CN112322733A - 检测egfr基因突变的核酸组合物及试剂盒和egfr基因突变的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测EGFR基因突变的核酸组合物及试剂盒和EGFR基因突变的检测方法。该检测EGFR基因突变的核酸组合物包括:序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针;序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针。上述核酸组合物对EGFR基因突变的特异性较高,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,特别是涉及一种检测EGFR基因突变的核酸组合物及试剂盒和EGFR基因突变的检测方法。
背景技术
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)即表皮生长因子受体,是原癌基因C-erbB-1(HER1)的表达产物,定位于细胞膜上,是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起着重要作用的膜蛋白。
目前EGFR基因突变检测的主要方法有以下几种:1)Sanger测序法;直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准,但是测序法存在很多缺点,比如耗时长,后续要对PCR产物进行处理,程序复杂,容易出现污染导致结果不准确。另外,测序法的灵敏度低,特别是在混合模板时检出率低,一般需要突变丰度达到20%以上才能准确检测。2)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)是通过饱和染料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,其敏感性在5%左右。3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此,设计针对基因突变位点的引物序列,可以检测突变基因,该检测方法的灵敏度在1%左右。这些方法的检测灵敏度较低,不能满足实际需求。
发明内容
基于此,有必提供一种灵敏度较高的检测EGFR基因突变的核酸组合物。
此外,还有必要提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒和EGFR基因突变的检测方法。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针,所述第一引物对和所述第一探针用于检测EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变中的至少一种;及
序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针,所述第二引物对和所述第二探针用于检测EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变;
其中,所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第一引物对及第一探针对EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变,第二引物对和第二探针对EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变中的一种,且能够检测0.1%的20号外显子的D770_N771insG突变,灵敏度较高。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ ID No.9所示的第三探针,所述第三引物对和所述第三探针用于检测EGFR基因的19号外显子的缺失突变,所述EGFR基因的19号外显子的缺失突变包括:E746_A750del(1)突变、E746_T751>I突变、E746_T751del突变、E746_T751>A突变、E746_S752>A突变、E746_S752>V突变、E746_A750del(2)突变、E746_S752>D突变、L747_A750>P突变、L747_T751>Q突变、L747_E749del突变、L747_T751del突变、L747_S752del突变、L747_A750>P突变、L747_P753>Q突变、L747_T751>S突变、L747_P753>S突变、L747_T751>del突变及L747_T751>P突变中的至少一种。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ ID No.12所示的第四探针,所述第四引物对和所述第四探针用于检测EGFR基因的20号外显子的T790M突变。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ ID No.15所示的第五探针,所述第五引物对和所述第五探针用于检测EGFR基因的20号外显子的S768I突变。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ ID No.16及SEQ IDNo.17所示的第六引物对和序列如SEQ ID No.18所示的第六探针,所述第六引物对和所述第六探针用于检测EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ ID No.19及SEQ IDNo.20所示的第七引物对和序列如SEQ ID No.21所示的第七探针,所述第七引物对和所述第七探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L861Q突变。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ ID No.22及SEQ IDNo.23所示的第八引物对和序列如SEQ ID No.24所示的第八探针,所述第八引物对和所述第八探针用于检测EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变。
一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ ID No.25及SEQ IDNo.26所示的第九引物对和序列如SEQ ID No.27所示的第九探针,所述第九引物对和所述第九探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L858R突变。
其中一个实施例中,还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针。
其中一个实施例中,所述内控基因为CFTR基因,所述第十引物对的序列如SEQ IDNo.28及SEQ ID No.29所示,所述第十探针的序列如SEQ ID No.30。
一种检测EGFR基因突变的试剂盒,包括上述检测EGFR基因突变的核酸组合物。
其中一个实施例中,所述检测EGFR基因突变的核酸组合物还包括:还包括质控引物对和质控探针。
其中一个实施例中,所述质控引物对的序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示,所述质控探针的序列如SEQ ID No.33所示。
其中一个实施例中,还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
一种EGFR基因突变的检测方法,包括如下步骤:
向待测样品中加入上述检测EGFR基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应,根据反应结果进行检测分析。
其中一个实施例中,突变检测反应体系包括:2mM的MgCl2,50mM、pH8.3的Tris,500mg/L的BSA,100μM的dNTPs,0.4μL的酶Ⅰ混合液,0.1μM的正向引物,0.5μM的反向引物,0.5μM的探针。
附图说明
图1为人EGFR基因18外显子G719C突变检测能力测试图;
图2为人EGFR基因19外显子EXON-19-E746_A750del(2)突变检测能力测试图;
图3为人EGFR基因20外显子T790M突变检测能力测试图;
图4为人EGFR基因20外显子S768I突变检测能力测试图;
图5为人EGFR基因21外显子L861Q突变检测能力测试图;
图6为人EGFR基因20外显子in9插入突变检测能力测试;
图7为人EGFR基因21外显子L858R突变检测能力测试。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究第一实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针,第一引物对和第一探针用于检测EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变中的至少一种。序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针,第二引物对和第二探针用于检测EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变。
其中,第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第一引物对及第一探针对EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变,第二引物对和第二探针对EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变中的一种,且能够检测0.1%的20号外显子的D770_N771insG突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.1所示的序列为:CGAACGCACCGGAGGG。如SEQ ID No.2所示的序列为:CCAACCAAGCTCTCTTGAGG。如SEQ ID No.3所示的序列为:CCGCACCGGAGCCCAGCACTTTGTGCGG。如SEQ ID No.4所示的序列为:GCGCACACGTGGGGGTT。如SEQ ID No.5所示的序列为:CCACCATGCGAAGCCACACT。如SEQ ID No.6所示的序列为:CTGGGGGTTGTCCACGCTGGCC。其中,SEQ ID No.1所示的引物为正向引物。SEQ ID No.2所示的引物为反向引物。SEQ ID No.4所示的引物为正向引物。SEQ ID No.5所示的引物为反向引物。
第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均选自CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基团为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基团为CY5。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述探针主要采用探针野生型抑制技术,引物对选择性扩增目的序列,而探针优先与野生型结合,抑制引物与野生型的结合,从而抑制野生型基因的扩增;由于探针与突变型存在错配,导致Tm值降低,引物能优先与突变型基因结合,进行扩增。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第二实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ ID No.9所示的第三探针,第三引物对和第三探针用于检测EGFR基因的19号外显子的缺失突变。EGFR基因的19号外显子的缺失突变包括E746_A750del(1)突变、E746_T751>I突变、E746_T751del突变、E746_T751>A突变、E746_S752>A突变、E746_S752>V突变、E746_A750del(2)突变、E746_S752>D突变、L747_A750>P突变、L747_T751>Q突变、L747_E749del突变、L747_T751del突变、L747_S752del突变、L747_A750>P突变、L747_P753>Q突变、L747_T751>S突变、L747_P753>S突变、L747_T751>del突变及L747_T751>P突变中的至少一种。
上述核酸组合物中,第三引物对及第三探针对EGFR基因的19号外显子上述各种突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的19号外显子的突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测1%的EGFR基因的19号外显子的上述突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.7所示的序列为:CTCTGGATCCCAGAAGGTGA。SEQ ID No.8所示的序列为:ATATCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGACAGCTGCCAGAC。SEQ ID No.9所示的序列为:AGTGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA。其中,SEQ ID No.7所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.8所示的引物为反向引物。
其中,第三探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地,第三荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第三荧光报告基团为CY5。第三荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第三荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物主要采用sanpback引物进行突变富集和分子信标进行熔解信号的检测。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第三实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测EGFR基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ ID No.12所示的第四探针,第四引物对和第四探针用于检测EGFR基因的20号外显子的T790M突变。
上述核酸组合物中,第四引物对和第四探针对EGFR基因的20号外显子的S768I突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的S768I突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的20号外显子的T790M突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.10所示的序列为:GAAGGGCATGAGCTGCA。SEQ ID No.11所示的序列为:GTGGACAACCCCCACGTG。SEQ ID No.12所示的序列为:CGGGCATGAGCTGCGTGATGAGC。其中,SEQ ID No.10所示的引物为正向引物。SEQ ID No.11所示的引物为反向引物。
其中,第四探针的两端分别连接有第五荧光报告基团和第五荧光淬灭基团。进一步地,第五荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第五荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第五荧光报告基团为FAM。第五荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第四荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第四荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
其中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对EGFR基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为CFTR基因,第十引物对的序列如SEQ ID No.28及SEQ IDNo.29所示,第十探针的序列如SEQ ID No.30。
具体地,SEQ ID No.28所示的序列为:CTCAGGGGGCCAAATGACT。SEQ ID No.29所示的序列为:GTGTTCAAATCTCACCCTCTGG。SEQ ID No.30所示的序列为:CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中,SEQ ID No.28所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.29所示的引物为反向引物。
第十探针的两端分别连接有第十荧光报告基团和第十荧光淬灭基团。第十荧光报告基团与第五荧光报告基团不同。进一步地,第十荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第十荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第十荧光报告基团为CY5。第十荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第十荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第十荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物主要利用ARMS引物和block探针技术,ARMS引物特异性扩增目的序列,block探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变基因的作用,从而提高基因的检测灵敏度。熔解过程:对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。若样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。本研究第四实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ ID No.15所示的第五探针,第五引物对和第五探针用于检测EGFR基因的20号外显子的T790M突变。
上述核酸组合物中,第五引物对和第五探针对EGFR基因的20号外显子的T790M突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的T790M突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的20号外显子的S768I突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.13所示的序列为:TGGGGGTTGTCCACGAT。SEQ ID No.14所示的序列为:GTCTTCACCTGGAAGGGGTCC。SEQ ID No.15所示的序列为:ACATGTCCACGCTGGCCATCACGT。其中,SEQ ID No.13所示的引物为正向引物。SEQ ID No.14所示的引物为反向引物。
其中,第五探针的两端分别连接有第五荧光报告基团和第五荧光淬灭基团。进一步地,第五荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第五荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第五荧光报告基团为FAM。第五荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第五荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第五荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述探针主要采用探针野生型抑制技术,引物对选择性扩增目的序列,而探针优先与野生型结合,抑制引物与野生型的结合,从而抑制野生型基因的扩增;由于探针与突变型存在错配,导致Tm值降低,引物能优先与突变型基因结合,进行扩增。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第五实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,序列如SEQ ID No.16及SEQ ID No.17所示的第六引物对和序列如SEQ ID No.18所示的第六探针,第六引物对和第六探针用于检测EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变;及/或,序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的第七引物对和序列如SEQ ID No.21所示的第七探针,第七引物对和第七探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L861Q突变。
上述核酸组合物中,第六引物对和第六探针对EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变,第七引物对和第七探针对EGFR基因的21号外显子的L861Q突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的21号外显子的L861Q突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变,并且能够检测0.1%的EGFR基因的EGFR基因的21号外显子的L861Q突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.16所示的序列为:GTGGACAACCCCCACC。SEQ ID No.17所示的序列为:GTCTTTGTGTTCCCGGAC。SEQ ID No.18所示的序列为:TTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT。SEQID No.19所示的序列为:TTTTGGGCTGGCCAAA。SEQ ID No.20所示的序列为:GCCTCCTTCTGCATGGTA。SEQ ID No.21所示的序列为:GCGGCCAAACtGCTGGGTGCCGG。其中,SEQID No.16所示的引物为正向引物。SEQ ID No.17所示的引物为反向引物。SEQ ID No.19所示的引物为正向引物。SEQ ID No.20所示的引物为反向引物。
其中,第六探针的两端分别连接有第六荧光报告基团和第六荧光淬灭基团。第七探针的两端分别连接有第七荧光报告基团和第七荧光淬灭基团。进一步地,第六荧光报告基团及第七荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第六荧光淬灭基团及第七荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第六荧光报告基团和第七荧光报告基团为FAM。第六荧光淬灭基团及第七荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第六荧光报告基团和第七荧光报告基团均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第六荧光淬灭基团及第七荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
其中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对EGFR基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为CFTR基因,第十引物对的序列如SEQ ID No.28及SEQ IDNo.29所示,第十探针的序列如SEQ ID No.30。
具体地,SEQ ID No.28所示的序列为:CTCAGGGGGCCAAATGACT。SEQ ID No.29所示的序列为:GTGTTCAAATCTCACCCTCTGG。SEQ ID No.30所示的序列为:CY5-CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG-BHQ2。其中,SEQ ID No.28所示的引物为正向引物。SEQID No.29所示的引物为反向引物。
第十探针的两端分别连接有第十荧光报告基团和第十荧光淬灭基团。第十荧光报告基团与第六荧光报告基团不同。且第十荧光报告基团与第七荧光报告基团不同。进一步地,第十荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第十荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第十荧光报告基团为CY5。第十荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第十荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第十荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物主要利用ARMS引物和block探针技术,ARMS引物特异性扩增目的序列,block探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变基因的作用,从而提高基因的检测灵敏度。熔解过程:对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。若样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第六实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示的第八引物对和序列如SEQ ID No.24所示的第八探针,第八引物对和第八探针用于检测EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变。
上述核酸组合物中,第八引物对和第八探针对EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.22所示的序列为:GGAAGCCTACGTGATGG。SEQ ID No.23所示的序列为:TGCGTGATGAGCTGCA。具体地,SEQ ID No.24所示的序列为:CGTGATGGCCAGCGTGGACAAC。其中,SEQ ID No.22所示的引物为正向引物。SEQ ID No.23所示的引物为反向引物。
其中,第八探针的两端分别连接有第八荧光报告基团和第八荧光淬灭基团。进一步地,第八荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第八荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第八荧光报告基团为FAM。第八荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第八荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第八荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
其中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对EGFR基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为CFTR基因,第十引物对的序列如SEQ ID No.28及SEQ IDNo.29所示,第十探针的序列如SEQ ID No.30。
具体地,SEQ ID No.28所示的序列为:CTCAGGGGGCCAAATGACT。SEQ ID No.29所示的序列为:GTGTTCAAATCTCACCCTCTGG。SEQ ID No.30所示的序列为:CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中,SEQ ID No.28所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.29所示的引物为反向引物。
第十探针的两端分别连接有第十荧光报告基团和第十荧光淬灭基团。第十荧光报告基团与第八荧光报告基团不同。进一步地,第十荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第十荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第十荧光报告基团为CY5。第十荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第十荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第十荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物主要利用ARMS引物和block探针技术,ARMS引物特异性扩增目的序列,block探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变基因的作用,从而提高基因的检测灵敏度。熔解过程:对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。若样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第七实施方式提供一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,能够检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。具体地,序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.26所示的第九引物对和序列如SEQ ID No.27所示的第九探针,第九引物对和第九探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L858R突变。
上述核酸组合物中,第九引物对和第九探针对EGFR基因的21号外显子的L858R突变具有较高的特异性,能够检测EGFR基因的21号外显子的L858R突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的EGFR基因的21号外显子的L858R突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.25所示的序列为:ATCAGATTTTGGGCG。SEQ ID No.26所示的序列为:TGCCTCCTTCTGCATTAT。SEQ ID No.27所示的序列为:GCCGCTTGGGCtGGCCAAACtGCTG。其中,SEQ ID No.25所示的引物为正向引物。SEQ ID No.26所示的引物为反向引物。
其中,第九探针的两端分别连接有第九荧光报告基团和第九荧光淬灭基团。进一步地,第九荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第九荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第九荧光报告基团为FAM。第九荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第九荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第九荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
其中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对EGFR基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为CFTR基因,第十引物对的序列如SEQ ID No.28及SEQ IDNo.29所示,第十探针的序列如SEQ ID No.30。
具体地,SEQ ID No.28所示的序列为:CTCAGGGGGCCAAATGACT。SEQ ID No.29所示的序列为:GTGTTCAAATCTCACCCTCTGG。SEQ ID No.30所示的序列为:CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中,SEQ ID No.28所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.29所示的引物为反向引物。
第十探针的两端分别连接有第十荧光报告基团和第十荧光淬灭基团。第十荧光报告基团与第九荧光报告基团不同。进一步地,第十荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。第十荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第十荧光报告基团为CY5。第十荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第十荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第十荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物主要利用ARMS引物和block探针技术,ARMS引物特异性扩增目的序列,block探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变基因的作用,从而提高基因的检测灵敏度。熔解过程:对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。若样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
本研究的检测EGFR基因突变的核酸组合物能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒,包括上述各实施方式的检测EGFR基因突变的核酸组合物中的至少一种。该检测EGFR基因突变的试剂盒能够较为准确检测EGFR基因突变,检测灵敏度较高。
进一步地,检测EGFR基因突变的试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
其中,酶混合液例如可以包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。
其中,突变检测反应体系包括:2mM的MgCl2,50mM、pH8.3的Tris,500mg/L的BSA,100μM的dNTPs,0.4μL的酶Ⅰ混合液,0.1μM的正向引物,0.5μM的反向引物,0.5μM的探针。此种设置能够提高检测灵敏度和准确性。
检测EGFR基因突变的核酸组合物还包括:还包括质控引物对和质控探针。此种设置能够提高检测准确性。
进一步地,质控引物对的序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示,质控探针的序列如SEQ ID No.33所示。
具体地,SEQ ID No.31所示的序列为:TAAAATTCCCGTCGCTATCAA。SEQ ID No.32所示的序列为:TGTGGAGATGAGCAGGGTCT。SEQ ID No.33所示的序列为:CCGGAGTTTCTGCTTTACTGTGTGGGGG。其中,SEQ ID No.31所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.32所示的引物为反向引物。
质控探针的两端分别连接有质控荧光报告基团和质控荧光淬灭基团。质控荧光报告基团与质控荧光报告基团不同。进一步地,质控荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种。质控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,质控荧光报告基团为FAM。质控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,质控荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,质控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
其中,质控检测反应体系包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM dNTPs、0.3μL的酶Ⅱ混合液、0.3μM的正向引物,0.3μM的反向引物、0.225μM的探针。此种设置能够提高检测准确性。
本研究的检测EGFR基因突变的试剂盒能够用于检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种EGFR基因突变的检测方法,检测灵敏度较低,能够用于EGFR基因突变的非疾病的治疗和诊断的检测,例如用于EGFR基因突变的实验性研究。
具体地,向待测样品中加入上述各实施方式的检测EGFR基因突变的核酸组合物中的至少一种进行PCR扩增反应,根据反应结果进行检测分析。
其中,突变检测反应体系包括:2mM的MgCl2,50mM、pH8.3的Tris,500mg/L的BSA,100μM的dNTPs,0.4μL的酶Ⅰ混合液,0.1μM的正向引物,0.5μM的反向引物,0.5μM的探针。此种设置能够提高检测灵敏度和准确性。
其中,质控检测反应体系包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM dNTPs、0.3μL的酶Ⅱ混合液、0.3μM的正向引物,0.3μM的反向引物、0.225μM的探针。此种设置能够提高检测准确性。
本研究的EGFR基因突变的检测方法能够非疾病的治疗和诊断的检测EGFR基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒,其试剂盒组成详见表1。
试剂盒包括检测EGFR基因突变的核酸组合物(如表2和表3所示)、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品和空白对照品。
其中,酶混合液包括酶Ⅰ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。其中,Taq酶购于TAKARA生物公司和广州百旺生物技术有限公司,抗体购于TOYOBO公司。
突变检测PCR反应液包括:2mM的MgCl2,50mM,pH8.3的Tris,500mg/L的BSA,100μM的dNTPs,0.4μL的酶Ⅰ混合液,0.1μM的正向引物,0.5μM的反向引物,0.5μM的探针。
质控反应液包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM KCl、200mg/mL的BSA、0.1mMdNTPs、0.3μL的酶Ⅱ混合液、0.3μM的正向引物,0.3μM的反向引物、0.225μM的探针。
阳性对照品为人类EGFR基因G719X阳性质粒、E20ins.3阳性质粒E19del.阳性质粒、T790M阳性质粒、S768I阳性质粒、E20ins.3dup阳性质粒、L861Q阳性质粒、E20ins.9阳性质粒、L858R阳性质粒和野生型人类基因组DNA的混合物。
空白对照品为超纯水。
表1检测EGFR基因突变的试剂盒的组成
表2检测EGFR基因突变的核酸组合物
表3检测EGFR基因突变的核酸组合物对应的检测位点
实施例2
采用实施例1的检测EGFR基因突变的试剂盒的检测限
取人EGFR野生型基因组,人EGFR各突变型基因质粒以及TE buffer缓冲液,制备同时含有5ng/μL的人EGFR野生型DNA及含量分别为野生型的10%、1%和0.1%的人EGFR各突变型基因质粒,记录阳性检出率。
具体实施步骤如下:
1、待测样本的提取
组织样本使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行提取,血浆样本使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行提取。提取过程应严格按照说明书要求进行。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2~100ng/μL,血浆提取后的核酸浓度应不少于2ng/μL,纯度都应满足A260/A280比值范围在1.6~2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱保存备用,避免反复冻融。
2、试剂配置
(1)根据检测样品数量及实验设计,取对应检测需要的8联管、EGFR质控PCR反应液、EGFR-酶Ⅰ混合液、EGFR-酶Ⅱ混合液、EGFR阳性对照、超纯水一起放置冰上或4℃冰箱里。
(2)将8联管、EGFR阳性对照及样本混匀后微离心,放置冰上;DNA聚合酶和纯化水微离心后置冰上;按照表4配置混合液mixA,按照表5的反应体系进行配置混合液mix B。
表4 mixA配液组成
组分 | 1反应的体积(μL) | 倍数(7.2) |
EGFR-酶Ⅰ混合液 | 0.4 | 2.88μL |
超纯水 | 0.6 | 4.32μL |
样品DNA/阳性对照/超纯水 | 4 | 28.8μL |
总体积 | 5 | 36.0μL |
表5 mixB配液组成
组分 | 1反应的体积(μL) | N反应(μl) |
EGFR-酶Ⅱ混合液 | 0.3 | 0.3×NμL |
EGFR质控PCR反应液 | 15.7 | 15.7×NμL |
总体积 | 16 | 16×NμL |
(3)轻取8联管,固定在加样板上,不得剧烈晃动,并轻轻揭开8联管管盖,将混合液mix B加入8联管中第8孔中,每孔加入16μL,将混合液mix A分别加入对应的8联管中1-7号,每孔加入5μL;在联管中8号中加入4μL的样本,然后小心盖上8联管管盖;加样完成的8联管轻轻混匀后微离心。
(4)将8联管放入PCR仪器中,按照加样布局排列,推荐排列布局详见表6。
表6荧光定量PCR仪96孔板的布局
3、PCR扩增及荧光检测
将各反应管按一定的顺序放入荧光定量PCR以上,按照表7设置反应程序。
表7 PCR反应程序
荧光通道选择FAM和CY5通道。
4、检验结果的解释
试剂盒有效性情况判断:
(1)空白对照在熔解分析后,FAM通道和CY5通道无明显熔解峰;若分析后出现明显熔解峰,可能为试剂受到污染或操作过程中污染,请排除污染源后重新检测。
(2)阳性对照管在熔解曲线分析后,FAM通道和CY5通道出现单独熔解峰,FAM通道的熔解曲线Tm值在63±1℃范围内,CY5通道的熔解曲线Tm值在63±1℃范围内。
(3)样本有效性的判断:
(a)质控PCR反应液:FAM通道Ct值≥26.0,说明所加入样本基因组DNA含量过低,只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型,也可能为DNA样本中存在着PCR抑制剂,建议重新制备样本或者增加使用量进行检测;
(b)质控PCR反应液:FAM通道23≤Ct值<26,说明所加入的样本基因组DNA量适中;
(c)质控PCR反应液:FAM通道Ct值<23,说明所加样本基因组DNA过量,建议稀释后重新检测;
(d)质控PCR反应液管用于判断样本的有效性,通过扩增曲线判定样本的情况。
(4)检测结果的判定:若试剂和样本都有效,表明此时检测成功,对样本管进行分析。样本分析标准结合下表8和附加情况进行判断分析。
表8结果判断规则
(a)若Tube1和Tube5的CY5通道都出现单独熔解峰,熔解峰的各自Tm值在上表要求的范围内;Tube1和Tube5的Fam通道同时出现单独熔解峰,熔解峰的各自Tm值在上表要求范围内,也判断为E20 ins.3dup突变。
(b)若Tube4的CY5通道出现双峰(62±1℃,68±1℃),同时Tube6的Fam通道和CY5通道出现单独熔解峰,各自熔解峰的Tm值出现在上表的范围内,也判断为E20 ins9突变。
(c)若Tube5和Tube7的CY5通道都出现单独熔解峰,熔解峰的各自Tm值在上表要求的范围内;Tube5的Fam通道出现单独熔解峰,熔解峰的Tm值在上表要求范围内,同时Tube7的Fam通道出现单独熔解峰,熔解峰的Tm值为55±1℃,也判断为L861Q突变。
检测结果详见图1~图7。图1为人EGFR基因18外显子G719C突变检测能力测试图。图2为人EGFR基因19外显子EXON-19-E746_A750del(2)突变检测能力测试图。图3为人EGFR基因20外显子T790M突变检测能力测试图。图4为人EGFR基因20外显子S768I突变检测能力测试图。图5为人EGFR基因21外显子L861Q突变检测能力测试图。图6为人EGFR基因20外显子in9插入突变检测能力测试。图7为人EGFR基因21外显子L858R突变检测能力测试。图1中,横坐标为温度,单位为℃,纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
从图1~图7可以看出,上述检测EGFR基因突变的试剂盒,在19外显子上能够检测出5ng背景下1%的突变比例,其它突变位点能够检测出5ng野生型背景下0.1%的突变比例,检测灵敏度和特异性较高。
上述检测EGFR基因突变的试剂盒能够用于检测EGFR基因18、19、20、和21号外显子的29种突变,检测范围广,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测,整个过程闭管操作,简便快捷,同时大大降低污染几率,特异性强,灵敏度高达千分之一,有助于高效筛选恶性肿瘤免疫治疗和靶向治疗的检测对象,为临床用药提供理论依据。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测EGFR基因突变的核酸组合物及试剂盒和EGFR基因突变的检测方法
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatgtccac gctggccatc acgt 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccggagtttc tgctttactg tgtggggg 28
Claims (10)
1.一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针,所述第一引物对和所述第一探针用于检测EGFR基因的18号外显子的G719A突变、G719S突变及G719C突变中的至少一种;及
序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针,所述第二引物对和所述第二探针用于检测EGFR基因的20号外显子的D770_N771insG突变;
其中,所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
2.一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ ID No.9所示的第三探针,所述第三引物对和所述第三探针用于检测EGFR基因的19号外显子的缺失突变,所述EGFR基因的19号外显子的缺失突变包括:E746_A750del(1)突变、E746_T751>I突变、E746_T751del突变、E746_T751>A突变、E746_S752>A突变、E746_S752>V突变、E746_A750del(2)突变、E746_S752>D突变、L747_A750>P突变、L747_T751>Q突变、L747_E749del突变、L747_T751del突变、L747_S752del突变、L747_A750>P突变、L747_P753>Q突变、L747_T751>S突变、L747_P753>S突变、L747_T751>del突变及L747_T751>P突变中的至少一种。
3.一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ ID No.15所示的第五探针,所述第五引物对和所述第五探针用于检测EGFR基因的20号外显子的S768I突变。
4.一种检测EGFR基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ ID No.12所示的第四探针,所述第四引物对和所述第四探针用于检测EGFR基因的20号外显子的T790M突变;
及/或,序列如SEQ ID No.16及SEQ ID No.17所示的第六引物对和序列如SEQ IDNo.18所示的第六探针,所述第六引物对和所述第六探针用于检测EGFR基因的20号外显子的H773_V774insH突变;
及/或,序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的第七引物对和序列如SEQ IDNo.21所示的第七探针,所述第七引物对和所述第七探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L861Q突变;
及/或,序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示的第八引物对和序列如SEQ IDNo.24所示的第八探针,所述第八引物对和所述第八探针用于检测EGFR基因的20号外显子的V769_D770insASV突变;
及/或,序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.26所示的第九引物对和序列如SEQ IDNo.27所示的第九探针,所述第九引物对和所述第九探针用于检测EGFR基因的21号外显子的L858R突变。
5.根据权利要求4所述的检测EGFR基因突变的核酸组合物,其特征在于,还包括:用于检测内控基因的第十引物对和第十探针;
进一步地,所述内控基因为CFTR基因,所述第十引物对的序列如SEQ ID No.28及SEQID No.29所示,所述第十探针的序列如SEQ ID No.30。
6.一种检测EGFR基因突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~5任一项所述的检测EGFR基因突变的核酸组合物。
7.根据权利要求6所述的检测EGFR基因突变的试剂盒,其特征在于,所述检测EGFR基因突变的核酸组合物还包括:还包括质控引物对和质控探针;
进一步地,所述质控引物对的序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示,所述质控探针的序列如SEQ ID No.33所示。
8.根据权利要求6~7任一项所述的检测EGFR基因突变的试剂盒,其特征在于,还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
9.一种EGFR基因突变的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
向待测样品中加入权利要求1~5任一项所述的检测EGFR基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应,根据反应结果进行检测分析。
10.根据权利要求9所述的EGFR基因突变的检测方法,其特征在于,突变检测反应体系包括:2mM的MgCl2,50mM、pH8.3的Tris,500mg/L的BSA,100μM的dNTPs,0.4μL的酶Ⅰ混合液,0.1μM的正向引物,0.5μM的反向引物,0.5μM的探针。
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2020
- 2020-10-28 CN CN202011168443.3A patent/CN112322733A/zh active Pending
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