CN104087674A - 一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液A、PCR反应液B、Taq/UNG酶混合液、阳性对照和阴性对照；其中，所述PCR反应液A包括10×PCR buffer、外显子19缺失突变的引物和探针、T790M突变的引物和探针、L861Q突变的引物和探针、外显子2的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水；所述PCR反应液B包括10×PCR buffer、外显子20插入突变的引物和探针、S768的引物和探针I、L858R的引物和探针、G719X的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水。本发明可用于检测人表皮生长因子受体突变基因。
Description
技术领域
本发明属体外诊断试剂领域，具体地，涉及一种试剂盒，更具体地，涉及一种人表皮生长因子受体突变基因(29种)检测的试剂盒。
背景技术
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，尽管手术和化疗技术不断提高，但患者的预后仍较差，5年存活率小于20％。目前，以人表皮生长因子受体(epithelium growth factorrecptor，EGFR)为靶点的分子靶向治疗已成为治疗NSCLC最重要的方式。
EGFR是原癌基因C-erbB-1的表达产物，基因定位于第7号染色体上，属于跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR与其配体结合后，能激活下游信号通路，调节肿瘤细胞的增殖、分化、血管生成及凋亡抑制，从而调控一系列肿瘤生物学行为。
目前临床上使用的针对EGFR的靶向药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，EGFR-TKI通过抑制EGFR自身磷酸化而阻断EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖分化，实现靶向治疗。EGFR-TKI的疗效与EGFR基因突变状况密切相关，EGFR基因突变主要集中在外显子18～21上，包括敏感突变和耐药突变。因此，EGFR基因外显子18～21突变检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，对指导临床开展NSCLC的个体化靶向治疗具有重要意义。
目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、探针杂交法、高分辨率熔解曲线法和ARMS荧光定量PCR等方法。
直接测序法步骤繁琐、周期长且灵敏度低，不适合应用于临床检测。探针杂交法对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件。分辨率熔解曲线法在检测缺失突变时效果较差。荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，市场上已有该类产品。但是，对同一样本需要同时进行8管PCR反应才能对29个突变型进行检测，检测成本高，时效性不强。
当前，迫切需要开发一种异性强、灵敏度高、操作简单、经济方便、检测通量高和时效性强的EGFR基因突变检测试剂盒。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、经济方便、检测通量高和时效性强的试剂盒。
本发明提供的一种试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液A、PCR反应液B、Taq/UNG酶混合液、阳性对照和阴性对照；
其中，PCR反应液A包括10×PCR buffer、外显子19缺失突变的引物和探针、T790M突变的引物和探针、L861Q突变的引物和探针、外显子2的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水；
上述外显子19缺失突变的引物和探针的序列为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列，
具体地，外显子19缺失突变型上游引物19F1：
5′-TAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACGA-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F2：
5′-ATTCCCGTCGCTATCAAAATATCGA-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F3：
5′-ATTCCCGTCGCTATCAAGGATCGA-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F4：
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGAGCTC-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F5：
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGAGCAAT-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F6：
5′-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACAT-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F7：
5′-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACAGA-3′；
外显子19缺失突变型上游引物19F8：
5′-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACCA-3′；
外显子19缺失突变型下游引物19R：
5′-AGGTGAGGCAGATGCCCAG-3′；
外显子19缺失突变型探针19P：
5′-CCAACAAGGAAATCCTC-3′；
其中，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述T790M突变的引物和探针的序列为如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示的序列，
具体地，T790M突变型上游引物20F4：
5′-TCCACCGTGCAGCTCATGCA-3′；
T790M突变型下游引物20R：
5′-GTCCTCCAAGTAGTTC-3′；
T790M插入突变型探针20P1：
5′-TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3′；
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述L861Q突变的引物和探针为如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的序列，
具体地，L861Q突变型上游引物21F1：
5′-CAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC-3′；
L861Q突变型下游引物21R：
5′-GACATCACTCTGGTGGGT-3′；
L861Q突变型探针21P1：
5′-GGAGGCAAAGTGCCTATC-3′；
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述外显子2的引物和探针为如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示的序列，
具体地，外显子2上游引物EF：
5′-TGCCAAGGCACGAGTAACAAG-3′；
外显子2下游引物ER：
5′-TCCAAATTCCCAAGGACCAC-3′；
外显子2探针EP：
5′-CTCAGCCTCCAGAGGATG-3′；
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团。
此外，本发明涉及的PCR反应液B包括10×PCR buffer、外显子20插入突变的引物和探针、S768的引物和探针I、L858R的引物和探针、G719X的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水。
上述外显子20插入突变的引物和探针为如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的序列，
具体地，外显子20插入突变型上游引物20F1：
5′-AGCGTGGACAACCCCCACACGT-3′；
外显子20插入突变型上游引物20F2：
5′-GTGGACAACCCCCACGGGTTGTGC-3′；
外显子20插入突变型上游引物20F3：
5′-ATGGCCAGCGTGCCAGCGTGGGAC-3′；
外显子20插入突变型下游引物20R：
5′-TGAGCAGGTACTGGGTGCC-3′；
外显子20探针20P：
5′-TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3′；
其中，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述S768的引物和探针I为如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示的序列，
具体地，S768I突变型上游引物20F5：
5′-TAGCCTACGTGATGGCCATC-3′；
S768I突变型下游引物20R：
5′-TGAGCAGGTACTGGGTGCC-3′；
外显子20探针20P：
5′-TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3′；
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述L858R的引物和探针为如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的序列，
具体地，L858R突变型上游引物21F2：
5′-GATTTTGGGCGGGCCAAAC-3′；
L858R突变型下游引物21R：
5′-GACATCACTCTGGTGGGT-3′；
L858R突变型探针21P：
5′-GGAGGCAAAGTGCCTATC-3′；
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
上述G719X的引物和探针为如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35所示的序列，
具体地，G719X突变型(G719A)上游引物18F1：
5′-ATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGCCT-3′；
G719X突变型(G719S)上游引物18F2：
5′-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGAG-3′；
G719X突变型(G719C)上游引物18F3：
5′-ATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGTG-3′；
G719X突变型下游引物18R：
5′-CTTTCTACCTTCTGGGATC-3′；
G719X突变型探针18P：
5′-GTGCGTTCGGCACGGTG-3′；
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团。
在本发明中，外显子19缺失突变、T790M突变、L861Q突变、外显子2的引物和探针的浓度为10-100μM。
在本发明中，外显子20插入突变、S768I、L858R和G719X的引物和探针的浓度为10-100μM。
在本发明中，MgCl2的浓度为25-100mM。
在本发明中，dNTPs为选自25-100mM dATP、25-100mM dGTP、25-100mM dCTP、12.5-50mM dUTP、12.5-50mM dTTP中的一种或几种的混合物。
在本发明中，Taq/UNG酶混合液包括5-20U/μL耐热DNA聚合酶和1-10U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。
在本发明中，阴性对照为生理盐水；
在本发明中，阳性对照为含有G719X、外显子19缺失突变型、外显子20插入突变型、T790M、L861Q、S768I、L858R和exon2的线性化重组质粒的生理盐水。
此外，根据上述方法提供的试剂盒能应用于检测人表皮生长因子受体突变基因。
本发明的作用和效果
本发明采用多色荧光PCR的技术，将同一样本进行2管PCR扩增，以EGFR基因常见的29种突变类型(如表1所示)作为检测目标。
能实现对高突变率的Exon19缺失突变和Exon21的L858R突变检测，也能对低突变率的L861Q、T790M、S768I、G719X及Exon20插入突变检测，同时还可通过exon2基因对检测过程进行质量控制，可有效实现对EGFR突变的监控，满足用药前的筛查要求。
表1 29种EGFR基因突变
| 突变名称 | 基因突变 | 外显子 | 碱基变化 |
| Ex18-m1 | G719A | 18 | 2156G>C |
| Ex18-m2 | G719S | 18 | 2155G>A |
| Ex18-m3 | G719C | 18 | 2155G>T |
| Ex19-m1 | E746_A750del(1) | 19 | 2235_2249del15 |
| Ex19-m2 | E746_A750del(2) | 19 | 2236_2250del15 |
| Ex19-m3 | L747_P753>S | 19 | 2240_2257del18 |
| Ex19-m4 | E746_T751>I | 19 | 2235_2252>AAT(complex) |
| Ex19-m5 | E746_T751del | 19 | 2236_2253del18 |
| Ex19-m6 | E746_T751>A | 19 | 2237_2251del15 |
| Ex19-m7 | E746_S752>A | 19 | 2237_2254del18 |
| Ex19-m8 | E746_S752>V | 19 | 2237_2255>T(complex) |
| Ex19-m9 | E746_S752>D | 19 | 2238_2255del18 |
| Ex19-m10 | L747_A750>P(1) | 19 | 2238_2248>GC(complex) |
| Ex19-m11 | L747_T750>Q | 19 | 2238_2252>GCA(complex) |
| Ex19-m12 | L747_E749del | 19 | 2239_2247del19 |
| Ex19-m13 | L747_T751del | 19 | 2239_2253del15 |
| Ex19-m14 | L747_S752del | 19 | 2239_2256del18 |
| Ex19-m15 | L747_A750>P(2) | 19 | 2239_2248>C(complex) |
| Ex19-m16 | L747_P753>Q | 19 | 2239_2258>CA(complex) |
| Ex19-m17 | L747_T751>S | 19 | 2240_2251del12 |
| Ex19-m18 | L747_T751del | 19 | 2240_2254del15 |
| Ex19-m19 | L747_T751>P | 19 | 2239_2251>C(complex) |
| Ex20-m1 | T790M | 20 | 2369C>T |
| Ex20-m2 | S768I | 20 | 2303G>T |
| Ex20-m3 | H773_V774insH | 20 | 2319_2320insCAC |
| Ex20-m4 | D770_N771insG | 20 | 2310_2311insGGT |
| Ex20-m5 | V769_D770insASV | 20 | 2307_2308insGCCAGCGTG |
| Ex21-m1 | L858R | 21 | 2573T>G |
| Ex21-m2 | L861Q | 21 | 2582T>A |
本发明与现有EGFR突变基因检测试剂盒相比，具有以下优势：
(1)具有更高的特异性和灵敏度。
(2)封闭检测，无需PCR后反应，避免交叉污染和环境污染。
(3)分2管进行PCR反应能检测29种EGFR突变基因，操作简单、经济高效、可进行高通量的样本检测。
附图说明
附图1为试剂盒质控品的扩增曲线；
图1A显示阳性对照在PCR反应液A和B中的扩增曲线，
图1B显示阴性对照在PCR反应液A和B中的扩增曲线，
其中,横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
附图2为EGFR野生型样本在PCR反应液A和B中的扩增曲线；
其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
附图3为EGFR突变型在PCR反应液A和B中的扩增曲线；
其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
实施例1：试剂盒的组成
人表皮生长因子受体突变基因(29种)检测试剂盒的组成如表2所示：
表2 人表皮生长因子受体突变基因(29种)检测试剂盒的组成
其中，PCR反应液A中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mMdUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，PCR反应液A中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，PCR反应液B中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mMdUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，PCR反应液B中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，Taq/UNG酶混合液为48μL(1U/μL或2U/μL或5U/μL或10U/μL)的Taq酶和24μL(1U/μL或2U/μL或5U/μL或10U/μL)的UNG酶的混合液；
其中，阴性对照为200μL的生理盐水；
其中，阳性对照为200μL含有G719X(G719A、G719S、G719C)、外显子19缺失突变型、外显子20插入突变型、T790M、L861Q、S768I、L858R和人β-globin的线性化重组质粒的生理盐水。
实施例2：实施例1所列试剂盒作为人表皮生长因子受体突变基因(29种)检
测试剂盒的使用
(1)DNA提取
取30-50mg石蜡包埋组织样本，建议使用TIANGEN石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA，提取过程按照试剂盒说明书进行，最后收集到100μL DNA溶液。
(2)PCR检测
按比例取相应量的PCR反应液、Taq/UNG酶混合液(PCR反应液A和PCR反应液B 43.5μL/人份+Taq/UNG酶混合液1.5μL/人份)，充分混匀后按45μL/管分装到PCR反应管中，备用。分别向准备好PCR反应液A和B的PCR反应管中加入已提取的同一个样本的DNA提取液5μL，盖紧管盖如有气泡，可用手指弹击，去除气泡。5000转/分钟离心30秒至管壁无明显液珠。
(3)PCR扩增
将PCR管放入ABI7500扩增仪样品槽，按对应顺序设置待检样本、阳性对照、阴性对照。
每个样品选择FAM、JOE、ROX和CY54个通道。参比荧光(Passive Reference)设置为none。
其PCR反应程序如下表3所示：
表3 PCR扩增程序
反应体积设定50μL，保存文件，运行程序。
(4)结果分析
将Baseline设为3-15(根据实际情况，Baseline Cycler可在一定范围内变化)，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为Undet。对FAM、JOE、ROX和CY5 4个通道分别进行观察曲线的形状和记录Ct值。
质控对照：阴性对照在PCR反应液A和B中的4个通道Ct值均显示Undet；阳性对照在PCR反应液A和B中的各通道均Ct≤32；样本内对照β-globin在PCR反应液A中的CY5荧光通道Ct≤40。同时符合以上两个条件，此反应视为有效。
判断：PCR扩增试剂A或B中Ct值≤37判定为检测到相应EGFR突变型；37<Ct≤40时，重复检测一次，仍为37<Ct≤40的判定为检测到相应EGFR突变型，否则为没有检测到相应EGFR突变型；Ct>40或显示为Undet，判定结果为没有检测到相应EGFR突变型。4种不同荧光探针标记在PCR扩增试剂A和B中检测的EGFR突变基因见表4所示：
表4 不同荧光探针标记在PCR扩增试剂A和B检测的EGFR突变基因
| FAM | JOE | ROX | CY5 | |
| PCR扩增试剂A | 19外显子缺失 | T790 | L861Q | exon 2 |
| PCR扩增试剂B | 20外显子插入 | S768I | L858R | G719X |
如图2所示根据该样本在PCR反应液A和B中不同颜色的扩增曲线(在PCR反应液A中CY5荧光通道Ct值≤37，其他均undet)，可以看出该样本没有检测到EGFR突变型。
如图3所示根据该样本在PCR反应液A和B中不同颜色的扩增曲线(在PCR反应液A中CY5荧光通道Ct值≤37，在PCR反应液B中FAM和JOE通道Ct值≤37，其他均undet)，可以看出该样本检测到20外显子插入突变型和S768I突变型。
Claims (10)
1.一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液A、PCR反应液B、Taq/UNG酶混合液、阳性对照和阴性对照；
其中，所述PCR反应液A包括10×PCR buffer、外显子19缺失突变的引物和探针、T790M突变的引物和探针、L861Q突变的引物和探针、外显子2的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水；
所述PCR反应液B包括10×PCR buffer、外显子20插入突变的引物和探针、S768的引物和探针I、L858R的引物和探针、G719X的引物和探针、MgCl2、dNTPs和无菌蒸馏水。
2.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：
所述外显子19缺失突变的引物和探针的序列为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列；
所述T790M突变的引物和探针的序列为如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示的序列；
所述L861Q突变的引物和探针为如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的序列；
所述外显子2的引物和探针为如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示的序列。
3.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：
所述外显子20插入突变的引物和探针为如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的序列；
所述S768的引物和探针I为如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示的序列；
所述L858R的引物和探针为如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的序列；
所述G719X的引物和探针为如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35所示的序列。
4.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述外显子19缺失突变、T790M突变、L861Q突变、外显子2的引物和探针的浓度为10-100μM。
5.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述外显子20插入突变、S768I、L858R和G719X的引物和探针的浓度为10-100μM。
6.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述MgCl2的浓度为25-100mM。
7.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述dNTPs为选自25-100mM dATP、25-100mM dGTP、25-100mM dCTP、12.5-50mM dUTP、12.5-50mM dTTP中的一种或几种的混合物。
8.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述Taq/UNG酶混合液包括5-20U/μL耐热DNA聚合酶和1-10U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶。
9.如权利要求1所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：
所述阴性对照为生理盐水；
所述阳性对照为含有G719X、外显子19缺失突变型、外显子20插入突变型、T790M、L861Q、S768I、L858R和人β-globin的线性化重组质粒的生理盐水。
10.如权利要求1-9任一所述的一种人表皮生长因子受体突变基因检测试剂盒，其特征在于：用于检测人表皮生长因子受体突变基因。
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