CN107653303A

CN107653303A - 一种用于检测egfr基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN107653303A
Application number: CN201710940729.0A
Authority: CN
Inventors: 李葆华; 蒋析文; 刘悦; 甘小洪; 马道亮
Original assignee: Guangzhou Tat Technology Co Ltd Liffey Diagnostic Products
Current assignee: INVITROGEN (SHANGHAI) TRADING Co.,Ltd.
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2018-02-02

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法，所述扩增引物具有如SEQ ID No:1～8所示的碱基序列，所述测序引物具有如SEQ ID No:9～12所示的碱基序列。本发明的检测EGFR基因突变的引物特异性强，灵敏度高；本发明的检测EGFR基因突变的方法采用独创的引物进行扩增测序，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中EGFR基因主要突变位点型别，检测位点包括EGFR基因18、19、20和21四个外显子的29个突变位点，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

Description

一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于检测EGFR 基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法。

背景技术

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR (ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR也被称作 HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFα(transforming growthfactorα)。激活后， EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，激活前也存在二聚体。EGFR 基因由28个外显子组成。其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，迄今为止发现的EGRF基因突变主要位于外显子18-21。

肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼，能特异性地抑制具有EGFR基因突变的非小细胞肺癌的生长，改善预后。因此，在使用酪氨酸激酶抑制剂治疗前，《非小细胞肺癌临床实践指南》推荐进行EGFR的突变检测。

目前市场主要的检测技术有：

EGFR基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测EGFR 基因的技术具有重要的临床意义。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于检测EGFR 基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物，所述扩增引物包括：针对EGFR 基因Exon18突变的SEQ ID No:1和SEQ ID No:2、针对EGFR基因Exon19突变的 SEQ ID No:3和SEQ ID No:4、针对EGFR基因Exon20突变的SEQ ID No:5和SEQ ID No:6、以及针对EGFR基因Exon21突变的SEQ ID No:7和SEQ ID No:8。

本发明还提供了一种用于检测EGFR基因突变的测序引物，所述测序引物包括：针对EGFR基因Exon18突变的SEQ ID No:9、针对EGFR基因Exon19突变的 SEQ ID No:10、针对EGFR基因Exon20突变的SEQ ID No:11、以及针对EGFR基因Exon21突变的SEQ ID No:12。

本发明还提供了一种检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述扩增引物和测序引物。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系，UNG (UDG)/dUTP体系是一种防污染体系，能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括热启动Taq酶，热启动Taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，Taq酶才能发挥作用，热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品为EGFR阴性质控品、EGFR野生型阳性质控品、EGFR Exon19突变型阳性质控品、和EGFR Exon18突变型阳性质控品。

本发明还提供了检测EGFR基因突变的方法，使用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；

(2)、以上述DNA作为模板，利用扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物，纯化扩增产物；

(3)、利用测序引物对上述PCR扩增产物进行测序PCR反应，对测序PCR反应后的产物进行Sanger测序，确定EGFR基因突变位点。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：EGFR PCR 反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述EGFR PCR反应液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂0.5ul、25mM dNTPs 1ul、H₂O 30.5ul；所述酶反应液包括UNG 酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min； 95℃15min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃45s，40个循环；72℃7min。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物(根据配制的浓度计算所需的体积)10-50ng、BigDye(ABI)2ul、BigDye Sequencing Buffer(ABI)3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应程序为：96℃ 1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。

双脱氧终止法是上个世纪70年代由弗雷德·桑格尔发明的，他因此于1980 年再度获得了诺贝尔奖。2001年，Allan Maxam和Walter Gibert发明了Sanger 测序法。Sanger测序利用双脱氧终止法，即在Sanger测序反应中，利用碱基互补的原则合成新的DNA链，然而在测序引物延伸的过程中，如果遇到带有荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)时，DNA的合成就会终止，产生长短不一，带有荧光标记的DNA片段。复制的DNA片段带有负电荷，在毛细管电泳中会朝正极移动。不同长度的片段移动速度不同，因此到达检测窗口的时间也不同。当DNA片段通过检测窗口时，被标记的ddNTP的荧光被激活产生不同颜色的信号，从而读取原始DNA序列上每个位置的碱基序列。sanger测序是目前使用最普遍的DNA序列分析技术，可分析未知DNA序列，且单向反应的读序能力较长，是行业内金标准，准确度高。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的检测EGFR基因突变的引物是针对EGFR基因Exon18、19、20 和21四个外显子的保守序列，设计特异性引物，特异性强，灵敏度高；

2、本发明的检测EGFR基因突变的方法采用独创的引物进行扩增测序，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中 EGFR基因主要突变位点型别，检测位点包括EGFR基因18、19、20和21四个外显子的29个突变位点，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

附图说明

图1是本发明的检测EGFR基因突变方法的流程图；

图2～5是试验例1中使用本发明的方法对EGFR野生型阳性质控品的检测结果图；

图6是试验例2中使用本发明的方法对EGFR 19号外显子突变型阳性质控品的检测结果图；

图7是试验例3中使用本发明的方法对EGFR 21号外显子突变型阳性质控品的检测结果图；

图8是试验例4中使用本发明的方法对未知样品的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

本发明中所涉及的专业术语解释如下：

ddNTP:双脱氧核苷酸

EGFR:上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体

Sanger测序:双脱氧链终止法

PCR：聚合酶链式反应

实施例1检测EGFR基因突变的引物

基于Sanger测序技术的EGFR基因突变检测的引物，包括扩增引物和测序引物。

根据EGFR基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从EGFR基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计EGFR基因Exon18、19、20和21四个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID No： 1-8。

用于测序PCR产物的测序引物，测序引物的设计与用于扩增样本中DNA 的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一条即可，引物序列是SEQ ID No：9～12，长度在17-25个碱基。

实施例2检测EGFR基因突变的试剂盒

本实施例的检测EGFR基因突变的试剂盒包括下表组分：

`1、PCR检测试剂，包括扩增引物(具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列)、Tris盐酸Buffer、热启动Taq酶(热启动Taq酶采用化学修饰，经95℃热激15分钟，Taq酶才能发挥作用，热启动Taq酶可减少引物二聚体的形成增加反应特异性)。

2、PCR测序试剂，包括测序引物(具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列)、测序染料(BigDye)、测序反应液(BigDye Sequencing Buffer)、高纯度去离子甲酰胺(Hi-DiFormamide)

3、质控品，包括EGFR阴性质控品、EGFR野生型阳性质控品、EGFR12号密码子突变型阳性质控品、EGFR13号密码子突变型阳性质控品；

4、UNG(UDG)/dUTP体系，UNG(UDG)/dUTP体系是一种防污染体系，能消除因PCR产物污染引起的假阳性检测结果。

实施例3检测EGFR基因突变的方法

请参阅图1，为本发明检测EGFR基因突变的方法的操作流程图；本实施例的检测EGFR基因突变的方法包括以下步骤：

1、PCR扩增

从试剂盒中取出EGFR PCR反应液(18-21)、EGFR酶系，室温融化后震荡混匀，8000,rpm离心数秒后使用。

18、20外显子测序：取N个(N＝待测样本个数+EGFR阴性质控品+EGFR 野生型阳性质控品)反应管

19外显子测序：取N个(N＝待测样本个数+EGFR阴性质控品+EGFR野生型阳性质控品+EGFR突变型阳性质控品(19))反应管

21外显子测序：取N个(N＝待测样本个数+EGFR阴性质控品+EGFR野生型阳性质控品+EGFR突变型阳性质控品(21))反应管

单人份EGFR18-21外显子PCR扩增体系配制如下表:

组分	EGFR(18-21)反应液	EGFR酶系	总体积
				用量	37μl	3μl	40μl

将各组分充分混合，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将40μl扩增体系分装到PCR管中。

2、加样(样本制备区)

往上述PCR反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、 EGFR阴性质控品、EGFR野生型阳性质控品、EGFR突变型阳性质控品(19)、 EGFR突变型阳性质控品(21)各10μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增区。

3、PCR扩增(扩增区)

将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：50℃2分钟，95℃15分钟预变性，然后按(94℃30秒→55℃30秒→72℃45秒)×40个循环扩增；最后 72℃延伸7分钟。

4、产物纯化(产物分析区)

PCR扩增结束以后，取5μlPCR产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增(18外显子PCR目的条带大小为382bp；19外显子PCR目的条带大小为297bp；20外显子PCR目的条带大小为390bp；21外显子PCR目的条带大小为304bp)，如观察到明显的单一目的条带，则将上述PCR产物及时进行纯化，具体操作详见PCR产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的PCR产物进行电泳鉴定定值(PCR产物浓度范围为10-50ng)，可立即进行测序PCR或置于-20±5℃保存备用(保存时间不要超过2天)。

5、测序PCR

经过电泳鉴定定值的PCR产物，按下述表格配制测序PCR体系：

试剂	用量
		PCR产物	Xμl(约10-50ng)
BigDye	2μl
		BigDye Sequencing Buffer	3μl
测序引物	1μl
		无菌纯化水	14-Xμl
总体积	20μl

无菌纯化水用量视PCR产物加入体积而定，总体积应

为20μl。

将各反应管放入定性PCR仪，按下列条件扩增：96℃1分钟→(96℃10 秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25个循环→4℃保温。

6、测序PCR产物纯化后的核酸即可用于测序

7、加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有IVD标志的 Seq_std_BDTV3.1_ASSYXL_POP7或Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7进行测序。使用ABI基因分析仪时，应用ABI公司Data与Sequencing Analysis软件进行数据收集和分析。Data与Sequencing Analysis分析软件的进一步信息请参阅Data与AnalysisSoftware用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1 格式的文件。

8、结果分析

8.1运行SeqScanner程序，导入测序结果。

8.2(1)EGFR外显子18：按Find快捷键，找到序列“CAAAGTGCTG”。

(2)EGFR外显子19：按Find快捷键，找到序列“TATCAA”。(3) EGFR外显子20：按Find快捷键，找到序列“GTGATGGCCA”；找到序列 “CTCATCA”。

(4)EGFR外显子21：按Find快捷键，找到序列“GATTTTGGGC”。

如果不能找到此序列，可能样本序列个别碱基发生突变情况，应校正后重新查找。

8.3突变分析：

(1)EGFR外显子18：从找到的序列往后的第1-3个碱基，野生型为GGC；否则为EGFR外显子18突变，详细如下表。

(2)EGFR外显子19：从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为GGAATTAAGAGA；否则为EGFR外显子19突变，详细如下表。

(3)EGFR外显子20：从找到的序列往后的第1-21个碱基，野生型为GCGTGGACAACCCCCACGTGT；从找到的序列往后的第1个碱基，野生型为 C；否则为EGFR外显子20突变，详细如下表。

(4)EGFR外显子21：从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为T；否则为EGFR外显子21突变。详细如下表。

试验例1使用本发明的方法对EGFR野生型阳性质控品进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对野生型阳性质控品(细胞核酸，自制) 进行检测。

1.运行SeqScanner程序，导入测序结果。

2.(1)EGFR外显子18：按Find快捷键，找到序列“CAAAGTGCTG”。

(2)EGFR外显子19：按Find快捷键，找到序列“TATCAA”。

(3)EGFR外显子20：按Find快捷键，找到序列“GTGATGGCCA”；找到序列“CTCATCA”。

(4)EGFR外显子21：按Find快捷键，找到序列“GATTTTGGGC”。

3.突变分析：

(1)EGFR外显子18：从找到的序列往后的第1-3个碱基，野生型为GGC；否则为EGFR外显子18突变。

(2)EGFR外显子19：从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为 GGAATTAAGAGA；否则为EGFR外显子19突变。

(3)EGFR外显子20：从找到的序列往后的第1-21个碱基，野生型为GCGTGGACAACCCCCACGTGT；从找到的序列往后的第1个碱基，野生型为C；否则为EGFR外显子20突变。

(4)EGFR外显子21：从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为T；任一个T突变则为EGFR外显子21突变。

结果分析：由该样本EGFR18,19,20,21外显子测序结果判断，该样本为EGFR 野生型，结果如图2～5所示。

试验例2使用本发明的方法对EGFR外显子19突变型阳性质控品进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对EGFR外显子19突变型阳性质控品进行检测。

1.运行SeqScanner程序，导入测序结果。

2.EGFR外显子19：按Find快捷键，找到序列“TATCAA”从找到的序列往后的第1-12个碱基，野生型为GGAATTAAGAGA；否则为EGFR外显子19 突变。结果分析：由该样本EGFR19外显子测序结果判断，该样本为EGFR外显子19突变型，结果如图6所示。

试验例3使用本发明的方法对EGFR外显子21突变型阳性质控品进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对EGFR外显子21突变型阳性质控品进行检测。

1.运行SeqScanner程序，导入测序结果。

2.EGFR外显子21：按Find快捷键，找到序列“GATTTTGGGC”从找到的序列往后的第1个碱基和第10个碱基，野生型为T；任一个T突变则为EGFR 外显子21突变。结果分析：由该样本EGFR21外显子测序结果判断，该样本为 EGFR外显子21突变型，结果如图7所示。

试验例4使用本发明的方法对未知样品进行检测

使用本发明实施例3的检测方法，对待检临床标本(非小细胞肺癌患者石蜡包埋肺部癌组织)进行检测。

1.运行SeqScanner程序，导入测序结果。

2.(1)EGFR外显子18：按Find快捷键，找到序列“CAAAGTGCTG”。

(2)EGFR外显子19：按Find快捷键，找到序列“TATCAA”。

(3)EGFR外显子20：按Find快捷键，找到序列①“GTGATGGCCA”；找到序列②“CTCATCA”。

(4)EGFR外显子21：按Find快捷键，找到序列“GATTTTGGGC”。

3.突变分析：

(3)EGFR外显子20：从找到的序列①往后的第1-21个碱基，野生型为GCGTGGACAACCCCCACGTGT；从找到的序列②往后的第1个碱基，野生型为C；否则为EGFR外显子20突变。

结果分析：由该样本EGFR18,19,20,21外显子测序结果判断，该样本为EGFR 野生型21外显子L858R突变型，结果如图8所示。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州立菲达安诊断产品技术有限公司

<120> 一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ctgtgtttct accaacttct gtcaa 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

tccccaccag accatgag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

agatcactgg gcagcatgt 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

gacatagaaa gtgaacattt aggat 25

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ccctgcgtaa acgtccct 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ctcccctccc cgtatctc 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

tcagtagtca ctaacgttcg cc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

tccttacttt gcctccttct g 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

tccccaccag accatgag 18

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

gacatagaaa gtgaacattt aggat 25

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

ctcccctccc cgtatctc 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

tccttacttt gcctccttct g 21

Claims

1.一种用于检测EGFR基因突变的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括：针对EGFR基因Exon18突变的SEQ ID No:1和SEQ ID No:2、针对EGFR基因Exon19突变的SEQ ID No:3和SEQ ID No:4、针对EGFR基因Exon20突变的SEQ ID No:5和SEQ ID No:6、以及针对EGFR基因Exon21突变的SEQ ID No:7和SEQ ID No:8。

2.一种用于检测EGFR基因突变的测序引物，其特征在于，所述测序引物包括：针对EGFR基因Exon18突变的SEQ ID No:9、针对EGFR基因Exon19突变的SEQ ID No:10、针对EGFR基因Exon20突变的SEQ ID No:11、以及针对EGFR基因Exon21突变的SEQ ID No:12。

3.一种检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的扩增引物和权利要求2所述的测序引物。

4.根据权利要求3所述的检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UNG(UDG)/dUTP体系。

5.根据权利要求4所述的检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热启动Taq酶。

6.根据权利要求5所述的检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品为EGFR阴性质控品、EGFR野生型阳性质控品、EGFR Exon19突变型阳性质控品、和EGFR Exon21突变型阳性质控品。

7.一种检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，使用权利要求3～6任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)、提取、纯化待测样品中的DNA；

8.根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：EGFR PCR反应液37ul、酶反应液3ul、模板10ul；所述PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃15min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃45s，40个循环；72℃7min；所述EGFR PCR反应液包括10X PCR buffer 5ul、25mM MgCl₂ 0.5ul、25mM dNTPs 1ul、H₂O30.5ul；所述酶反应液包括UNG酶0.1ul、热启动Tag酶0.5ul，余量为超纯水和甘油。

9.根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，步骤(3)中所述测序PCR反应的反应体系为：PCR扩增产物(根据配制的浓度计算所需的体积)10-50ng、BigDye2ul、BigDye Sequencing Buffer 3ul、测序引物1ul、无菌纯化水加至20ul；步骤(3)中所述测序PCR反应的反应程序为：96℃1min；96℃10s、50℃5s、60℃4min，25个循环；4℃保温。