CN107488728A - 3d数字pcr检测egfr特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

3d数字pcr检测egfr特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。其中，该引物探针组合物包括：检测EGFR基因19～21号外显子特定突变的引物及探针，突变为EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。应用本发明的3D‑PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物，包含了与肺癌相关的4个常见突变位点，根据不同突变位点设计的引物及探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D‑PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。

Description

3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒 及方法
技术领域
本发明涉及3D-PCR检测领域，具体而言，涉及一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。
背景技术
国际癌症研究中心(IARC)预计，癌症发病人数将会以每年3％～5％的速度递增，并有调查研究显示中低收入国家癌症的发病率远高于发达国家，预计在2020年全球将有2000万新发病例的产生，死亡病例将达1200万。所以各国对癌症采取的预防措施刻不容缓。每年我国用于癌症病人的医疗支出高达800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近些年来，我国癌症的发病率逐年提高，尤其是肺癌发病率逐年上升。研究显示，肺癌发病率居癌症发病率首位，并有相关报道显示：全球肺癌新发病例约为161万例，死亡约138万例，约占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，但肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍＜20％。
研究显示：癌症相关基因出现异常导致肿瘤细胞逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等现象的出现。传统的肿瘤治疗主要针对细胞DNA，这种传统治疗的方法往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，一些正常的细胞也被错杀。近些年来，肿瘤的诊断方法和治疗手段不断提高，尤其是靶向治疗的出现，使肿瘤的死亡率得到了有效的控制。靶向治疗具有高选择性和低毒性等优点，可以长期指导临床用药，其作用机理是针对肿瘤细胞特有的靶点设计结合药物，避免了传统治疗方法的缺点，从而达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用，对患者而言不仅延长了患者的生存时间还改善了患者的生存质量。
研究表明，EGFR基因突变主要发生在第19～21号外显子，包括第19号外显子的缺失突变，第20号外显子的片段插入和第21号外显子的点突变，约占EGFR基因突变的90％。第19号外显子的缺失导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKIs的敏感性；引起耐药的主要原因是第20号外显子第790位密码子(核苷酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变；第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。
目前，检测基因变异的技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法，方法简介于下：
Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法。其基本原理为每个反应含有所有四种脱氧核苷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的位置上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记，并将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，由于ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP(4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同，计算机即可根据颜色判断在这个位置上碱基究竟是哪一个(A、T、G、C)。
ARMS法，为突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。引物3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。
然而，上述两种方法都存在检测灵敏度低的缺陷。
发明内容
本发明旨在提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法，以提高检测肺癌基因突变的检测灵敏度。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物。该引物探针组合物包括：检测EGFR基因19～21号外显子特定突变的引物及探针，突变为EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。
进一步地，检测EGFR基因19～21号外显子突变的引物及探针如下表1所示：
表1：
根据本发明的另一个方面，提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种引物探针组合物。
进一步地，试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在。
进一步地，试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选阳性质控品为含有EGFR基因突变的DNA与野生型DNA的混合液。
进一步地，试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。
根据本发明的再一个方面，提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的方法。该方法包括：利用上述任一种试剂盒配制每个突变位点的PCR反应体系；将各突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；将数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；将得到扩增结果的数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据荧光信号判读EGFR特定基因的突变结果。
进一步地，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(-)区以及FAM(-)VIC(+)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，根据荧光信号判读EGFR特定基因的突变结果的步骤包括：若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定待测样本为阳性样本；若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定待测样本为阴性样本或低于检测限。
应用本发明的3D-PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物，包含了与肺癌相关的4个常见突变位点，根据不同突变位点设计引物及探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D-PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1A至图4B示出了根据本发明的实施例的1中采用本申请的4个肺癌基因突变检测引物和探针与对比引物和探针的检测结果图；其中，
图1A示出了采用EGFR基因的T790M突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图1B示出了采用本申请的EGFR基因的T790M突变的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图2A示出了采用EGFR基因的L858R突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图2B示出了采用本申请的EGFR基因的L858R突变的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；
图3A示出了采用EGFR基因的2235-2249del突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图3B示出了采用EGFR基因的2235-2249del突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图；以及
图4A示出了采用EGFR基因的2236-2250del突变的对比引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图，图4B示出了采用EGFR基因的2236-2250del突变的本申请的引物和探针进行3D数字PCR检测的结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中检测EGFR基因突变的方法存在检测效率低的缺陷，本发明提出了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物。该引物探针组合物包括：检测EGFR基因19～21号外显子突变的引物及探针，突变为EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。
应用本发明的3D-PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物，由于包含了与肺癌相关的4个常见突变位点，根据不同突变位点设计的引物及探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D-PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。
优选的，检测EGFR基因19～21号外显子特定突变的引物及探针如下表1所示：
表1：
其中，引物对含目的突变的片段的扩增效率较高，而野生探针能够特异与扩增片段中的野生型模板结合，突变探针能够特异与扩增片段中的突变型模板结合，从而使得检测特异性更高。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种引物探针组合物。该试剂盒所适用的3D数字PCR系统包括硅芯片、加载系统和荧光分析仪及其相关的耗材。该系统采用高密度的纳升流控芯片技术，将样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中，并使用热循环仪进行PCR扩増DNA，扩增后采用3D数字PCR系统进行荧光读取，逐个分析样品中的荧光信号。最终根据泊松分布原理以及空白孔的比例，利用系统自带的分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。
本发明试剂盒检测的基因突变位点信息见以下表2。
表2
为了进一步提高本申请的试剂盒的使用便利性和检测准确性，试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在，这样对于同一检测样本，在配制PCR反应体系时，不需要对引物和探针进行分别添加，提高检测效率。
根据本发明一种典型的实施方式，试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选阳性质控品为含有EGFR基因突变的DNA与野生型DNA的混合液。其中，含有EGFR基因突变的DNA采用含有EGFR基因突变的细胞系DNA或基因合成的突变DNA(4种突变DNA中可以有1种是基因合成的)与不含有相应突变的野生型细胞系DNA按照特定比例进行混合，形成DNA混合液。这样的阳性质控品相比化学合成的DNA质控品，更接近待测样本中DNA的真实状态，因而，检测结果也较合成的DNA更准确。
在本发明一种典型的实施方式中，阳性质控品来源如表3所示：
表3
基因 突变类型 细胞系名称
EGFR T790M NCI-H1975
EGFR L858R NCI-H1975
EGFR EGFR 2235_2249del15 PC-9
EGFR EGFR 2236_2250del15 基因合成
为了使3D数字PCR反应检测更快速，更高效，试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。
根据本发明一种典型的实施方式，具体地，本申请试剂盒的组成见以下表4。
表4
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的方法。该方法包括：利用上述任一种试剂盒配制每个突变位点的PCR反应体系；将各突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；将数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；将得到扩增结果的数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据荧光信号判读EGFR特定基因的突变结果。利用本申请的试剂盒进行EGFR特定突变基因的检测，不仅检测灵敏度高，而且检测效率和准确性均很高。
根据本发明一种典型的实施方式，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(-)区以及FAM(-)VIC(+)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，根据荧光信号判读EGFR特定基因的突变结果的步骤包括：若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定待测样本为阳性样本；若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定待测样本为阴性样本或低于检测限。
上述实施方式中，根据荧光信号判读EGFR特定基因的突变结果的步骤根据不同对照样本的荧光值强弱进行合理设定即可，并不仅限于≥P对照荧光值，还可以根据根据人工判断选择小于P对照荧光值，但明显能够确定属于阳性的荧光信号或属于阴性的荧光信号的，也可以手动调节相应的荧光值范围。
下面详细介绍本申请的引物、探针、试剂盒的检测过程。
一、主要原材料
a)靶位点
将EGFR 2235_2249del15、EGFR 2236_2250del15、EGFR L858R和EGFR T790M基因作为靶序列。
b)引物、探针
从GenBank上下载EGFR 19del、EGFR L858R和EGFR T790M基因序列，根据引物探针设计原则，通过Primer Express3.0软件设计特异性引物及TaqMan MGB探针。引物和探针分别购自金唯智生物科技有限公司和赛默飞世尔科技公司。
c)阴阳性质控品
阴性质控品为野生型细胞系基因组DNA，本公司培养和提取DNA。
阳性质控品为突变细胞系(EGFR 2235_2249del15、EGFR L858R和EGFR T790M)基因组DNA，基因合成的EGFR 2236_2250del15与野生型细胞系基因组DNA按比例混合的混合液，本公司培养、提取DNA及后期混合。
d)芯片及其缓冲液混合物(Buffer mix)
采用QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix v2和QuantStudioTM3D DigitalPCR 20K Chip Kit v2，购自赛默飞世尔科技公司。
二、本申请试剂盒的操作方法为：
1.待测样本：
待测样品来源为肿瘤石蜡包埋(FFPE)样本中提取的DNA。
2.检测方法：
一种检测人类EGFR基因突变的芯片式数字PCR方法，包括以下步骤：从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液，配制体系如下表5：
表5
试剂组分 加入体积(uL)
2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix 7.5
引物探针混合液 0.375
DNA样本 30ng
ddH2O 补足至总体积15ul
(1)配制上述检测人类EGFR基因突变的反应体系；
(2)把反应体系14.5ul上样到数字PCR芯片中；
(3)把数字芯片放入到专用数字PCR仪中，进行PCR扩增；
(4)从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后，将芯片放入到芯片扫描仪中扫描荧光信号；
(5)根据荧光信号判读结果。
PCR扩增程序如下表6：
表6
3.分析数据及显示结果：
对PCR扩增后的产物进行荧光信号的收集，检测FAM和VIC的荧光信号。根据设计的探针类型、两种荧光信号的点数及比例判断样本是否含有突变基因、计算突变率等。
ddPCR结果图分为4个象限：FAM+VIC-区、FAM+VIC+区、FAM-VIC-区和FAM-VIC+区。
1)根据阳性对照结果图中成簇蓝色点的荧光值，划出阴性对照和样本的蓝色点。比如阳性对照蓝色点荧光值在5000附近，则样本的蓝色点必须同时满足下列2个条件：①落在“FAM+VIC-”区②FAM荧光值在5000左右且成簇分布；
2)阴性对照有效性判定：蓝色点<3个；
3)样本阴阳性判定：样本蓝色点≥3个，则判定有相关位点突变；样本蓝色点<3个，则判定无相关突变或低于最低检测限。
注释：
黄色：既没有FAM荧光信号也没有VIC荧光信号的点代表该微孔没有进入DNA模板，因此没有任何扩增信号，即无模板(ROX，左下)；
红色：有VIC荧光信号但没有FAM荧光信号的点代表该微孔进入了野生型模板，因此有VIC荧光信号，即野生型模板(VIC，右下)；
蓝色：有FAM荧光信号但没有VIC荧光信号的点代表该微孔进入了突变的DNA模板，因此有FAM荧光信号产生，即突变型模板(FAM，左上)；
绿色：既有FAM荧光信号也有VIC荧光信号的点代表该微孔同时进入了野生型和突变型两种模板，因此同时出现了FAM+VIC信号，即混合模板(野生型+突变型，右上)。
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1：本申请试剂盒的引物探针效果检测
1.制备本申请试剂盒的引物探针
选用表1中的EGFR的引物和探针；选用表7其他合成的EGFR的引物和探针进行对比。
表7
2.扩增试剂准备
从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液，配制体系如下表8：
表8
试剂组分 加入体积(uL)
2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix 7.5
引物探针混合液 0.375
DNA样本 30ng
ddH2O 补足至总体积15ul
3.加样
把反应体系14.5ul上样到数字PCR芯片中。
4.PCR扩增
PCR扩增程序为：
96℃，10min；(60℃，2min；98℃，30sec)39个循环；60℃，2min；10℃，保温，反应体系设为14.5μl。
5.读取数据
从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后，将芯片放入到芯片扫描仪中扫描荧光信号。
6.结果
结果见附图1A至图4B。图1A、图2A、图3A和图4A中的荧光信号均没有明显的分布在四个区域，而图1B、图2B、图3B和图4B为本发明实施例的试剂盒产品的检测结果，四个区域均成簇出现荧光信号，与背景有明确分界线。说明，本申请试剂盒的引物探针检测效果更好。
实施例2：本申请试剂盒的最低检出限检测
1.制备最低检测限质控品
选用EGFR基因T790M、L858R及19del(2235-2249和2236-2250)突变和阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制各突变体的最低限质控品。
DNA模板量为30ng，突变比例为0.2％的样本作为本实施例的检出限质控品。最低检测限质控品具体如表9所示：
表9
2.其他步骤同实施例1
3.重复检测20次，检测得到的实验结果如表10所示：
表10
名称 定性结果
EGFR T790M 阳性
EGFR L858R 阳性
EGFR 2235-2249del 阳性
EGFR 2236-2250del 阳性
由表10的实验结果可知，DNA模板量为30ng，本申请试剂盒能检出0.2％的EGFR基因突变。
实施例3：本申请试剂盒的重复性检测
1.制备重复性质控品
选用EGFR基因T790M、L858R及19del(2235-2249和2236-2250)突变的DNA和EGFR阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制突变体的突变比例为1％的标本，作为本实施例的重复性质控品。具体如表11所示：
表11
2.其他步骤同实施例1
3.重复检测10次，检测得到的实验结果如表12-表15所示：
表12
由表12的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表13
由表13的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表14
由表14的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
表15
由表15的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
实施例4：本申请试剂盒的抗干扰实验
选用含有与EGFR基因T790M、L858R及19del(2235-2249和2236-2250)相邻突变(EGFR S768I、EGFR G719S)的细胞系DNA和KRAS Q61L细胞系DNA，具体细胞系突变信息如表16所示，作为本实施例的抗干扰质控品。具体如表17所示：
表16
细胞系名称 突变位点 突变
KYSE450 EGFR S768I c.2303G>T
SW48 EGFR G719S c.2155G>A
SW948 KRAS Q61L c.182A>T
表17
细胞系名称 标本种类
KYSE450 EGFR基因S768I突变的细胞系DNA
SW48 EGFR基因G719S突变的细胞系DNA
SW948 KRAS基因Q61L突变的细胞系DNA
2.其他步骤同实施例1
3.重复检测2次，检测得到的实验结果如表18-表20所示：
表18
由表18的实验结果可知，含EGFR S768I突变的细胞系DNA，检测试剂盒的4个位点结果阴性符合率100％。
表19
由表19的实验结果可知，含EGFR G719S突变的细胞系DNA，检测试剂盒的4个位点结果阴性符合率100％。
表20
由表20的实验结果可知，含KRAS Q61L突变的细胞系DNA，检测试剂盒的4个位点结果阴性符合率100％。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)目前市面上没有用于检测肺癌EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15多种突变位点的数字PCR试剂盒。而本发明的试剂盒可检测肺癌相关的4个常见突变位点，根据不同突变位点携带的不同荧光信号进行区分不同位点的突变，结果直观清晰；
2)灵敏度高：本试剂盒在复杂的检测背景下，检测灵敏仍可达0.1～0.2％，相比于ARMS方法的1％灵敏度更有优势；
3)特异性强：本试剂盒针对EGFR基因的多种突变设计了特定的引物和探针，所述引物和探针在PCR扩增反应时特异性强，扩增效率高，极大的减少了非特异性扩增造成的干扰；
4)本发明的试剂盒提供了阴阳性质控品，可以进行对照反应，保证了实验的质控；
5)操作简单快捷，与NGS相比，操作步骤少，周期短，成本低，反应通量灵活(1～24个样本均可)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 臻和（北京）科技有限公司
<120> 3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法
<130> PN73761ZHKEJ
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ggatcccaga aggtgagaaa gtt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
agcagaaact cacatcgagg att 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ggaattaaga gaagc 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gctatcaaaa catctc 16
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
ggatcccaga aggtgagaaa gtt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
agcagaaact cacatcgagg att 23
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
ggaattaaga gaagc 15
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
gctatcaaga catctc 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
gcctgctggg catctg 16
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
tctttgtgtt cccggacata gtc 23
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
atgagctgcg tgatgag 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
atgagctgca tgatgag 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
aacaccgcag catgtcaaga 20
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
ccgcacccag cagtttg 17
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
acagattttg ggctgg 16
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
cacagatttt gggcggg 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
gatcccagaa ggtgagaaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
gcagaaactc acatcgagga 20
<210> 19
<211> 13
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
ggaattaaga gaa 13
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
tatcaaaaca tctc 14
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
atcccagaag gtgagaaag 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
cagaaactca catcgagga 19
<210> 23
<211> 13
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
gaattaagag aag 13
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
ctatcaagac atct 14
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
gcctgctggg catc 14
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
ttgtgttccc ggacatagtc 20
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
atgagctgcg tgat 14
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
gagctgcatg atgag 15
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
aacaccgcag catgtcaa 18
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
ccgcacccag cagttt 16
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
acagattttg ggctg 15
<210> 32
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
cagattttgg gcgg 14

Claims (8)

1.一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括：
检测EGFR基因19～21号外显子特定突变的引物及探针，所述突变为EGFR T790M、EGFRL858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述检测EGFR基因19～21号外显子突变的引物及探针如下表1所示：
表1：
3.一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中扩增每个突变位点的引物及探针以引物探针混合液的形式存在。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选所述阳性质控品为含有所述EGFR基因突变的DNA与野生型DNA的混合液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QuantStudio 3D数字PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。
7.一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求3至6中任一项所述的试剂盒配制每个突变位点的PCR反应体系；
将各所述突变位点的PCR反应体系加样至数字PCR芯片中；
将所述数字PCR芯片放入数字PCR仪中进行PCR扩增，得到扩增结果；
将得到所述扩增结果的所述数字PCR芯片放到芯片扫描仪中进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判读所述EGFR特定基因的突变结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每个突变位点的PCR反应体系中，野生探针携带VIC信号，突变探针携带FAM信号，所述荧光信号扫描的结果中，扩增结果的二维图分为FAM(+)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(-)区以及FAM(-)VIC(+)区四个象限，将阳性对照在FAM(+)VIC(-)区的成簇突变点的FAM最小荧光值记为P，根据所述荧光信号判读所述EGFR特定基因的突变结果的步骤包括：
若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目≥3，则判定所述待测样本为阳性样本；
若待测样本位于FAM(+)VIC(-)区，且所述待测样本的FAM荧光值≥P的突变点的数目<3，则判定所述待测样本为阴性样本或低于检测限。
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