CN108642154A - 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 Download PDF

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CN108642154A CN201810555824.3A CN201810555824A CN108642154A CN 108642154 A CN108642154 A CN 108642154A CN 201810555824 A CN201810555824 A CN 201810555824A CN 108642154 A CN108642154 A CN 108642154A
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19del
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位玉玲
宋小慧
朱海涛
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本发明提供了用于检测EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子上特定突变的引物探针组合，和包含所述引物探针组合的用于多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的试剂盒，及其应用和使用方法。本发明的引物探针组合或试剂盒可高通量的检测EGFR基因29种突变位点，特异性强、灵敏度高、稳定性好，在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测上具重要意义，可以动态指导患者用药治疗。

Description

一种检测EGFR突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及肿瘤检测领域，更具体，涉及一种检测EGFR突变位点的引物探针组合、试剂盒及其应用和使用方法。
背景技术
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80％，大多数NSCLC在诊断时即处于进展期，对于具有EGFR敏感突变基因的患者来说，靶向治疗为其标准治疗。肿瘤组织的分子异常存在异质性，具有更高EGFR突变“丰度”的肿瘤患者可能从TKIs中获益更多，仅仅定性分析突变来指导靶向治疗已不能满足临床需求。
随着数字PCR(digital PCR,dPCR)、二代测序(next generation sequencing,NGS)等方法的出现，定量检测EGFR突变已经成为可能。多项临床试验证明，患者服用靶向药物过程中，可选择进行多次的动态监测血液中与药效相关驱动基因的突变丰度，以提示药物疗效评估患者病情进展，在此领域的应用中，高灵敏度、价格低廉的数字PCR技术具有极大优势。另外数字PCR技术验证临床样本中低于传统方法最低检出限的疑似阳性突变位，灵敏度和准确性更高，进而最大限度保证检测结果的全面和准确。
本发明旨在提供一种多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的试剂盒，可高通量检测EGFR基因29种突变位点，特异性强，灵敏度高。
发明内容
在本发明的一个方面，本发明提供了用于检测EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子上特定突变的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含下列中的一种或多种：
18外显子：
G719X
G719X-F：5’-GATCAAAGTGCTG-3’(SEQ ID NO:1)
G719X-R：5’-GTTCGGCACGGTGTA-3’(SEQ ID NO:2)
G719X-P1：5’-ROX-CGGAGGCCAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:3)
G719X-P2：5’-ROX-CCGGAGCACAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:4)
G719X-P3：5’-ROX-CCGGAGCTCAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:5)
19外显子：
19del-F：5’-AAAGTTAAAATTCCCGTCGC-3’(SEQ ID NO:6)
19del-R：5’-TTTCCTTGTTGGCTTTCGGA-3’(SEQ ID NO:7)
19del-P1：5’-FAM-CAAGGAGCCAACATCT-BHQ-3’(SEQ ID NO:8)
19del-P2：5’-FAM-CAAGGAACCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:9)
19del-P3：5’-CY5-CGCTATCAAGTCTCC-MGB-3’(SEQ ID NO:10)
19del-P4：5’-CY5-CGCTATCAAGGAATAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:11)
19del-P5：5’-ROX-AGCAATCTCCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:12)
19del-P6：5’-FAM-CAAGGAATCGAAAGC-MGB-3’(SEQ ID NO:13)
19del-P7：5’-ROX-CTATCAAGGCTC-MGB-3’(SEQ ID NO:14)
19del-P8：5’-ROX-CTATCAAGGCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:15)
19del-P9：5’-ROX-CTATCAAGACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:16)
19del-P10：5’-ROX-AGGATCCGAAAGC-BHQ-3’(SEQ ID NO:17)
19del-P11：5’-CY5-CGCTATCAAAACATCTC-BHQ-3’(SEQ ID NO:18)
19del-P12：5’-FAM-CAAGGAAGCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:19)
19del-P13：5’-ROX-CAAGGAACAGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:20)
19del-P14：5’-ROX-CTATCAAGGAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:21)
19del-P15：5’-FAM-CAAGGAATCTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:22)
19del-P16：5’-FAM-CAAGGAACCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:23)
19del-P17：5’-CY5-CGCTATCAAGGTTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:24)
19del-P18：5’-FAM-CAAGGAACCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:25)
19del-P19：5’-CY5-CGCTATCAAAATATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:26)
20外显子：
T790M
T790M-F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’(SEQ ID NO:27)
T790M-R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3’(SEQ ID NO:28)
T790M-P：5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:29)
S768I
S768I-F：5’-TTCTGGCCACCATGCGAAGC-3’(SEQ ID NO:30)
S768I-R：5’-GATGAGCTGCACGGTGGAGGT-3’(SEQ ID NO:31)
S768I-P：5’-ROX-TCCACGATGGCCA-MGB-3'(SEQ ID NO:32)
20ins：
20ins-F：5’-AAGCGTGTCAATTCTTAGCG-3’(SEQ ID NO:33)
20ins-R：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGT-3’(SEQ ID NO:34)
20ins-P1：5’-CY5-CGTGGCCAGCGTGGAC-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:35)
20ins-P2：5’-CY5-CAACCCCCACCACGTGTG-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:36)
20ins-P3：5’-CY5-CGTGGACGGTAACC-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:37)
21外显子：
L858R及L861Q
L858R-F：5’-GCAGCATGTCAAGATCACAGATT-3’,(SEQ ID NO:38)
L858R-R：5’-CC TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’(SEQ ID NO:39)
L858R-P：5'-FAM-TTTGGCCCGCCCAAAATCTGT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:40)
L861Q-P：5'-Cy5-CACCCAGCTGTTTGGCC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:41)
在本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包前面所述的引物探针组合。
优选地，所述检测为多重液滴数字PCR检测。
进一步地，所述试剂盒还包括人基因组14号染色体RnaseP基因作为内参，
所述内参引物探针序列如下：
RNaseP-F：5'-GCGGAGGGAAGCTCATCAGTG-3’(SEQ ID NO:42)
RNaseP-R：5'-CCCTAGTCTCAGACCTTCCCAA-3’(SEQ ID NO:43)
RNaseP-P：5'-FAM-ACATGGGAGTGGAGTGACAGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:44)。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品及阳性质控品，其中，
所述阳性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种突变型质粒；
所述阴性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种野生型质粒。
进一步地，所述试剂盒还包括荧光标记基团FAM、ROX、Cy5、VIC。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+。
优选地，所述探针引物组合以混合液形式存在，所述引物探针混合液分为三种，其中，
L858R、L861Q、S768I及内参探针引物组混合在混合液1中；
T790M、G719X(G719S、G719A、G719C)、20ins(3个插入突变)及内参探针引物组混合在混合液2中；
19Del(19种缺失突变)及内参探针引物组混合在混合液3中；
所述的混合液1、混合液2、混合液3中突变及内参的引物探针分别为20×引物探针混合浓度(引物浓度：20UM，探针浓度：5UM)。
在本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的引物探针组合或前面任一项所述的试剂盒在检测EGFR基因突变中的应用。
优选地，所述EGFR基因突变包含下列中的一个或多个：
在本发明的再一个方面，本发明提供了一种利用前面所述的引物探针组合或前面任一项所述的试剂盒来多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取样；
(2)配置液滴数字PCR反应体系；
(3)生成液滴；
(4)PCR扩增；
(5)读取荧光信号及分析结果。
优选地，在步骤(1)中，以基因工程构建的质粒作为阳性模板，以阴性血浆样本核酸做阴性对照。
优选地，在步骤(2)中，所述液滴数字PCR反应体系为15ul，如下：
反应腔一，检测L858R、L861Q、S768I突变体系：
2×预混液4 7.5μL
20×混合液1 0.75μL
阳性质粒(每种104拷贝/μL，3种混合) 1μL
内参质粒(10-4拷贝/μL) 0.5μL
ddH2O 2.25μL
总计 15μL
反应腔二，检测T790M、G719X、20ins突变体系：
2×预混液4 7.5μL
20×混合液2 0.75μL
阳性质粒(每种104拷贝/μL，3种混合) 3μL
内参质粒(104拷贝/μL) 0.5μL
ddH2O 2.25μL
总计 15μL
反应腔三，检测19Del突变体系：
优选地，在步骤(3)中，每个反应腔均生成约20000个液滴。
优选地，在步骤(4)中，PCR扩增的扩增体系如下：95℃，10分钟；95℃，15秒；60℃，1分钟；40个循环；25℃，5分钟。
优选地，在步骤(5)中，根据设计探针类型、及与VIC阳性信号点数、比值及阴性对照荧光分布来判定样本基因突变情况，其中，
突变探针L858R、L861Q、S768I由FAM、ROX、Cy5标记，内参由VIC标记；
突变探针T790M、G719X、20ins由FAM、ROX、Cy5标记，内参由VIC标记；
突变探针19Del由FAM/ROX/Cy5标记，内参用VIC标记。
本发明的显著效果：
本发明的引物探针组合、试剂盒及检测方法特异性强、灵敏度高，稳定性好，因而能够最大限度地保证检测结果的全面和准确。
检测灵敏度可达0.2％，在非小细胞肺癌EGFR基因突变检测上具重要意义。
本发明的引物探针组合、试剂盒及检测方法可以血浆DNA为样本，可进行多次的动态监测血液中与药效相关驱动基因的突变丰度，以提示药物疗效评估患者病情进展，从而能够动态指导患者用药治疗。
附图说明
图1为FAM-VIC散点分析图；
图2为Cy5-VIC散点分析图；
图3为Cy5-FAM散点分析图；
图4为ROX-VIC散点分析图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的试剂盒及检测EGFR突变位点的多重液滴数字PCR方法，可高通量检测EGFR基因29种突变位点，特异性强，灵敏度高。
“EGFR突变位点”，表皮生长因子受体(EGFR)是位于7号染色体短臂上的原癌基因HER-1的表达产物，是表皮生长因子受体家族中的4个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21号外显子，EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。研究表明，EGFR在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和非小细胞肺癌等。
本发明的多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的试剂盒，包含检测EGFR突变位点的引物探针组合物，该探针引物组合物包括可检测EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子上特定突变的引物探针，突变位点分别为：EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRT790M、EGFR S768I、EGFR G719X(G719S、G719A、G719C)、EGFR 20ins(3种)、EGFR 19Del(19种)，参见表1。
表1.EGFR 29种突变位点
本领域技术人员应该理解，本发明的探针引物组合或试剂盒能够检测表1中的一种或多种或全部突变，此外，本发明的探针引物组合或试剂盒能够检测的EGFR突变并不限于表1中示出的突变。
“引物”是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。
“探针”，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
在本发明的实施方式中，引物探针序列如下：
18外显子：
G719X
19外显子：
19del-F 5’-AAAGTTAAAATTCCCGTCGC-3’(SEQ ID NO:6)
19del-R 5’-TTTCCTTGTTGGCTTTCGGA-3’(SEQ ID NO:7)
19del-P1 5’-FAM-CAAGGAGCCAACATCT-BHQ-3’(SEQ ID NO:8)
19del-P2 5’-FAM-CAAGGAACCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:9)
19del-P3 5’-CY5-CGCTATCAAGTCTCC-MGB-3’(SEQ ID NO:10)
19del-P4 5’-CY5-CGCTATCAAGGAATAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:11)
19del-P5 5’-ROX-AGCAATCTCCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:12)
19del-P6 5’-FAM-CAAGGAATCGAAAGC-MGB-3’(SEQ ID NO:13)
19del-P7 5’-ROX-CTATCAAGGCTC-MGB-3’(SEQ ID NO:14)
19del-P8 5’-ROX-CTATCAAGGCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:15)
19del-P9 5’-ROX-CTATCAAGACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:16)
19del-P10 5’-ROX-AGGATCCGAAAGC-BHQ-3’(SEQ ID NO:17)
19del-P11 5’-CY5-CGCTATCAAAACATCTC-BHQ-3’(SEQ ID NO:18)
19del-P12 5’-FAM-CAAGGAAGCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:19)
19del-P13 5’-ROX-CAAGGAACAGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:20)
19del-P14 5’-ROX-CTATCAAGGAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:21)
19del-P15 5’-FAM-CAAGGAATCTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:22)
19del-P16 5’-FAM-CAAGGAACCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:23)
19del-P17 5’-CY5-CGCTATCAAGGTTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:24)
19del-P18 5’-FAM-CAAGGAACCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:25)
19del-P19 5’-CY5-CGCTATCAAAATATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:26)
20外显子：
T790M
S768I
S768I-F 5’-TTCTGGCCACCATGCGAAGC-3’(SEQ ID NO:30)
S768I-R 5’-GATGAGCTGCACGGTGGAGGT-3’(SEQ ID NO:31)
S768I-P 5’-ROX-TCCACGATGGCCA-MGB-3'(SEQ ID NO:32)
20ins：
21外显子：
L858R及L861Q
在一些实施方式中，可用于本发明的引物探针与上述探针的序列同一性至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％。
本领域技术人员应该理解，本发明的探针引物组合可以包括上述中的一种或多种或全部，此外，本发明的探针引物组合并不限于检测表1中示出的突变。
“内参”，是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果准确一致的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准。
在本发明的实施方式中，试剂盒包括以人基因组14号染色体RnaseP基因作为内参；
内参引物探针序列如下表：
RNaseP-F 5'-GCGGAGGGAAGCTCATCAGTG-3’(SEQ ID NO:42)
RNaseP-R 5'-CCCTAGTCTCAGACCTTCCCAA-3’(SEQ ID NO:43)
RNaseP-P 5'-FAM-ACATGGGAGTGGAGTGACAGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:44)
本领域技术人员应该理解，本发明并不限于RnaseP基因作为内参，本领域技术人员根据实际需要能够选择任何合适的内参，都在本发明涵盖的范围之内。
在本发明的实施方式中，本发明的多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的试剂盒包含上述所有引物探针组合，并且所述探针引物组合以混合液形式存在。
在一些实施方式中，所述引物探针混合液分为三种，其中L858R、L861Q、S768I及内参探针引物组混合在混合液1中，T790M、G719X(G719S、G719A、G719C)、20ins(3个插入突变)及内参探针引物组混合在混合液2中，19Del(19种缺失突变)及内参探针引物组混合在混合液3中；所述的混合液1、混合液2、混合液3中突变及内参的引物探针分别为20×引物探针混合浓度(引物浓度：20UM，探针浓度：5UM)。
本领域技术人员应该理解，本发明并不限于上述混合形式，本领域技术人员根据实际需要能够选择任何合适的混合形式，都在本发明涵盖的范围之内。
在本发明的实施方式中，试剂盒还包括液滴数字PCR预混液4，该预混液为dNTPs(2.5mM)、Taq酶(5U)、Mg2+(25mM)等混合而成的2×PCR缓冲液。
本领域技术人员应该理解，本发明并不限于上述PCR预混液，本领域技术人员根据实际需要能够选择任何合适的PCR预混液，都在本发明涵盖的范围之内。
在本发明的实施方式中，试剂盒还包括阴性质控品及阳性质控品，优选的阳性质控品为7种EGFR突变DNA混合液；更优选地，阳性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种突变型质粒；阴性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种野生型质粒；空白对照品为无核酸酶水。
本领域技术人员应该理解，本发明并不限于上述阴性质控品及阳性质控品，本领域技术人员根据实际需要能够选择任何合适的阴性质控品及阳性质控品，都在本发明涵盖的范围之内。
本发明提供了多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的方法。该方法包括利用上述试剂盒内PCR预混液及探针引物混合液配置检测EGFR各突变位点的PCR反应体系，其中混合液1中，突变探针(L858R、L861Q、S768I)由FAM、ROX、Cy5标记，内参由VIC标记；混合液2中，突变探针(T790M、G719X、20ins)由FAM、ROX、Cy5标记，内参由VIC标记；混合液3中，突变探针(19Del)由FAM/ROX/Cy5标记，内参用VIC标记。
本领域技术人员应该理解，本发明并不限于上述的荧光标记基团和标记方式，本领域技术人员根据实际需要能够选择任何合适的荧光标记基团和标记方式，都在本发明涵盖的范围之内。
在一些实施方式中，上述混合液1、混合液2、混合液3分别与PCR预混液4配置在3个PCR EP管内，并注入领航基因科技(杭州)有限公司的液滴反应芯片中，该芯片有三个反应腔，每个反应腔内注入1种PCR混合物，每个反应腔均生成约10000、约15000、约20000、约25000、约30000个液滴。本领域技术人员应该理解，任何合适的液滴反应芯片可以用于本发明中。
在一些实施方式中，将生成液滴后的芯片放置领航基因科技(杭州)有限公司的液滴PCR扩增仪内扩增，并将扩增后的芯片放置领航基因科技(杭州)有限公司的PCR阅读仪内进行荧光信号扫描，每个EGFR突变基因均携带FAM、ROX、Cy5荧光信号，内参携带VIC荧光信号。本领域技术人员应该理解，任何合适的液滴PCR扩增仪或PCR阅读仪可以用于本发明中。
根据荧光信号判断EGFR突变结果，在本发明的实施方式中，根据设计探针类型、及与VIC阳性信号点数、比值及阴性对照荧光分布来判定样本基因突变情况。
以FAM-VIC荧光信号读取为例解析液滴数字PCR结果分析图，见图1。分析结果图示分四个象限：FAM(+)VIC(-)区、FAM(-)VIC(-)区、FAM(+)VIC(+)区、FAM(-)VIC(+)区，四个区分别显示为不同颜色。样本阴阳性判定：左上荧光点≥3为阳，即样本存在相关基因位点突变；阴性对照判定：左上荧光点≤3为阴，即样本不存在相关位点突变或低于最低检测限。
注释：
左上荧光团：有FAM荧光信号但没有VIC荧光信号的点代表该微孔进入了突变的DNA模板，因此有FAM荧光信号产生，即突变型模板(FAM，左上)；
左下荧光团：既没有FAM荧光信号也没有VIC荧光信号的点代表该微孔没有进入DNA模板，因此没有任何扩增信号，即无模板(左下)；
右下荧光团：有VIC荧光信号但没有FAM荧光信号的点代表该微孔进入了内参模板，因此有VIC荧光信号(VIC，右下)；
右上荧光团：既有FAM荧光信号也有VIC荧光信号的点代表该微孔同时进入了内参和突变型两种模板，因此同时出现了FAM+VIC信号，即混合模板(FAM、VIC，右上)。
其余Cy5、ROX荧光信号分析图见图2、图3、图4(解读与判定标准见图下描述)。综上，一张液滴芯片可特异地检测EGFR基因29种突变。
本领域技术人员应该理解，任何合适的判断EGFR突变结果的方式都可以用于本发明，且在本发明涵盖的范围之内。
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应理解，下述具体实施例仅是为了用于说明本发明，并不对本发明内容进行任何限定。
实施例中所用材料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
实施例1
1.以基因工程构建的质粒作为阳性模板，以阴性血浆样本核酸做阴性对照。本发明试剂盒内含有混合液1(20×)、混合液2(20×)、混合液3(20×)及PCR预混液4(2×)。
2.体系配置：
液滴数字PCR反应体系：15ul，体系如下：
反应腔一，检测L858R、L861Q、S768I突变体系：
2×预混液4 7.5uL
20×混合液1 0.75uL
阳性质粒(每种104拷贝/uL，3种混合) 1uL
内参质粒(10-4拷贝/uL) 0.5uL
ddH2O 2.25uL
总计 15uL
反应腔二，检测T790M、G719X、20ins突变体系：
反应腔三，检测19Del突变体系：
2×预混液4 7.5uL
20×混合液2 0.75uL
阳性质粒(每种104拷贝/uL，19种混合) 3uL
内参质粒(104拷贝/uL) 0.5uL
ddH2O 2.25uL
总计 15uL
注：阴性对照体系如上述三个反应腔混合物，阳性质粒改为阴性对照核酸。
3.液滴生成
将三种PCR反应混合物，利用领航基因科技(杭州)有限公司的液滴生成仪加入领航基因科技(杭州)有限公司的液滴芯片三个反应腔，加样速度选用0.015μl/S，使液滴在芯片反应腔内平铺。阴性对照芯片液滴生成方式与上述方法相同。
4.PCR扩增
将已生成的含阳性质粒模板及阴性对照的液滴芯片，置于领航基因科技(杭州)有限公司的液滴PCR扩增仪中，扩增体系如下：:95℃，10分钟；95℃，15秒、60℃，1分钟，40个循环；25℃，5分钟。
5.荧光信号读取及结果分析：
将扩增后液滴芯片利用异丙醇擦拭清洁后，放置领航基因科技(杭州)有限公司的数字PCR阅读仪读取，读取荧光信号。
如下列分析图
图1：为FAM-VIC散点分析图，左上方信号团表示FAM修饰探针扩出突变基因阳性信号，信号强度由纵坐标荧光值衡量；右下方荧光信号团代表VIC修饰探针阳性信号，信号强度由横坐标荧光值衡量，提示该探针标记的内参基因阳性；右上方荧光团表示该芯片单反应单元内即扩出突变基因又扩出内参基因；左下荧光团为芯片本底荧光，无目的基因判定意义；荧光团大小与基因拷贝数正相关。
图2：为Cy5-VIC散点分析图，左上方信号团表示Cy5修饰探针扩出突变基因阳性信号，信号强度由纵坐标荧光值衡量；右下方荧光信号团代表VIC修饰探针阳性信号，信号强度由横坐标荧光值衡量，提示该探针标记的内参基因阳性；右上方荧光团表示该芯片单反应单元内即扩出突变基因又扩出内参基因，荧光团大小与基因拷贝数正相关；左下荧光团为芯片本底荧光，无目的基因判定意义。
图3：为Cy5-FAM散点分析图，左上方信号团表示Cy5修饰探针扩出突变基因阳性信号，信号强度由纵坐标荧光值衡量；右下方荧光信号团代表FAM修饰突变探针阳性信号，信号强度由横坐标荧光值衡量；右上方荧光团表示该芯片单反应单元内即扩出突变基因1又扩出突变基因2，荧光团大小与基因拷贝数正相关；左下荧光团为芯片本底荧光，无目的基因判定意义。
图4：为ROX-VIC散点分析图，左上方信号团表示ROX修饰探针扩出突变基因阳性信号，信号强度由纵坐标荧光值衡量；右下方荧光信号团代表VIC修饰探针阳性信号，信号强度由横坐标荧光值衡量，提示该探针标记的内参基因阳性；右上方荧光团表示该芯片单反应单元内即扩出突变基因又扩出内参基因，荧光团大小与基因拷贝数正相关；左下荧光团为芯片本底荧光，无目的基因判定意义。
实施例2.灵敏度检测
对EGFR突变检测EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR T790M、EGFR S768I、EGFR G719X(G719S、G719A、G719C)、EGFR 20ins(3种)、EGFR 19Del(19种)及内参对照质粒稀释，稀释后浓度梯度依次为：105、104、103、102、101、100拷贝，每个梯度设置3个平行重复，进行灵敏度实验。
体系配置、液滴生成方法、突变位点组合、扩增程序及荧光读取方法同实施例1，结果，各突变位点可最低检测不高于10拷贝模板。
实施例3.最低突变率检测
将各位点阳性质粒分别与阴性血浆DNA样本混合，制备成2ng/μL DNA浓度下0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％突变率核酸样本，以检测最低突变率。体系配置、液滴生成方法、突变位点组合、扩增程序及荧光读取方法同实施例1。
结果，各位点最低检测限均小于等于0.2％(输入总DNA为15ng时，阳性点大概为10个点)。重复实验10次，在EGFR各位点0.2％突变比例下，均检测到突变基因。即本试剂盒可检测出0.2％的EGFR基因突变。
至此，本领域技术人员应理解，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
序列表
<110> 领航基因科技(杭州)有限公司
<120> 一种检测EGFR突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcaaagtg ctg 13
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gttcggcacg gtgta 15
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cggaggccag cac 13
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ccggagcaca gcac 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccggagctca gcac 14
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
aaagttaaaa ttcccgtcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tttccttgtt ggctttcgga 20
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
caaggagcca acatct 16
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
caaggaacca acatctcc 18
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
cgctatcaag tctcc 15
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
cgctatcaag gaataagcc 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
agcaatctcc gaaagcc 17
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
caaggaatcg aaagc 15
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ctatcaaggc tc 12
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ctatcaaggc atctcc 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ctatcaagac atctcc 16
<210> 17
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
aggatccgaa agc 13
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
cgctatcaaa acatctc 17
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
caaggaagca acatctcc 18
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
caaggaacag aaagcc 16
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ctatcaagga acatctcc 18
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
caaggaatct ccga 14
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
caaggaaccg aaagcc 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
cgctatcaag gttccga 17
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
caaggaacca tctcc 15
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
cgctatcaaa atatctcc 18
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gcctgctggg catctg 16
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
tctttgtgtt cccggacata gtc 23
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
atgagctgca tgatgag 17
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
ttctggccac catgcgaagc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
gatgagctgc acggtggagg t 21
<210> 32
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
tccacgatgg cca 13
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
aagcgtgtca attcttagcg 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
gtaaaacgac ggccagtgt 19
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
cgtggccagc gtggac 16
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
caacccccac cacgtgtg 18
<210> 37
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
cgtggacggt aacc 14
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
gcagcatgtc aagatcacag att 23
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
cctccttctg catggtattc tttct 25
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
tttggcccgc ccaaaatctg t 21
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
cacccagctg tttggcc 17
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
gcggagggaa gctcatcagt g 21
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
ccctagtctc agaccttccc aa 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
acatgggagt ggagtgacag g 21

Claims (10)

1.一种用于检测EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子上特定突变的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含下列中的一种或多种：
18外显子：
G719X
G719X-F：5’-GATCAAAGTGCTG-3’(SEQ ID NO:1)
G719X-R：5’-GTTCGGCACGGTGTA-3’(SEQ ID NO:2)
G719X-P1：5’-ROX-CGGAGGCCAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:3)
G719X-P2：5’-ROX-CCGGAGCACAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:4)
G719X-P3：5’-ROX-CCGGAGCTCAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO:5)
19外显子：
19del-F：5’-AAAGTTAAAATTCCCGTCGC-3’(SEQ ID NO:6)
19del-R：5’-TTTCCTTGTTGGCTTTCGGA-3’(SEQ ID NO:7)
19del-P1：5’-FAM-CAAGGAGCCAACATCT-BHQ-3’(SEQ ID NO:8)
19del-P2：5’-FAM-CAAGGAACCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:9)
19del-P3：5’-CY5-CGCTATCAAGTCTCC-MGB-3’(SEQ ID NO:10)
19del-P4：5’-CY5-CGCTATCAAGGAATAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:11)
19del-P5：5’-ROX-AGCAATCTCCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:12)
19del-P6：5’-FAM-CAAGGAATCGAAAGC-MGB-3’(SEQ ID NO:13)
19del-P7：5’-ROX-CTATCAAGGCTC-MGB-3’(SEQ ID NO:14)
19del-P8：5’-ROX-CTATCAAGGCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:15)
19del-P9：5’-ROX-CTATCAAGACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:16)
19del-P10：5’-ROX-AGGATCCGAAAGC-BHQ-3’(SEQ ID NO:17)
19del-P11：5’-CY5-CGCTATCAAAACATCTC-BHQ-3’(SEQ ID NO:18)
19del-P12：5’-FAM-CAAGGAAGCAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:19)
19del-P13：5’-ROX-CAAGGAACAGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:20)
19del-P14：5’-ROX-CTATCAAGGAACATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:21)
19del-P15：5’-FAM-CAAGGAATCTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:22)
19del-P16：5’-FAM-CAAGGAACCGAAAGCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:23)
19del-P17：5’-CY5-CGCTATCAAGGTTCCGA-BHQ-3’(SEQ ID NO:24)
19del-P18：5’-FAM-CAAGGAACCATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:25)
19del-P19：5’-CY5-CGCTATCAAAATATCTCC-BHQ-3’(SEQ ID NO:26)
20外显子：
T790M
T790M-F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’(SEQ ID NO:27)
T790M-R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3’(SEQ ID NO:28)
T790M-P：5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:29)
S768I
S768I-F：5’-TTCTGGCCACCATGCGAAGC-3’(SEQ ID NO:30)
S768I-R：5’-GATGAGCTGCACGGTGGAGGT-3’(SEQ ID NO:31)
S768I-P：5’-ROX-TCCACGATGGCCA-MGB-3'(SEQ ID NO:32)
20ins：
20ins-F：5’-AAGCGTGTCAATTCTTAGCG-3’(SEQ ID NO:33)
20ins-R：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGT-3’(SEQ ID NO:34)
20ins-P1：5’-CY5-CGTGGCCAGCGTGGAC-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:35)
20ins-P2：5’-CY5-CAACCCCCACCACGTGTG-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:36)
20ins-P3：5’-CY5-CGTGGACGGTAACC-MGB-NFQ-3'(SEQ ID NO:37)
21外显子：
L858R及L861Q
L858R-F：5’-GCAGCATGTCAAGATCACAGATT-3’,(SEQ ID NO:38)
L858R-R：5’-CC TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’(SEQ ID NO:39)
L858R-P：5'-FAM-TTTGGCCCGCCCAAAATCTGT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:40)
L861Q-P：5'-Cy5-CACCCAGCTGTTTGGCC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:41)。
2.一种用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组合。
3.根据权利要求2所述的用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述检测为多重液滴数字PCR检测。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括人基因组14号染色体RnaseP基因作为内参，
所述内参引物探针序列如下：
RNaseP-F：5'-GCGGAGGGAAGCTCATCAGTG-3’(SEQ ID NO:42)
RNaseP-R：5'-CCCTAGTCTCAGACCTTCCCAA-3’(SEQ ID NO:43)
RNaseP-P：5'-FAM-ACATGGGAGTGGAGTGACAGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:44)。
5.根据权利要求2或3所述的用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品及阳性质控品，其中，
所述阳性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种突变型质粒；
所述阴性质控品为104拷贝数/μL EGFR基因7种野生型质粒。
6.根据权利要求2或3所述的用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记基团FAM、ROX、Cy5、VIC。
7.根据权利要求2或3所述的用于检测EGFR突变位点的试剂盒，其特征在于，所述探针引物组合以混合液形式存在，所述引物探针混合液分为三种，其中
L858R、L861Q、S768I及内参探针引物组混合在混合液1中；
T790M，G719X：G719S、G719A、G719C，3个插入突变20ins及内参探针引物组混合在混合液2中；
19种缺失突变19Del及内参探针引物组混合在混合液3中；
所述的混合液1、混合液2、混合液3中突变及内参的引物探针分别为20×引物探针混合浓度，引物浓度：:20UM，探针浓度：5UM。
8.权利要求1所述的引物探针组合或权利要求2-7中任一项所述的试剂盒在检测EGFR基因突变中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述EGFR基因突变包含下列中的一个或多个：
10.一种利用权利要求1所述的引物探针组合或权利要求2-7中任一项所述的试剂盒来多重液滴数字PCR检测EGFR突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取样；
(2)配置液滴数字PCR反应体系；
(3)生成液滴；
(4)PCR扩增；
(5)读取荧光信号及分析结果。
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