CN106520994A - 一种用于检测egfr基因突变的多重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：E‑18引物组、E‑19引物组、E‑20引物组、E‑21引物组、E‑2引物组、E‑18检测探针、E‑19检测探针、E‑20检测探针、E‑21检测探针、E‑2检测探针和内标检测探针；E‑18检测探针、E‑19检测探针、E‑20检测探针、E‑21检测探针和E‑2检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E‑2检测探针的序列相同，其5’端修饰有第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团。本发明以人类EGFR基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测EGFR基因突变，而且检测突变的能力高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上EGFR靶向治疗主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体两个部分，如阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)，罗氏公司的恶罗替尼(特罗凯)。
近年来大量研究发现一些肺癌病人EGFR基因的编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与吉非替尼和恶罗替尼等药物的临床疗效有关，即与药物反应性有关，原因可能是因为这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。目前，虽然已经发现不下30种突变，不过主要是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变；外显子19上747-750位氨基酸的大约有20多种不同缺失约占突变的45％，其中以2235_2249del15和2236_2250del15最为常见；外显子21上858位氨基酸的替代约占突变的40-45％；外显子18点突变(G719S或G719C)约占突变的5％；外显子20上的插入突变约占突变的1％左右。外显子18的G719X突变约占突变的5％左右。但是，在肺癌患者中EGFR的突变率并不高，美国肺癌病人中EGFR基因的突变率仅有2％，日本为40％。中国女性非小细胞肺癌的病人中EGFR基因的突变率为30％，如果这部分患者均能应用吉非替尼或恶罗替尼治疗将会明显改善预后。
这些靶向药物虽然对某些人群疗效非常，但是价格昂贵，如果病人不携带有EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变成为人们亟待解决的问题。
目前检测EGFR基因稀有突变的方法有多种，检测能力在1％～20％。主要有两大类，一类是非实时PCR，主要有测序和DHPLC，检测能力仅为20％和5％，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染；另一类是实时PCR，虽然都是基于实时PCR的技术平台，但是为了提高检测方法的选择能力，不同学者所用策略不尽相同。主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5％～20％之间，DxS蝎子引物法检测能力可达1％。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组、E-21引物组、E-2引物组、E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针、E-2检测探针和内标检测探针；E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-2检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，
E-18引物组由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R组成，依次包括如SEQ ID NO 01至04所示的序列；
E-19引物组由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R组成，依次包括如SEQ ID NO 05至24所示的序列；
E-20引物组由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R组成，依次包括如SEQ ID NO 25至30所示的序列；
E-21引物组由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R组成，依次包括如SEQ ID NO 31至33所示的序列；
E-2引物组由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R组成，依次包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列；
上述E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F、E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F、E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F、E-21-M1-F和E-21-M2-F依次对应肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因29种常见突变，具体见下表1：
表1：肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因的29种突变
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组和E-21引物组之一中的一正向引物和一反向引物
对应的E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针之一
E-2引物组
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
DNA模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。
在本发明的一个优选实施方案中，所述E-18检测探针为E-18-P，包括如SEQ ID NO36所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述E-18检测探针为E-19-P，包括如SEQ ID NO37所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述E-18检测探针为E-20-P，包括如SEQ ID NO38所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述E-18检测探针为E-21-P，包括如SEQ ID NO39所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述E-2检测探针为E-2-P，所述内标检测探针为E-2-I，均包括如SEQ ID NO 40所示的序列。
上述各因物及探针具体序列如下表所示：
进一步优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。
本发明的有益效果：本发明以人类EGFR基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测EGFR基因突变，而且检测突变的能力高。
附图说明
图1为本发明实施例2的多重荧光PCR反应程序图。
图2为本发明实施例2中多重荧光PCR检测EGFR基因L858R突变阴性对照样品检测曲线图。
图3为本发明实施例2中多重荧光PCR检测EGFR基因L858R突变的样品检测曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组、E-21引物组、E-2引物组、E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针、E-2检测探针和内标检测探针；E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-2检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ；其中，
E-18引物组由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R组成，依次包括如SEQ ID NO 01至04所示的序列；
E-19引物组由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R组成，依次包括如SEQ ID NO 05至24所示的序列；
E-20引物组由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R组成，依次包括如SEQ ID NO 25至30所示的序列；
E-21引物组由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R组成，依次包括如SEQ ID NO 31至33所示的序列；
E-2引物组由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R组成，依次包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组和E-21引物组之一中的一正向引物和一反向引物
对应的E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针之一
E-2引物组
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
DNA模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。
所述E-18检测探针为E-18-P，包括如SEQ ID NO 36所示的序列。
所述E-18检测探针为E-19-P，包括如SEQ ID NO 37所示的序列。
所述E-18检测探针为E-20-P，包括如SEQ ID NO 38所示的序列。
所述E-18检测探针为E-21-P，包括如SEQ ID NO 39所示的序列。
所述E-2检测探针为E-2-P，所述内标检测探针为E-2-I，均包括如SEQ ID NO 40所示的序列。
上述各因物及探针具体序列如下表所示：
实施例1
本实施例以人类EGFR基因21外显子的L858R突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测L858R突变，而且检测突变的能力高达1％。
野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以L858R突变质粒为阳性对照模板，以本试剂盒进行多重PCR检测，最终以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)。
上述多重荧光PCR检测的扩增反应体系为：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 8 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | E-21-M1-F | 50mM | 2 |
| 5 | E-21-M1-R | 50mM | 0.1 |
| 6 | E-21-P | 50mM | 0.1 |
| 7 | E-2-F | 50mM | 0.1 |
| 8 | E-2-R | 50mM | 0.1 |
| 9 | 内标检测探针 | 50mM | 0.1 |
| 10 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 11 | H2O | 纯化水 | 18.9 |
| 12 | DNA模板 | 2ng/ul | 5 |
| 13 | 总体积 | 50 |
以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
上述多重荧光PCR检测的反应条件是95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号。
上述检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号的Ct值，是采用Mx3000P荧光PCR扩增仪或Mx3005P荧光PCR扩增仪或ABI 7500荧光PCR扩增仪。，一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团的信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性。
实施例2
本实施例中以EGFR基因热点突变外显子21上的L858R突变为例来分析本发明的多重荧光PCR检测EGFR基因21外显子L858R突变的方法。实验用细胞系3株和1个质粒，分别为H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)和L858R突变质粒；45份健康的无偿献血者全血样品、45份临床肺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。
利用上述荧光PCR检测EGFR基因外显子21上的L858R突变的方法包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取质控：
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。
(2)用本发明的多重荧光PCR试剂盒(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)对步骤(1)所得的模板进行荧光PCR扩增检测，配制反应体系：
| 序号 | 物料 | 物料浓度 | 用量(μL) |
| 1 | 1×PCR缓冲液 | 1× | 10 |
| 2 | MgCl2 | 25mM | 8 |
| 3 | dNTPs | 10mM | 5 |
| 4 | E-21-M1-F | 50mM | 2 |
| 5 | E-21-M1-R | 50mM | 0.1 |
| 6 | E-21-P | 50mM | 0.1 |
| 7 | E-2-F | 50mM | 0.1 |
| 8 | E-2-R | 50mM | 0.1 |
| 9 | 内标检测探针 | 50mM | 0.1 |
| 10 | Taq酶 | 5U | 0.5 |
| 11 | H2O | 纯化水 | 18.9 |
| 12 | DNA模板 | 2ng/ul | 5 |
| 13 | 总体积 | 50 |
所述荧光PCR的反应条件如图1所示：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环。
(3)检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪(StrataGene公司)后30个循环退火阶段检测第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光信号，一次可以检测92份样品(包括阴阳性对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的第一荧光报告基团和第二荧光报告基团荧光强度，以第二荧光报告基团信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，第一荧光报告基团信号结果可信；以第一荧光报告基团的信号达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或30：阴性；Ct小于30：阳性，检测结果具体如图2和图3所示。
前述45份健康献血者全血样品以及细胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)，L858R突变质粒经本发明的体系检测，只有L858R突变质粒有荧光信号，其他样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。
灵敏度分析：将突变型L858R突变质粒从10的4次方连续10倍梯度稀释，分别为10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将L858R突变质粒DNA和野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。
A：50％即为10的3次方L858R突变细胞DNA。
B：30％取A液60μL后混入40μL 10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
C：20％取A液40μL后混入60μL 10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
E：10％取C液50μL后混入50μL 10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
G：1％取F液20μL后混入80μL 10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
I：0.1％取H液20μL后混入80μL 10的3次方L858R突变细胞DNA，震荡混均。
结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变L858R质粒DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共45例，其中30组织样品，5例血浆，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。
对于外显子21的L858R突变，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：45例样品中有12例发生外显子21的L858R突变，33例均为野生型。
本发明可以同时检测EGFR外显子21的L858R突变，检测时间仅需90min，因此本发明准、简单、快捷可满足突变的快速诊断。而且，多重荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。
本领域普通技术人员可知，用本发明的试剂盒中的E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组、E-21引物组的其他正向引物及E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针或E-2检测探针检测其他相应基因突变，仍然能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍然属于本发明的保护范围。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
<110> 厦门飞朔生物技术有限公司
<120> 一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒
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<213> 人工序列
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ttcaaaaaga tcaaagtgct gt 22
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ttaaaattcc cgtcgctatc aagg 24
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aattcccgtc gctatcaagg aacc 24
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aattcccgtc gctatcaagg aacc 24
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cctgaggttc agagccatgg acc 23
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cctccaccgt gcaactcatc ct 22
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ccagttgagc aggtactggg ag 22
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gcagcatgtc aagatcacag attttgggag 30
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cagattttgg gctggccaaa ga 22
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gatcataatt cctctgcaca taggtaa 27
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cccttcggct gcctcctgg 19
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tgcagaagga ggcaaagtaa gg 22
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<400> 40
cagcctccag aggatgttca a 21
Claims (7)
1.一种用于检测EGFR基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组、E-21引物组、E-2引物组、E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针、E-2检测探针和内标检测探针；E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-2检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，
E-18引物组由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R组成，依次包括如SEQ ID NO 01至04所示的序列；
E-19引物组由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R组成，依次包括如SEQ ID NO 05至24所示的序列；
E-20引物组由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R组成，依次包括如SEQ ID NO 25至30所示的序列；
E-21引物组由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R组成，依次包括如SEQID NO 31至33所示的序列；
E-2引物组由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R组成，依次包括如SEQ ID NO 34和35所示的序列；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：
E-18引物组、E-19引物组、E-20引物组和E-21引物组之一中的一正向引物和一反向引物
对应的E-18检测探针、E-19检测探针、E-20检测探针、E-21检测探针和E-2检测探针之一
E-2引物组
内标检测探针
1×PCR缓冲液
MgCl2
dNTPs
Taq酶
H2O
DNA模板；
该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。
2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述E-18检测探针为E-18-P，包括如SEQ ID NO 36所示的序列。
3.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述E-18检测探针为E-19-P，包括如SEQ ID NO 37所示的序列。
4.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述E-18检测探针为E-20-P，包括如SEQ ID NO 38所示的序列。
5.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述E-18检测探针为E-21-P，包括如SEQ ID NO 39所示的序列。
6.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述E-2检测探针为E-2-P，所述内标检测探针为E-2-I，均包括如SEQ ID NO 40所示的序列。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988369A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-04 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒 |
| CN108642154A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-10-12 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 |
| CN117568509A (zh) * | 2023-11-17 | 2024-02-20 | 厦门飞朔生物技术有限公司 | 一种基于微滴数字pcr技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102747157A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-24 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN103740843A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-04-23 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种检测egfr基因外显子21l858r点突变的试剂盒和方法 |
| CN104087674A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-08 | 江苏同科医药科技有限公司 | 一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102747157A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-24 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN103740843A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-04-23 | 上海涌泰生物医药科技有限公司 | 一种检测egfr基因外显子21l858r点突变的试剂盒和方法 |
| CN104087674A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-08 | 江苏同科医药科技有限公司 | 一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988369A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-04 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒 |
| CN107988369B (zh) * | 2017-12-28 | 2020-11-17 | 北京雅康博生物科技有限公司 | 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒 |
| CN108642154A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-10-12 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用 |
| CN117568509A (zh) * | 2023-11-17 | 2024-02-20 | 厦门飞朔生物技术有限公司 | 一种基于微滴数字pcr技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用 |
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