH＝9.0),20mM(NH4)₂SO₄,0.01％(V/V)Tween20)，KlenTaq-S(购自美国Jem Biotech Inc.)。反应程序如表4所示。

表3：PCR反应体系

组分名称	终浓度
		PCR buffer	1x
MgCl<sub>2</sub>	3.5mM
		dNTP	0.2mM
KatG正向引物	0.06μM
		KatG反向引物	1.2μM
KatG探针	0.4μM
		KlenTaq-S	0.75U
无菌超纯水	12.45μl
		DNA模板	5μl
总体积	25μl

表4：PCR反应程序

1.4熔解曲线分析

当实验在荧光PCR仪(SLAN-96S)上运行结束后，根据其配套的软件对本次实验的结果进行熔解曲线结果分析，首先以阴性对照的噪音信号强度设置一个阈值，当某一熔解峰信号大于该阈值，软件判读为阳性信号峰，并给出熔点值；其次，以野生型模板的熔解曲线作为对照，当样本出现阳性信号峰，并且熔点低于野生熔点3℃以上，该阳性信号峰判读为突变峰。结果如图2所示，野生对照出现野生熔解峰，阴性对照没有熔解峰出现，说明检测体系可以有效扩增，且没有污染。5％和纯突变型只出现突变峰，1％、0.5％、0.1％和0.01％同时出现野生峰和突变峰。

上述结果表明，结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变可以通过本发明提供的阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线分析方法进行检测，且可以检出低至0.01％的突变型基因。

实施例2.阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力考察

本实施例以结核分枝杆菌inhA基因启动子区域点突变-15C→T为例，考察了阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力。

2.1引物和探针的合成

本实例设计了针对inhA基因启动子区域的LNA修饰的自淬灭探针及引物组，确保扩增子中含有该突变位点。正向引物为F2，反向引物为R2，探针为p2。引物和探针序列均委托上海生工合成，引物用ULTRAPAGE纯化，探针用HPLC纯化。探针的5’端ROX标记，3’端BHQ2标记。所用的自淬灭探针、引物序列如下表所示。

表5：检测inhA启动子-15C→T的引物和探针序列

注：下划线表示用锁核苷酸(LNA)修饰。

2.2DNA模板准备

野生型质粒：(SEQ ID NO：10)

突变型质粒：(SEQ ID NO：11)

野生型对照组：10⁴copies/μl的野生质粒。

2.3PCR反应体系和程序设定

反应体系按表8配置，每次实验均设置野生型对照和无模板对照。1×PCR buffer(75mM Tris-HCl(pH＝9.0),20mM(NH4)₂SO₄,0.01％(V/V)Tween20)，KlenTaq-S(购自美国Jem Biotech Inc)。反应程序如表9所示。

表8：PCR反应体系

组分名称	终浓度
		PCR buffer	1x
MgCl<sub>2</sub>	3.5mM
		dNTP	0.2mM
inhA正向引物	0.06μM
		inhA反向引物	0.6μM
inhA探针	0.2μM
		KlenTaq-S	1U
无菌超纯水	12.9μl
		DNA模板	5μl
总体积	25μl

表9：PCR反应程序

2.4熔解曲线分析

当实验在荧光PCR仪(SLAN-96S)上运行结束后，根据其配套的软件对本次实验的结果进行熔解曲线结果分析，首先以阴性对照的噪音信号强度设置一个阈值，当某一熔解峰信号大于该阈值，软件判读为阳性信号峰，并给出熔点值；其次，以野生型模板的熔解曲线作为对照，当样本出现阳性信号峰，并且熔点低于野生熔点3℃以上，该阳性信号峰判读为突变峰。结果如图3所示，野生对照出现野生熔解峰，阴性对照没有熔解峰出现，说明检测体系可以有效扩增，且没有污染。纯突变型只出现突变峰，5％、1％、0.5％、0.1％和0.01％同时出现野生峰和突变峰。

上述结果表明，结核分枝杆菌异烟肼耐药基因inhA点突变可以通过本发明提供的阻碍引物延伸的自淬灭探针熔解曲线分析方法进行检测，且可以检出低至0.01％的突变型基因，进一步说明本发明提供的方法特别适用于检测低丰度的基因突变，具有极高的灵敏度。

实施例3.阻碍引物退火的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力考察

本实施例以与实施例1中相同的点突变(katG S315T(AGC→ACC))为例，考察了阻碍引物退火的自淬灭探针熔解曲线法用于低丰度突变检测的能力。

3.1引物与探针的设计

首先根据其基因序列设计引物对和探针，确保扩增子中含有该突变位点。正向引物为F2，本实施例中的反向引物(R1)和自淬灭探针(p1)均与实施例1中相同。其中，正向引物F2与探针具有一段重叠的序列，因此F2与探针可竞争性的结合待测核酸序列的待检区域，当所述区域中不存在突变时，探针与靶序列结合牢固，从而阻碍了引物的退火，进而抑制了野生型模板的扩增；当所述区域存在突变时，探针的结合不牢固，因此F2有更高的机会退火，使得突变型模板有效扩增，达到富集突变的目的。

引物和探针序列均委托上海生工合成，引物用ultrapage纯化，探针用HPLC纯化。探针的5’端FAM标记，3’端BHQ1标记。探针及引物序列如下表所示。

表8：检测katG S315T AGC-ACC的引物和探针序列

注：下划线表示用锁核苷酸(LNA)修饰；加框字母表示正向引物与探针重叠的序列。

3.2DNA模板准备

同实施例1.2。

3.3PCR反应体系和程序设定

反应体系按表9配置，每次实验均设置野生型对照和无模板对照。1×PCR buffer(75mM Tris-HCl(pH＝9.0),20mM(NH4)₂SO₄,0.01％(V/V)Tween20)，TaqHS(购自TaKaRa)。反应程序如表10所示。

表9：PCR反应体系

组分名称	终浓度
		PCR buffer	1x
MgCl<sub>2</sub>	3.5mM
		dNTP	0.1mM
KatG正向引物	0.05μM
		KatG反向引物	0.2μM
KatG探针	0.25μM
		TaqHS	0.5U
无菌超纯水	13.225μl
		DNA模板	5μl
总体积	25μl

表10：PCR反应程序

3.4熔解曲线分析

采用与实施例1.4中相同的方法进行熔解曲线分析，结果如图4所示，野生对照出现野生熔解峰，阴性对照没有熔解峰，说明检测体系可以有效扩增，且没有污染。纯突变型模板出现正常的突变峰，5％、1％和0.5％组同时出现野生峰和突变峰，0.1％组、0.01％组与野生型组的线型一致，在突变峰位置都出现小鼓包但无阳性信号峰出现，说明本实施例的方法不能检测出0.1％和0.01％丰度的基因突变。

上述结果表明，阻碍引物退火的自淬灭探针熔解曲线分析方法仅能检测出丰度大于0.1％的基因突变，相比之下，本发明的检测方法可以检出低达0.01％的基因突变，这说明本发明的检测方法对低丰度基因突变的检测灵敏度高出现有技术至少10倍，这样的技术效果是显著的和出人意料的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种检测低丰度基因突变的方法

<130> IDC160078

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

cgtcggcggt cacactttcg gtaaga 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcgtcagctc ccactcgtag ccgta 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 3

tcgatcacca gcggcatcga g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ccggtaagga cgcgatcacc a 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgttacgctc gtggacatac cgattt 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tgaaggggcc aaacccccat tcgtatccc 29

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 7

gcggcgagac gataggttgt c 21

<210> 8

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组质粒

<400> 8

cggtcacact ttcggtaaga cccatggcgc cggcccggcc gatctggtcg gccccgaacc 60

cgaggctgct ccgctggagc agatgggctt gggctggaag agctcgtatg gcaccggaac 120

cggtaaggac gcgatcacca gcggcatcga ggtcgtatgg acgaacaccc cgacgaaatg 180

ggacaacagt ttcctcgaga tcctgtacgg ctacgagt 218

<210> 9

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组质粒

<400> 9

cggtcacact ttcggtaaga cccatggcgc cggcccggcc gatctggtcg gccccgaacc 60

cgaggctgct ccgctggagc agatgggctt gggctggaag agctcgtatg gcaccggaac 120

cggtaaggac gcgatcacca ccggcatcga ggtcgtatgg acgaacaccc cgacgaaatg 180

ggacaacagt ttcctcgaga tcctgtacgg ctacgagt 218

<210> 10

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组质粒

<400> 10

gcgaaagttc ccgccggaaa tcgcagccac gttacgctcg tggacatacc gatttcggcc 60

cggccgcggc gagacgatag gttgtcgggg tgactgccac agccactgaa ggggccaaac 120

ccccattcgt atcccgttca gtcctggtta ccggaggaaa cc 162

<210> 11

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组质粒

<400> 11

gcgaaagttc ccgccggaaa tcgcagccac gttacgctcg tggacatacc gatttcggcc 60

cggccgcggc gagatgatag gttgtcgggg tgactgccac agccactgaa ggggccaaac 120

ccccattcgt atcccgttca gtcctggtta ccggaggaaa cc 162

Claims

1.一种用于非诊断目的的检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在突变的方法，其包括以下步骤：

1)提供至少一种自淬灭探针，所述自淬灭探针与野生型核酸分子的待检区域完全互补，并且所述自淬灭探针与野生型核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度Tm1高于其与存在突变的核酸分子所形成的双链杂交体的熔解温度Tm2；

其中，在步骤3)中，所述PCR扩增的延伸温度介于Tm1和Tm2之间；并且，采用不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶进行PCR扩增；

所述核酸样品中的所述存在突变的核酸分子以低丰度存在。

2.权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述PCR扩增的退火温度低于第一引物和第二引物的Tm值。

3.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，进行不对称PCR扩增。

4.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言是过量的。

5.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言过量至少2倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少15倍，或至少20倍。

6.权利要求3所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述第二引物相对于第一引物而言过量过量10-20倍。

7.权利要求1所述的方法，其中，所述Tm1值高于所述Tm2值至少5℃，至少8℃，至少10℃，或至少15℃。

8.权利要求1所述的方法，其中，所述不具备5’→3’核酸外切酶活性的耐热核酸聚合酶是KlenTaq。

9.权利要求1所述的方法，其中，所述存在突变的核酸分子在所有待测核酸分子中的比例不高于50％，不高于40％，不高于30％，不高于20％，不高于10％，不高于5％，不高于1％，不高于0.5％，不高于0.1％，或不高于0.01％。

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述待检区域包含疾病相关基因、耐药相关基因或毒力基因。

11.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述突变为单个碱基的转换或颠换。

12.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针不具备抵抗DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性的修饰。

13.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针包含能够增强探针结合能力的核苷酸类似物。

14.权利要求13所述的方法，其中，所述核苷酸类似物选自锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。

15.权利要求13所述的方法，其中，所述自淬灭探针在与存在突变的核酸分子发生错配的位点上的核苷酸替换为所述核苷酸类似物。

16.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针的5’末端标记荧光基团，其3’末端标记淬灭基团。

17.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述自淬灭探针的5’末端标记淬灭基团，其3’末端标记荧光基团。

18.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，在步骤1)中，提供至少两种自淬灭探针，所述每种自淬灭探针标记不同的荧光基团，并且，所述各自淬灭探针的Tm1值相同或基本相同。

19.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述待检区域包含结核分枝杆菌耐药相关基因。

20.权利要求19所述的方法，其中，所述结核分枝杆菌耐药相关基因选自rrs,rpoB，gyrA，rpsL，embB，pncA,katG,inhA或ahpC。

21.权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变和inhA点突变，其中，所述待测核酸分子包括包含katG基因的待检区域以及包含inhA基因的待检区域；在步骤1)中，提供具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列的第一自淬灭探针，和具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的第二自淬灭探针。

22.权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变，其中，所述待检区域包含katG基因；所述自淬灭探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并且所述第一引物具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

23.权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于检测核酸样品中的待测核酸分子是否存在结核分枝杆菌异烟肼耐药基因inhA点突变，其中，所述待检区域包含inhA基因；所述自淬灭探针具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，并且所述第一引物具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第二引物具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。