CN108949927A - 一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 - Google Patents
一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108949927A CN108949927A CN201810942602.7A CN201810942602A CN108949927A CN 108949927 A CN108949927 A CN 108949927A CN 201810942602 A CN201810942602 A CN 201810942602A CN 108949927 A CN108949927 A CN 108949927A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- mutation
- detecting
- sequence composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一组用于检测人类EGFR基因突变的引物序列和blocker序列，涉及EGFR基因突变的检测。本发明还进一步公开了包括该引物序列和blocker序列的试剂盒及使用方法。本发明提供的检测人类EGFR基因突变引物序列和blocker序列可在单一反应中检测多种不同类型的突变基因，灵敏度高，特异性强，单次检测通量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种人类基因突变的检测方法，尤其涉及一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物及其试剂盒和方法。
背景技术
人类表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。EGFR是HER/ErbB家族成员之一。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，经过细胞质中的衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、增值、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增值。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。
易瑞沙和特罗凯作为EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是临床实验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著的疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患者疗效显著。肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18-21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％。如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅会耽误病情还会造成巨额的药疗资源的浪费。因此，检测组织或血液中是否含有EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的参考价值，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
EGFR突变为体细胞突变，在肿瘤患者中突变的频率较高(美国NSCLC患者中约10％有EGFR基因突变，而亚洲人群这一比例约为30％)。但是突变基因与未发生突变的野生型基因相比，突变比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比例通常为0.01％～10％。因此针对EGFR突变基因的检测最大的难题是如何在大量野生型基因背景下检测出极少量发生突变的EGFR基因。另外，由于已知与靶向治疗有关的EGFR突变类型高达40多种，因此如何实现有效检测40多种突变类型是另一项挑战。表1介绍了人类肿瘤患者中EGFR突变常见的42中突变亚型。
表1：肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因的42种突变亚型
目前检测基因突变的方法主要包括：直接测序法、传统的荧光定量PCR法和探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system,ARMS)(申请号CN101608240B/CN102747157A)。直接测序法耗时长且灵敏度低，只能对含量超过5％的基因突变进行检测，通常只能用于实验室的科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易出现假阳性的检测结果；同时检测的位点数量和检测样本的通量都相对比较小。ARMS-PCR法是利用PCR引物的3’末端碱基必须与模板完全互补才能有效扩增的原理，通过设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，进而达到检测突变基因的目的。虽然ARMS-PCR方法是一种较为简单、且灵敏度较高的检测方法，但是受限于PCR检测通道，难以实现对多种EGFR突变基因进行同时检测。
因此，为了同时解决现有EGFR突变基因检测技术所面临的灵敏度和检测通量低的问题，本发明致力于开发出一种EGFR基因突变的引物组、blocker组及其在modified-ARMsPCR的使用方法。该方法应具有灵敏度高、准确性高、特异性强和单次检测通量高，且能同时检测出多种突变基因的优点。因此，本领域的技术人员致力于开发一种
发明内容
为了克服现有技术检测能力有限，本发明提供一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因多种突变亚型序列组合物，该序列组合物包括的引物组和blocker组。
本发明提供了一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列组合物可以用于检测人类EGFR突变亚型中的19del亚型，其中所述SEQID NO:1SEQ ID NO:2为扩增引物序列，所述SEQ ID NO:3为用于提高检测特异性的blocker序列。
进一步的，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，所述SEQ ID NO:4-8序列组合物可用于检测人EGFR突变中的G719X亚型，其中SEQ ID NO:4-7为扩增引物序列，SEQ ID NO:8为提高检测特异性的blocker序列。
进一步地，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，所述SEQ ID NO:10-15可用于检测人类EGFR突变的20ins亚型，其中SEQ ID NO:10为检测上游引物，SEQ ID NO:11-15分别为检测20ins亚型不同突变的下游引物。
进一步地，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，所述SEQ ID NO:16-18可以用于检测人类EGFR突变亚型中的L858R，其中SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17为扩增引物序列，SEQ ID NO:18为提高检测特异性blocker序列。
进一步地，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，所述SEQ ID NO:19-21可用于检测人类EGFR突变中T790M亚型，其中SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20为扩增引物序列，SEQ ID NO:21为提高检测特异性blocker序列。
进一步地，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，所述SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24可用于检测人类EGFR突变中的S768I亚型，其中SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23为扩增引物序列，SEQ ID NO:24为提高检测特异性blocker序列。
进一步地，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27，所述SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27可用于检测人类EGFR突变中的L861Q亚型，其中SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为扩增引物序列，SEQ ID NO:27为提高检测特异性blocker序列。
本发明还提供了一种用于检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述检测人类EGFR基因突变的序列组合物，该序列组合物可以是检测一种人类EGFR基因突变亚型的序列组合物；也可以是检测多个不同人类EGFR基因突变亚型的序列组合物。优选的，该试剂盒还包括用于检测的PCR反应体系，包括用于扩增的Taq酶或pfu酶，dNTP，缓冲液等其他常规用于扩增的PCR反应原料。
本发明提供的人类EGFR序列组合物分3管反应对表皮生长因子受体(EGFR)基因的42种突变亚型进行检测，各管检测的突变亚型见表2。
表2：各管检测的突变类型
本发明还提供了一种检测人类EGFR基因突变的检测方法，具体包括如下步骤。
(1)根据EGFR18、19、20、21外显子的野生型基因序列和相应的突变基因序列，设计相应的引物组和blocker组，详细序列见表3。其中，SEQ ID1-SEQ ID3能同时扩增包含19DEL的突变类型；SEQ ID4-SEQ ID8能同时扩增包含G719A/G719S/G719C的突变类型；SEQ ID9-SEQ ID15能同时扩增包含20insert的突变类型；SEQ ID16-SEQ ID18能同时扩增包含L858R的突变类型；SEQ ID19-SEQ ID21能同时扩增包含T790M的突变类型；SEQ ID22-SEQ ID24能同时扩增包含S768I的突变类型；SEQ ID25-SEQ ID27能同时扩增包含L861Q的突变类型；
(2)配制modified-ARMS PCR(以下简称PCR)扩增突变基因序列的反应体系。PCR的反应体系为：配制15微升/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成分及浓度分别为：上/下游引物浓度分别为0.2微摩/升、Taq酶为1U/反应、1x PCR buffer、MgCl2为1.5毫摩/升、dNTP为0.2毫摩/升、模板DNA1-10纳克/微升，blocker序列浓度为0.2微摩/升。
(3)PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。PCR扩增后的产物为包含有各种突变的特异性基因DNA片段。
(4)利用3％的琼脂糖凝胶电泳在电压130伏的条件下运行30分钟；然后在凝胶成像系统进行检测。
所述的一种检测EGFR突变基因中的42种突变类型的引物组和blocker组在PCR的使用方法不包括对待测样本处理和模板提取步骤。可用于来自石蜡包埋的样品、血浆样品以及新鲜组织等多种样品所获得的DNA，且对目的基因的扩增和检测能力均能达到1％的检测灵敏度(在野生型基因10000copies/每管反应的情况下)。
表3：针对各个突变类型所设计的特异性引物和blocker
本发明的有益效果是在ARMS-PCR的基础上建立了多重PCR检测体系以便能同时检测42种EGFR基因突变类型。此方法：(1)可在3个反应管中能同时检测EGFR基因的42种EGFR基因突变类型；(2)特异性强，由于特殊的blocker组的设计和存在，使得待测突变基因即使在和30ng野生型基因组DNA共同存在的情况下，野生型基因组也不会发生非特异性扩增信号，从而能有效的避免假阳性信号的出现；(3)灵敏度高，每个反应中存在5-20拷贝的突变基因即可检出，即在30ng野生型基因组DNA背景下可检测低至0.1-1％的突变DNA。(4)每个反应管均能同时检测出2-3种不同的EGFR突变类型。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的EGFR基因热点突变外显子19上的E746-A750del检测结果；
图2是EGFR基因突变位点S768I/L861Q点突变的检测结果；
图3是EGFR基因热点突变外显子20上的插入突变(ID39)检测结果。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本发明以人类EGFR基因突变为检测对象，通过特异性引物的优化组合以及联合使用特异性blocker组合，从而实现快速准确地同时检测42种突变基因亚型，而且检测突变的灵敏度高达0.1-1％。
野生型细胞系A549的基因组DNA为野生型模板，以细胞系A549为模板背景，其他突变以及经过基因工程构建的突变质粒为突变模板，建立能检测EGFR基因突变的反应体系。
实施例1.EGFR基因热点突变外显子19上的E746-A750del检测
此方法主要包括以下步骤：
(1)合成根据EGFR18、19、20、21外显子的野生型基因序列和相应的突变基因序列，设计相应的引物和blocker，详细序列见表3。其中，SEQ ID1-SEQ ID3能同时扩增包含19DEL的突变类型；SEQ ID4-SEQ ID8能同时扩增包含G719A/G719S/G719C的突变类型；SEQ ID9-SEQ ID15能同时扩增包含20insert的突变类型；SEQ ID16-SEQ ID18能同时扩增包含L858R的突变类型；SEQ ID19-SEQ ID21能同时扩增包含T790M的突变类型；SEQ ID22-SEQ ID24能同时扩增包含S768I的突变类型；SEQ ID25-SEQ ID27能同时扩增包含L861Q的突变类型；
(2)提取模板DNA：使用其他商业化试剂盒从病人的组织样本中提取模板DNA(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液和全血)。另外，通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板(A549)和不同比例的突变型基因(Del19)，然后再通过本发明进行扩增检测以验证其灵敏度。
(3)配制PCR扩增突变基因序列的反应体系。PCR的反应体系为：配制15微升/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成分及浓度分别为：上/下游引物浓度分别为0.2微摩/升、Taq酶为1U/反应、1x PCR buffer、MgCl2为1.5毫摩/升、dNTP为0.2毫摩/升、模板DNA1-10纳克/微升，blocker序列浓度为0.2微摩/升。
(4)PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。PCR扩增后的产物为包含有Del19各种突变的特异性基因DNA片段。
(5)利用3％的琼脂糖凝胶电泳在电压130伏的条件下运行30分钟；然后在凝胶成像系统检测检测。(具体结果详见图1，其中L.25bp ladder；1.阴性对照；2.10000拷贝的A549野生型基因组；3.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，20拷贝的E746-A750del质粒；4.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，200拷贝的E746-A750del质粒；4.200拷贝的E746-A750del质粒)。检测结果显示其能达到0.1％，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。
实施例2.EGFR基因的S768I/L861Q点突变的检测
此方法主要包括以下步骤：
(1)合成根据EGFR18、19、20、21外显子的野生型基因序列和相应的突变基因序列，设计相应的引物和blocker，详细序列见表3。其中，SEQ ID1-SEQ ID3能同时扩增包含19DEL的突变类型；SEQ ID4-SEQ ID8能同时扩增包含G719A/G719S/G719C的突变类型；SEQ ID9-SEQ ID15能同时扩增包含20insert的突变类型；SEQ ID16-SEQ ID18能同时扩增包含L858R的突变类型；SEQ ID19-SEQ ID21能同时扩增包含T790M的突变类型；SEQ ID22-SEQ ID24能同时扩增包含S768I的突变类型；SEQ ID25-SEQ ID27能同时扩增包含L861Q的突变类型；；
(2)提取模板DNA：使用其他商业化试剂盒从病人的组织样本中提取模板DNA(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液和全血)。另外，通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板(A549)和不同比例的S768I/L861Q点突变质粒，然后再通过本发明进行扩增检测以验证其灵敏度。
(3)配制PCR扩增突变基因序列的反应体系。PCR的反应体系为：配制15微升/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成分及浓度分别为：上/下游引物浓度分别为0.2微摩/升、Taq酶为1U/反应、1x PCR buffer、MgCl2为1.5毫摩/升、dNTP为0.2毫摩/升、模板DNA1-10纳克/微升，blocker序列浓度为0.2微摩/升。
(4)PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。PCR扩增后的产物为包含有S768I/L861Q点突变的特异性基因DNA片段。
(5)利用3％的琼脂糖凝胶电泳在电压130伏的条件下运行30分钟；然后在凝胶成像系统检测检测。(具体结果详见图2，其中L.25bp ladder；1.阴性对照；2.10000拷贝的A549野生型基因组；3.100拷贝的S768I突变质粒；4.100拷贝的L861Q突变质粒；5.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，10拷贝的S768I突变质粒；6.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，10拷贝的L861Q突变质粒；7.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，100拷贝的S768I突变质粒；8.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，100拷贝的L861Q突变质粒)。检测结果显示其能达到0.1％，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。
实施例3.EGFR基因热点突变外显子20上的插入突变(ID39)检测
此方法主要包括以下步骤：
(1)合成根据EGFR18、19、20、21外显子的野生型基因序列和相应的突变基因序列，设计相应的引物和blocker，详细序列见表3。其中，SEQ ID1-SEQ ID3能同时扩增包含19DEL的突变类型；SEQ ID4-SEQ ID8能同时扩增包含G719A/G719S/G719C的突变类型；SEQ ID9-SEQ ID15能同时扩增包含20insert的突变类型；SEQ ID16-SEQ ID18能同时扩增包含L858R的突变类型；SEQ ID19-SEQ ID21能同时扩增包含T790M的突变类型；SEQ ID22-SEQ ID24能同时扩增包含S768I的突变类型；SEQ ID25-SEQ ID27能同时扩增包含L861Q的突变类型；；
(2)提取模板DNA：使用其他商业化试剂盒从病人的组织样本中提取模板DNA(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液和全血)。另外，通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板(A549)和不同比例的外显子20上的插入突变(ID39)突变质粒，然后再通过本发明进行扩增检测以验证其灵敏度。
(3)配制PCR扩增突变基因序列的反应体系。PCR的反应体系为：配制15微升/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成分及浓度分别为：上/下游引物浓度分别为0.2微摩/升、Taq酶为1U/反应、1x PCR buffer、MgCl2为1.5毫摩/升、dNTP为0.2毫摩/升、模板DNA1-10纳克/微升，blocker序列浓度为0.2微摩/升。
(4)PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。PCR扩增后的产物为包含有20上的插入突变的特异性基因DNA片段。
(5)利用3％的琼脂糖凝胶电泳在电压130伏的条件下运行30分钟；然后在凝胶成像系统检测检测。(具体结果详见图3，其中L.100bp ladder；1.阴性对照；2.10000拷贝的A549野生型基因组；3.200拷贝的ID39质粒；4.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，20拷贝的ID39质粒；5.10000拷贝的A549野生型基因组背景下，200拷贝的ID39的质粒)。检测结果显示其能达到0.1％，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。
实施例4.各种不同突变位点的检测灵敏度
此方法主要包括以下步骤：
(1)合成根据EGFR18、19、20、21外显子的野生型基因序列和相应的突变基因序列，设计相应的引物和blocker，详细序列见表3。其中，SEQ ID1-SEQ ID3能同时扩增包含19DEL的突变类型；SEQ ID4-SEQ ID8能同时扩增包含G719A/G719S/G719C的突变类型；SEQ ID9-SEQ ID15能同时扩增包含20insert的突变类型；SEQ ID16-SEQ ID18能同时扩增包含L858R的突变类型；SEQ ID19-SEQ ID21能同时扩增包含T790M的突变类型；SEQ ID22-SEQ ID24能同时扩增包含S768I的突变类型；SEQ ID25-SEQ ID27能同时扩增包含L861Q的突变类型；
(2)提取模板DNA：使用其他商业化试剂盒从病人的组织样本中提取模板DNA(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液和全血)。另外，通过在反应溶液中分别加入10000个拷贝的野生模板(A549)和不同比例的突变质粒，然后再通过本发明进行扩增检测以验证其灵敏度。
(3)配制PCR扩增突变基因序列的反应体系。PCR的反应体系为：配制15微升/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成分及浓度分别为：上/下游引物浓度分别为0.2微摩/升、Taq酶为1U/反应、1x PCR buffer、MgCl2为1.5毫摩/升、dNTP为0.2毫摩/升、模板DNA1-10纳克/微升，blocker序列浓度为0.2微摩/升。
(4)PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，70℃20秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次。PCR扩增后的产物为包含有各种突变的特异性基因DNA片段。
(5)利用3％的琼脂糖凝胶电泳在电压130伏的条件下运行30分钟；然后在凝胶成像系统检测检测。(具体结果详见表4)。检测结果显示其能达到0.1-1％，并能对10000个拷贝的野生基因组能进行很好的抑制。
表4.采用本发明检测不同突变位点的灵敏度
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海迈景纳米科技有限公司
<120> 一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物及其试剂盒
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagaaagtt aaaattcccg tcgct 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacacagcaa agcagaaact cac 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacacagcaa agcagaaact cac 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccagcttgt ggagcctctt acacc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccagcttgt ggagcctctt acacc 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtgccgaac gcaccggagc vt 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgccgaacg caccggagg 19
<210> 8
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggagcccagc a 11
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctggccac catgcgaagc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttgtccacg ctgtccacgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgtccacg ctgtccacgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcacacgtgg gggttaccgt 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcggcacacg tggtggggg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggttgtccac gctggccacg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggttgtccac gctggttacg 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctgacctaa agccacctcc ttac 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtcaagatc acagattttg ggcg 24
<210> 18
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgggctggc caa 13
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctccaccgtg carctcatca t 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgagcaggt actgggagcc aat 23
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcatcacgc agctc 15
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctccaggaag cctacgtgat ggccat 26
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtggaggtga ggcagatgcc 20
<210> 24
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggccagcgt gg 12
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttggtgcac cgcgacctg 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tctttctctt ccgcacccag ct 22
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cacccagcag tttgg 15
Claims (10)
1.一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
3.如权利要求2所述的权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
4.如权利要求3所述的权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
5.如权利要求4所述的权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
6.如权利要求5所述的权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
7.如权利要求6所述的权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
8.一种用于检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任意一项所述的序列组合物。
9.如权利要求8所述的检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的反应体系。
10.一种用于检测人类EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述方法利用如权利要求8所述的试剂盒进行检测，所述检测方法分为3个不同的检测体系，其中一个检测体系检测人类EGFR的基因突变的19DEL/20Insert突变亚型，一个检测体系检测人类EGFR的基因突变的L858R/T790M突变亚型，一个检测体系检测人类EGFR的基因突变S768I/L861Q/G719C/G719A/G719S的突变亚型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810942602.7A CN108949927B (zh) | 2018-08-17 | 2018-08-17 | 一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810942602.7A CN108949927B (zh) | 2018-08-17 | 2018-08-17 | 一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108949927A true CN108949927A (zh) | 2018-12-07 |
| CN108949927B CN108949927B (zh) | 2022-12-13 |
Family
ID=64470590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810942602.7A Active CN108949927B (zh) | 2018-08-17 | 2018-08-17 | 一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108949927B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109457018A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-12 | 上海迈景纳米科技有限公司 | 一种基于多重荧光pcr的egfr突变基因检测方法 |
| CN110373454A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-10-25 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种联合检测egfr基因突变的试剂盒及方法 |
| CN110923325A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-27 | 阅尔基因技术（苏州）有限公司 | 用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法 |
| CN111363810A (zh) * | 2018-12-25 | 2020-07-03 | 河南爱微迪生物技术有限公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
| CN112322733A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-02-05 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 检测egfr基因突变的核酸组合物及试剂盒和egfr基因突变的检测方法 |
| CN113088573A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-09 | 人和未来生物科技（长沙）有限公司 | 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101608240A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-12-23 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法 |
| CN103255201A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-08-21 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 |
| CN103966306A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | Egfr突变检测引物/探针及方法(pcr/ldr法) |
| CN107012221A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-08-04 | 苏州艾达康医疗科技有限公司 | 基于阻断物的富集系统及其应用 |
| KR20170133285A (ko) * | 2016-05-25 | 2017-12-05 | 서울대학교산학협력단 | 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
| CN107653303A (zh) * | 2017-10-11 | 2018-02-02 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法 |
| CN107868828A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-04-03 | 中源协和基因科技有限公司 | 检测egfr基因t790m位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法 |
-
2018
- 2018-08-17 CN CN201810942602.7A patent/CN108949927B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101608240A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-12-23 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法 |
| CN103255201A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-08-21 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 |
| CN103966306A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | Egfr突变检测引物/探针及方法(pcr/ldr法) |
| KR20170133285A (ko) * | 2016-05-25 | 2017-12-05 | 서울대학교산학협력단 | 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
| CN107012221A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-08-04 | 苏州艾达康医疗科技有限公司 | 基于阻断物的富集系统及其应用 |
| CN107653303A (zh) * | 2017-10-11 | 2018-02-02 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法 |
| CN107868828A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-04-03 | 中源协和基因科技有限公司 | 检测egfr基因t790m位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109457018A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-12 | 上海迈景纳米科技有限公司 | 一种基于多重荧光pcr的egfr突变基因检测方法 |
| CN111363810A (zh) * | 2018-12-25 | 2020-07-03 | 河南爱微迪生物技术有限公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
| CN111363810B (zh) * | 2018-12-25 | 2023-10-20 | 郑州方欣生物科技有限责任公司 | 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 |
| CN110373454A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-10-25 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种联合检测egfr基因突变的试剂盒及方法 |
| CN110923325A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-27 | 阅尔基因技术（苏州）有限公司 | 用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法 |
| CN112322733A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-02-05 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 检测egfr基因突变的核酸组合物及试剂盒和egfr基因突变的检测方法 |
| CN113088573A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-09 | 人和未来生物科技（长沙）有限公司 | 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108949927B (zh) | 2022-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108949927A (zh) | 一种用于检测人类egfr基因突变的序列组合物及其试剂盒 | |
| CN109457018A (zh) | 一种基于多重荧光pcr的egfr突变基因检测方法 | |
| CN104513864B (zh) | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN106399555A (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒 | |
| CN104818318B (zh) | 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 | |
| CN102747157A (zh) | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN107447013B (zh) | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 | |
| Leblanc et al. | Biomarkers of cetuximab resistance in patients with head and neck squamous cell carcinoma | |
| CN105803088A (zh) | 一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒 | |
| CN103382503A (zh) | Egfr基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104131091A (zh) | 用于检测人类egfr基因突变的引物及方法 | |
| CN111518909B (zh) | Mettl2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用 | |
| CN109306379A (zh) | 用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、检测方法及试剂盒 | |
| CN105803076A (zh) | 检测egfr基因t790m位点的特异性引物及探针 | |
| Hirotsu et al. | Microsatellite instability status is determined by targeted sequencing with MSIcall in 25 cancer types | |
| CN110863053A (zh) | 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法 | |
| Wei et al. | Analysis of gene mutation associated with tyrosine kinase inhibitor sensitivity of epidermal growth factor receptor in cervical cancer patients. | |
| CN114107492B (zh) | 一种用于肿瘤分子分型、治疗用药评估的分子标志物及其检测引物和试剂盒 | |
| CN109097470A (zh) | 一种基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法 | |
| CN108130362A (zh) | 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用 | |
| CN112126681A (zh) | 一种检测人nras基因突变的pcr试剂盒 | |
| CN109295177A (zh) | 一种人类egfr基因微量突变富集预处理的引物、方法及试剂盒 | |
| Nagaoka et al. | Downregulation of epidermal growth factor receptor family receptors and ligands in a mutant K-ras group of patients with colorectal cancer | |
| CN106544401B (zh) | 检测人类egfr基因突变的试剂盒 | |
| CN108949926A (zh) | 一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20181207 Assignee: Joinstar Biomedical Technology Co.,Ltd. Assignor: SHANGHAI MAG-GENE NANOTECH Co.,Ltd. Contract record no.: X2020980004307 Denomination of invention: Sequence composition and kit for detecting mutation of human EGFR gene License type: Exclusive License Record date: 20200723 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |