CN101070538A - 人表皮生长因子受体突变基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制备和基因诊断的应用，特别是在非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备和非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的应用。提供多种人表皮细胞生长因子受体(EGFR)突变基因，制备了用于中国人非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗药物的基因靶位、基因诊断用靶位，特别是用于非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的基因靶位，使得恶性肿瘤，特别是NSCLC的靶向药物和基因诊断试剂的开发具有明确的作用位点，从而使靶向治疗更加具有针对性，能够进行恶性肿瘤的个体化治疗。
Description
技术领域
本发明涉及多种人表皮生长因子受体(EGFR)突变基因及应用，涉及药物制备和基因诊断的应用，特别是在非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备和非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，其治疗也成为人们关注的焦点。传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。为此，抗肿瘤靶向药物的研究日益引起人们的重视。
众所周知，目前恶性肿瘤靶向治疗常用的治疗靶点主要有：细胞受体、信号传导和抗血管生成等。针对这些靶点，已有一些药物投入临床研究或者上市，这些药物主要有：Herceptin(Trastuzumab)、Rituximab、IMC-C225(cetuximab，Erbitux)和Bevacizumab(Avastin)等；小分子化合物常用的有：Glivec(STI51)、Iressa(ZD1839，Gefitinib)和OSI774等。这些药物均在临床实验中取得了较好的疗效，并显示了上市应用的良好前景。这些药物的作用机理有着一个共同的特点，即针对肿瘤细胞的信号传导途径——表皮生长因子受体(EGFR)的信号传导途径(参见文献：①Tanovic，A.，et al.，Gefitinib：current status in the treatment ofnon-small cell lung cancer，Drugs Today(Barc)，2004，809-27；②Ross，J.S.，et al.，)Targeted therapies for cancer 2004.Am J Clin Pathol，2004，122，598-609)。
最近的基础与临床研究表明，EGFR信号传导途径是恶性肿瘤发生发展的重要影响因素，在细胞衍生、凋亡、肿瘤血管新生及转移等过程中发挥着重要作用。目前在多种实体瘤如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、脑肿瘤中均发现有EGFR的过表达。通过抑制肿瘤细胞信号传导通路，可抑制肿瘤细胞的增殖，促使其凋亡。信号传导通路中的酪氨酸激酶(TK)与肿瘤的发生、发展有关。以EGFR作为药物作用靶点是众多恶性肿瘤靶向治疗新药研发的一个新思路。
在Iressa治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的III期临床研究中发现，尽管Iressa是现有疗效最为明显的一种EGFR信号传导途径抑制剂，但只有10％的NSCLC白人患者和27％的日本患者对Iressa有效且见效快，而且其EGFR的表达水平与对ZD1839反应之间无明显相关性(参见文献：Fukuoka M，et al.，Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinibfor previously treated patients with advanced non-small-cell lungcancer.，J Clin Oncol，2003，21，2237-46)。进一步研究发现，对Iressa有疗效的患者中存在有明显的EGFR突变现象，这种突变在韩、日及台湾地区东方患者群中出现的几率显著高于世界上的其他地区(参见文献：①Huang，S.F.，et al.，High frequency of epidermal growth factorreceptor mutations with complex patterns in non-small cell lungcancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan.Clin CancerRes，2004，10，8195-203；②Han，S.W.，et al.，2005，Predictive andPrognostic Impact of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation inNon-Small-Cell Lung Cancer Patients Treated With Gefitinib.，J ClinOncol；③Shigematsu，H.，et al.，Clinical and biological featuresassociated with epidermal growth factor receptor gene mutations inlung cancers.J Natl Cancer Inst，2005，97，339-46)。据此，人们认为，EGFR的这种突变与包括Iressa在内的抗肿瘤靶向药物疗效之间有着密切的关系，并且各人群种族之间的这种突变存在明显的特异性。
公认的研究成果认为，EGFR活性提高激活了EGFR信号传导途径，导致肿瘤细胞增殖。而EGFR活性提高的原因之一在于EGFR突变基因的表达。对于不同人种群甚至个体，这种EGFR突变基因存在着差异。现有的靶向治疗药物，虽然针对了EGFR信号传导途径这一有效的抗肿瘤靶点，但因没有利用这种EGFR突变的这种特异性，故没有在不同的人类种群甚至个体之间形成个体化治疗，影响了药物的疗效。
另外，目前针对NSCLC患者的靶向药物治疗，通常是直接服用靶向药物，通过临床观察确认其疗效，缺少有效的治疗方法预后评价模式，急需要建立一种准确、敏感、可靠、快速的检测EGFR突变体基因的诊断技术，用来指导临床医师开展靶向抗肿瘤药物的个体化用药治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供多种人表皮细胞生长因子受体(EGFR)突变基因及应用，涉及药物制备和基因诊断的应用，特别是在非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备和非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的应用。
本发明所提供的EGFR突变基因及应用，在于这种突变基因是发生在EGFR的酪氨酸激酶(TK)区的第19～21号外显子上，有四种不同的基因序列，其基因序列分别如附图2至附图5所示，附图6示出的是在第19～21号外显子上同时发生突变的基因序列的一种情况，附图7示出的是在第19～21号外显子上同时发生突变的基因序列的另一种情况，上述的突变都属于体细胞突变，正常人组织细胞中没有这种突变。EGFR的野生型基因序列如附图1所示。EGFR突变基因的突变方式包括有：缺失突变，点突变和缺失加插入突变。特别需要指出的是，在这些突变中，第19号外显子上的746～750位氨基酸非移码缺失突变，在中国NSCLC患者群中属于高频突变，突变率达到80％；第21号外显子上的L858R错义突变，在中国NSCLC患者群中属于低频突变，突变率仅为10％。由于肿瘤细胞的胞内生化代谢依赖于EGFRTK区的信号传导途径的调节，通过抑制前述突变基因的表达，可以降低EGFR的活性表达，调控恶性肿瘤细胞的生化代谢，从而遏制恶性肿瘤的发生与发展，达到靶向治疗恶性肿瘤的目的。还可以通过基因诊断来检测前述突变基因，对恶性肿瘤患者实施个体化的抗肿瘤用药治疗。
本发明通过随机抽取中国恶性肿瘤患者的基因组DNA获取病例样本，利用人癌细胞系进行基因突变的筛查，针对EGFR第19至21号外显子，设计了三对引物，用于扩增癌细胞系cDNA中EGFR-TK区，对基因组DNA中的EGFR进行筛查。引物的设计详见表1。并进行中国人NSCLC的EGFR TK突变频率与国外其他地区的对比研究。
EGFR酪氨酸激酶区突变基因的筛查方法是：采用Trizol试剂对各种癌细胞进行总RNA的提取，通过SuperScrip III进行逆转录，取适量合成的cDNA，经PCR扩增后进行DNA测序。测序包括正向引物测序和反向引物测序(见附图3)，确定突变位点(见附图4)，结果表明，EGFR第19号外显子上为(E746-A750缺失)突变和(L747-T751缺失)突变，第21号外显子上为(L858R错义)突变，第20号外显子上为(DN(770-771)缺失&AGG插入)突变。
EGFR TK区突变基因在大肠杆菌中的表达；设计引物(详见表3)，从EGFR的全长基因中扩增出TK区突变基因，通过限制性内切酶将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET15b上，转化大肠杆菌DH5a得到重组子。再将得到的重组子转入大肠杆菌表达菌株BL21中，得到表皮生长因子受体EGFR TK区突变基因的表达菌株rBL21-ETK。
表3 EGFR TK区突变基因扩增引物
| 引物 | 序列(5’＞3’) |
| FR | GGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGTTAGCCCTGCTGTGGGATGAGGTACTC |
接种菌株rBL21-ETK，将其培养到OD0.8时加入终浓度1mM的IPTG，诱导表达4个小时后，离心收菌，加入裂菌缓冲液重悬，然后在冰浴中进行超生波破菌。破菌后离心的沉淀用8M的尿素溶液溶解，挂镍柱进行蛋白纯化。纯化的蛋白在复性缓冲液中复性24个小时后离心，将上清液再次挂柱，洗脱后得到EGFR TK区突变基因的表达蛋白(附图15、附图16、附图17)。
EGFR TK区突变基因在昆虫细胞中的表达；设计引物(详见表4)，从EGFR的全长基因中扩增出TK区突变基因，通过限制性内切酶将其克隆到含昆虫多角体病毒启动子的载体pRESEVER-1a中，形成重组质粒。将重组质粒转座DH10Bac，蓝白斑筛选得到转座成功的白斑，碱裂解法抽提该菌斑中的含目的基因的Bacmid质粒，用PCR验证该质粒(附图18)。转染昆虫细胞sf9，得到所需的病毒粒子。
表4 EGFR TK区突变基因扩增引物
| 引物 | 序列(5’＞3’) |
| w023w024 | AGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAAGCTCGAGTTATTAGCCCTGCTGTGGGATGAGGTACTC |
将得到的病毒粒子循环感染两次，提高病毒粒子的滴度。将三次感染后的病毒粒子按1∶100大量感染昆虫细胞sf9，四天后收集细胞。超生波破碎细胞后，上清液用Western-Blot(WB)验证蛋白的表达(附图19)。
EGFR TK区突变对胞内EGFR活性表达的影响
EGFR TK区的突变可导致其活性的增强，在细胞水平可表现为磷酸化形式的EGFR表达量提高，进而影响其信号传导通路下游靶标的表达量变化，并最终影响细胞的增殖，分化等过程。
首先构建带有野生型EGFR基因的真核表达载体和EGFR TK区突变基因载体，将等量的上述载体分别转染人的非小细胞肺癌细胞株SPC-A-1中，于37℃、5％CO2条件下培养20～24小时后，血清饥饿18～24小时，在培养基中加入100ng/uL的EGF，于37℃进行刺激反应，同时设置不刺激的阴性对照。然后在不同时间点收集细胞，取等量细胞裂解液，用Western-Blot法检测，考察在EGFR总表达量一致的前提下，活性形式(磷酸化形式)EGFR的表达变化情况及其在野生型和突变体之间的变化差异，结果见附图20、21。
本发明指出了EGFR的突变基因，特别是中国人NSCLC的EGFR突变基因，为药物制备和基因诊断的应用，特别是在非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备和非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的应用。
抑制前述突变基因的表达，能降低EGFR的活性表达，达到抑制肿瘤细胞的信号传导通路，遏制肿瘤细胞的增殖，促使其凋亡的目的。为抑制前述突变基因的表达，可以采用制备抑制剂，也可以采用制备抗体，或是其他类型的能够抑制前述基因表达的药物，来遏制肿瘤细胞的生长。附图13给出了应用本发明进行恶性肿瘤治疗的实施流程。
通过检测前述突变基因，可以建立准确、敏感、可靠、快速的EGFR基因诊断技术，用来指导临床医师开展靶向抗肿瘤药物的个体化用药治疗。附图14给出了应用本发明进行恶性肿瘤基因诊断的实施流程。
本发明的特点在于，提供了制备恶性肿瘤靶向治疗药物所需要的基因靶位，特别是制备用于中国人NSCLC靶向治疗药物的基因靶位，同时提供了用于基因诊断用的靶位，特别是用于非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因检测的基因靶位，使得恶性肿瘤，特别是NSCLC的靶向药物和基因诊断试剂的开发具有明确的作用位点，从而使靶向治疗更加具有针对性，能够进行恶性肿瘤的个体化治疗。
附图说明
附图1是人表皮生长因子受体基因正常型的序列结构。
附图2是人表皮生长因子受体基因在第19号外显子发生缺失突变后的序列结构。
附图3是人表皮生长因子受体基因的酪氨酸激酶区的第19号外显子发生缺失突变后的另一种序列结构。
附图4是人表皮生长因子受体突变基因的酪氨酸激酶区的第20号外显子发生缺失加插入突变的序列结构。
附图5是人表皮生长因子受体突变基因的酪氨酸激酶区的第21号外显子发生点突变后具有的序列结构。
附图6是人表皮生长因子受体突变基因的酪氨酸激酶区的第19～21号外显子发生突变后一种序列结构。
附图7是人表皮生长因子受体突变基因的酪氨酸激酶区的第19～21号外显子发生突变后另一种序列结构。
附图8是中国人NSCLC患者的EGFR TK第19号外显子的缺失突变。
附图9是中国人NSCLC患者的EGFR TK第19号外显子的另一种缺失突变。
附图10是中国人NSCLC患者的EGFR TK第20号外显子的缺失加插入突变。
附图11是中国人NSCLC患者的EGFR TK第21号外显子上的点突变。
附图12是中国人NSCLC患者EGFR TK突变的类型。
附图13是应用EGFR TK区突变基因进行恶性肿瘤治疗的原理流程
附图14是应用EGFR TK区突变基因检测实施恶性肿瘤个体化治疗的原理流程
附图15是EGFR TK区突变基因在大肠杆菌内表达过程中PCR扩增的结果。其中，A表示样品，B表示Marker。
附图16是EGFR TK区突变基因在大肠杆菌内蛋白表达的结果。其中，A表示Marker，B表示诱导前的表达蛋白，C表示诱导后的表达蛋白。
附图17是EGFR TK区突变基因在大肠杆菌内表达蛋白复性后的纯化结果。其中，A表示Marker，B表示复性后的表达蛋白。
附图18是EGFR TK区突变基因在昆虫细胞内表达过程中Bacmid重组质粒的PCR验证结果。其中，A表示λ/Hind III Marker，B表示对照(空载体)转座，C表示第19号外显子L747-T751的缺失突变，D表示第21号外显子L858R的错义突变，E表示第20号外显子DN770-771的缺失突变，F表示第20号外显子DN770-771的AGG插入突变，G表示第19号外显子E746-A750的缺失突变，H表示15000 Marker。
附图19是EGFR TK区突变基因蛋白表达的Western-Blot验证结果。其中，A表示Marker，B表示对照，C第19号外显子L747-T751的缺失突变，D表示第21号外显子L858R的错义突变，E表示第20号外显子DN770-771的缺失突变，F表示第20号外显子DN770-771的AGG插入突变，G表示第19号外显子E746-A750的缺失突变。
附图20是EGFR TK区突变基因对胞内EGFR活性表达影响的Western-Blot检测结果。其中，A表示野生型对照，B表示第21号外显子L858R的错义突变，C表示第19号外显子L747-T751的缺失突变。
附图21是EGFR TK区突变基因对胞内EGFR活性表达影响随时间变化的结果。其中，A表示野生型对照，B表示第21号外显子L858R的错义突变，C表示第19号外显子L747-T751的缺失突变。
具体实施方式
实施例1：EGFR TK区基因突变的筛查
筛查样本主要为：原始肿瘤样本基因组DNA及癌细胞系cDNA。
设计针对EGFR第19至21号外显子的三对引物，对基因组DNA中的EGFR进行筛查。用于扩增癌细胞系cDNA中EGFR-TK区(酪氨酸激酶区)的引物详见表1。
表1 EGFR TK外显子的引物扩增
| 引物 | 外显子 | 序列(5’＞3’) | Ta(℃) | 产物长度(bp) |
| E19F1E19R1E20F1E20R1E21F1E21R1EGFRTKF 1EGFRTKF 1 | 191920202121TKTK | AGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGATGGGAGAGGCCAGTGCTGTCTCTAAGGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCCGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAGTCTGGAGAGCATCCTCCCCTGCATGTGGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGGCCCTGCTGTGGGATGAGGTACTC | 59.662.261.960.2 | 446385386981 |
采用Trizol试剂对各种癌细胞进行总RNA的提取。用不含RNase的DNase I(购自TaKaRa)对其中的基因组DNA进行消化后，取5ug总RNA以SuperScrip III(购自Invitrogen)进行逆转录。取适量合成的cDNA用于EGFR-TK区的PCR扩增。
在40μL的PCR体系中，以相应于50ng总RNA获得的cDNA为模板，采用Pyrobest DNA聚合酶进行扩增。PCR产物经过琼脂糖凝胶回收后，用于DNA序列测定。
对于扩增自肿瘤基因组DNA的PCR产物，先用初筛所用的正向引物进行测序，再用反向引物测序以确定突变位点；对于扩增自癌细胞系cDNA的PCR产物，同时用正反向引物进行测序(序列测定由ABI 377测序仪完成)。
如附图8至附图11，测序包括正向引物测序和反向引物测序，确定突变位点如附图12，结果表明，EGFR第19号外显子上为缺失突变，第21号外显子上为点突变，第20号外显子上为缺失加插入突变。
实施例2：中国人NSCLC的EGFR TK突变频率与国外其他地区的对比
随机抽取41例中国NSCLC患者的肿瘤基因组DNA，以及10例非腺癌组织的DNA样本。41例样本中，30例为男性，11例为女性。男性患者的年龄从43岁到77岁(平均57岁)，而女性患者的年龄从31岁到64岁(平均48岁)。17例为肺腺癌，21例为鳞癌，3例为腺鳞癌。20例有吸烟史，而21例无吸烟史。
用于基因突变筛查的7种人类癌细胞系，主要包括2例肺癌细胞系95D，NCI-H460，2例前列腺癌细胞系PC-3，Du-145，以及Hela，HT-1080和MCF-7等其它细胞系。
表2中国人NSCLC的3种EGFR TK突变频率与国外其他地区的对比
| 外显子 | 突变类型 | 突变频率(％) | ||
| 中国 | 日本1 | 其他地区2 | ||
| 192021 | 缺失缺失/插入点突变(错义突变) | 8 (80)1 (10)1 (10) | 52 (47)5 (5)54 (49) | 62 (46)12 (9)52 (39) |
实施例3：EGFR TK区突变基因(举例具体的突变位点)在大肠杆菌中的表达
设计引物(详见表3)，从EGFR的全长基因中扩增出TK区突变基因，通过限制性内切酶将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET15b上，转化大肠杆菌DH5a得到重组子。再将得到的重组子转入大肠杆菌表达菌株BL21中，得到表皮生长因子受体EGFR TK区突变基因的表达菌株rBL21-ETK。
表3 EGFR TK区突变基因扩增引物
| 引物 | 序列(5’＞3’) |
| FR | GGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGTTAGCCCTGCTGTGGGATGAGGTACTC |
接种菌株rBL21-ETK，将其培养到OD0.8时加入终浓度1mM的IPTG，诱导表达4个小时后，离心收菌，加入裂菌缓冲液重悬，然后在冰浴中进行超生波破菌。破菌后离心的沉淀用8M的尿素溶液溶解，挂镍柱进行蛋白纯化。纯化的蛋白在复性缓冲液中复性24个小时后离心，将上清液再次挂柱，洗脱后得到EGFR TK区突变基因的表达蛋白(附图15、附图16、附图17)。
实施例4：EGFR TK区突变基因(举例具体的突变位点)在昆虫细胞中的表达
设计引物(详见表4)，从EGFR的全长基因中扩增出TK区突变基因，通过限制性内切酶将其克隆到含昆虫多角体病毒启动子的载体pRESEVER-1a中，形成重组质粒。将重组质粒转座DH10Bac，蓝白斑筛选得到转座成功的白斑，碱裂解法抽提该菌斑中的含目的基因的Bacmid质粒，用PCR验证该质粒(附图18)。转染昆虫细胞sf9，得到所需的病毒粒子。
表4 EGFR TK区突变基因扩增引物
| 引物 | 序列(5’＞3’) |
| w023w024 | AGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAAGCTCGAGTTATTAGCCCTGCTGTGGGATGAGGTACTC |
将得到的病毒粒子循环感染两次，提高病毒粒子的滴度。将三次感染后的病毒粒子按1∶100大量感染昆虫细胞sf9，四天后收集细胞。超生波破碎细胞后，上清液用Western-Blot(WB)验证蛋白的表达(附图19)。
实施例5：EGFR TK区突变(举例具体的突变位点)对胞内EGFR活性表达的影响
EGFR TK区的突变可导致其活性的增强，在细胞水平可表现为磷酸化形式的EGFR表达量提高，进而影响其信号传导通路下游靶标的表达量变化，并最终影响细胞的增殖，分化等过程。
首先构建带有野生型EGFR基因的真核表达载体和EGFR TK区突变基因载体，将等量的上述载体分别转染人的非小细胞肺癌细胞株SPC-A-1中，于37℃、5％CO2条件下培养20～24小时后，血清饥饿18～24小时，在培养基中加入100ng/uL的EGF，于37℃进行刺激反应，同时设置不刺激的阴性对照。然后在不同时间点收集细胞，取等量细胞裂解液，用Western-Blot法检测，考察在EGFR总表达量一致的前提下，活性形式(磷酸化形式)EGFR的表达变化情况及其在野生型和突变体之间的变化差异，结果见附图20、21。
实施例6：药物抑制含有EGFR TK区突变基因的细胞生长
使用含EGFR TK区突变基因的人非小细胞肺癌细胞株SPC-A-1/EGFR，构建自稳定转染人全长EGFR基因的SPC-A-1细胞系。将药物Tressa溶解于有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，半数稀释于96孔细胞培养板，起始浓度为20mg/L，连续稀释6次至终浓度为0.312mg/L，阴性对照采用生理盐水，96孔板每孔接种SPC-A-1/EGFR细胞3000个，置于37℃5％CO2培养箱中培养72小时，然后用MTT染色法测定细胞活性，与阴性对照比较计算药物对SPC-A-1/EGFR细胞的生长抑制率(％)，回归计算药物的半数抑制浓度IC50，与SPC-A-1母系比较评价EGFR-TK区突变状态和其对药物的敏感性的关系。研究结果显示，含EGFR-TK区突变基因的肺癌细胞IC50和不含突变基因的细胞相比具有统计学差异(P＜0.001)，表明含EGFR TK区突变基因的细胞对ZD 1839更敏感。
表5 药物不同浓度对两种细胞的生长抑制作用
实施例7：Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)细胞株荷瘤裸鼠移植瘤生长
将40只5～6周龄的SPF级BALB/C裸鼠按雌雄各半分组后，用培养后的人肺癌SPC-A-1/EGFR细胞悬液接种于裸鼠右侧腋窝皮下，培养7天后按照肿瘤体积大小随机分组，腹腔注射Iressa(100mg/kg)，连续5天，每2天测量各只裸鼠肿瘤大小，用药结束后2天，处死裸鼠，取出肿瘤组织，称重后，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。实验结果见表6和表7。
表6 Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)细胞株荷瘤裸鼠移植瘤生长
——治疗后各组裸鼠肿瘤体积的动态变化
| 时间(天) | 肿瘤体积(mm3) | |
| 对照组 | GP 01(100mg/kg) | |
| 0481216202428 | 154.90±44.95382.18±129.57650.78±193.451123.95±414.661767.97±650.902263.60±840.322551.10±858.292873.89±967.77 | 147.01±40.69286.32±66.67352.91±89.34577.19±202.38820.62±285.991075.60±332.411483.63±292.391916.16±355.40 |
表7 Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)细胞株荷瘤裸鼠移植瘤生长
——治疗结束后各组平均瘤重
| 组别 | 平均瘤重(g) | P Value |
| 对照组GP 01(100mg/kg) | 1.86±0.641.01±0.51 | 0.010 |
实施例8：抑制前述突变基因的表达，能降低EGFR的活性表达，达到抑制肿瘤细胞的信号传导通路，遏制肿瘤细胞的增殖，促使其凋亡的目的。为抑制前述突变基因的表达，可以采用制备抑制剂，也可以采用制备抗体，或是其他类型的能够抑制前述基因表达的药物，来遏制肿瘤细胞的生长。(应列出具体制备方法！)附图13给出了应用本发明进行恶性肿瘤治疗的实施流程。
实施例9：通过检测前述突变基因，可以建立准确、敏感、可靠、快速的EGFR基因诊断技术，用来指导临床医师开展靶向抗肿瘤药物的个体化用药治疗。(应列出具体检测前述突变基因的方法！)附图14给出了应用本发明进行恶性肿瘤基因诊断的实施流程。
Claims (15)
1、人表皮生长因子受体(EGFR)的突变基因，其特征是这种突变基因是发生在EGFR的酪氨酸激酶(TK)区的第19～21号外显子上。
2、根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于是中国人非小细胞肺癌NSCLC的EGFR突变基因。
3、根据权利要求1和2所述的突变基因，其特征在于EGFR突变基因的突变方式包括有：缺失突变，点突变和缺失加插入突变。
4、根据权利要求3所述的突变基因，其特征在于EGFR第19号外显子上为(E746-A750缺失)突变和(L747-T751缺失)突变。
5、根据权利要求3所述的突变基因，其特征在于EGFR第21号外显子上为(L858R错义)突变。
6、根据权利要求3所述的突变基因，其特征在于EGFR第20号外显子上为(DN(770-771)缺失&AGG插入)突变。
7、根据权利要求1和2所述的突变基因在大肠杆菌中表达的蛋白的制备方法，其特征在于IPTG诱导表达后，镍柱进行蛋白纯化。
8、根据权利要求1和2所述的突变基因在昆虫细胞中表达的蛋白的制备方法，其特征在于采用含昆虫多角体病毒启动子的载体。
9、根据权利要求1和2所述的突变基因的应用，其特征在于提供了肿瘤治疗药物的制备的基因靶位。
10、据权利要求9所述的突变基因的应用，其特征在于提供了非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备的基因靶位。
11、据权利要求9所述的突变基因的应用，其特征在于提供了中国人非小细胞肺癌靶向治疗药物的制备的基因靶位。
12、根据权利要求1和2所述的突变基因的应用，其特征在于可以采用制备抑制剂，制备抗体，或是其他类型的能够抑制基因表达的药物的方式。
13、根据权利要求1和2所述的突变基因的应用，其特征在于在肿瘤治疗中人表皮生长因子受体基因检测的应用。
14、根据权利要求13所述的突变基因的应用，其特征在于在非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因的检测中的应用。
15、根据权利要求13所述的突变基因的应用，其特征在于在中国人非小细胞肺癌治疗中人表皮生长因子受体基因的检测中的应用。
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