CN103333963A - Egfr突变检测引物组及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组用来检测EGFR基因L858R点突变的引物组及用此引物组来检测EGFR基因L858R点突变的方法。本发明的检测方法具有高特异性、快速、高效扩增、灵敏度高、鉴定简便等优点，可广泛用于临床常规检测及流行病学调查。

Description

EGFR突变检测引物组及其用途

技术领域

本发明属于分子诊断和基因诊断领域，涉及一种非小细胞肺癌患者样本中EGFR基因L858R点突变的检测方法。

背景技术

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)在NSCLC患者的治疗中得到了广泛的应用。EGFR-TKI能够有效延缓晚期NSCLC的进展并延长患者生存期。EGFR-TKI的疗效很大程度上取决于EGFR的突变状态。早期临床研究显示，女性，亚裔，非吸烟或少吸烟，腺癌的NSCLC患者对吉非替尼(Gefitinib)有较高的反应率。随后发现，EGFR突变与吉非替尼的化疗具有明显的相关性。在EGFR突变类型当中，外显子19缺失突变和外显子21点突变占到了突变总数的90％以上，其中外显子21中L858R突变就占到了突变总数的40-45％，而且外显子21点突变对于EGFR-TKI治疗有效率高达71％，因此对L858R的点突变检测，有助于筛选出合适治疗的人群，具有较好的临床意义。

目前，EGFR突变的检测方法仍以组织检查为金标准，但组织标本突变的检测由于获取的组织量不足，获组织部位不理想，因此具有一定局限性。此外还有PCR-sequencing法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、ARMS法、Real-time PCR法、DHPLC等方法。其中，PCR-sequencing法可以直接通过测序获得样本突变信息，但该方法要求样本为肿瘤组织，而且敏感性不高，容易受到背景DNA的影响，不宜用于肿瘤组织外的其他样本。除了直接测序法之外，PCR-SSCP和PCR-RFLP法也仅见到用于肿瘤组织的检测，未见有在其他标本中检测的介绍。从上述方法中不难看出，除了DHPLC法意外，其余方法均是基于PCR技术实现的，该技术具有操作复杂、检测成本较高无形中加重了患者负担、对于操作人员要求较高、不利于在基层医院开展等缺点。此外，根据PCR技术的原理，需要有变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的反应温度和时间均不相同且有十分精确的要求，甚至需要进行20-40个循环来完成，因此需要依赖相对贵重的PCR温度循环仪进行控制，不利于现场诊断的要求。核酸序列扩增法(NASBA)，自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)虽然属于等温扩增法，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要后续的实验操作手段来对于扩增产物进行检测，因此具有操作繁琐的缺点。免疫学检测技术要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则准确性不够。

为了改善目前EGFR检测操作复杂、依赖昂贵的仪器设备、检测成本高、对操作人员要求较高等缺点，开发一种能够不依赖于昂贵的仪器设备，能够在1小时内对患者样本进行检测，并且可以用肉眼直接观察结果的EGFR突变检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检准率高的环介导等温扩增试剂盒对EGFR基因L858R进行检测，使其反应程序化，能够广泛应用于临床检验及流行病学调查。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification ofDNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000Jun15；28(12)：E63.)。该技术具有以下优点：(1)特异性强，PCR反应仅需要一对引物来识别靶DNA，达到分子检测的目的，而LAMP技术使用2对引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，因此特异性较高；(2)灵敏度高，由于该技术使用了一种灵敏度、扩增效率高的DNA聚合酶，因此大大提高了灵敏度，并且缩短了检测时间；(3)操作简单，是用肉眼对结果就能进行判断，并且在等温条件下反应，操作简便不依赖贵重仪器设备。

因此本发明利用了该技术的上述优点，将其应用于EGFR基因点突变的检测，能够改善目前众多技术的不足。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，通过以下技术方案实现了高效、特异性检测EGFR基因L858R点突变的目的。

本发明的一个技术方案如下：

一组用于检测EGFR基因L858R点突变的引物组，其包含以下引物：

外引物1：TGGAGGACCGTCGCTT

外引物2：CCGTAGCTCCAGACATCA

内引物1：

CCAGCCCAAAATCTGTGATCTTGAGACCTGGCAGCCAGGAAC

内引物2：

AGAATACCATGCAGAAGGAGGCTGGTGGGTATAGATTCTGTGTA。

本发明的另一个技术方案是上述引物组在检测EGFR基因L858R点突变中的应用。

本发明的另一个技术方案是上述制备检测EGFR基因L858R点突变的试剂盒中的用途。

利用本发明的引物来检测的方法如下：

1、对被检样品的预处理：用常规法快速提取样本DNA；

2、按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的内引物1和内引物2；0.1-10mM的外引物1和外引物2，1-10mM的dNTPs，1-10mM的MgSO4，1-10M的甜菜碱，1-5μL粗提DNA，1-8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μL，温和混匀。

3、进行环介导恒温扩增反应：在60～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应。

4、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。

本发明利用环介导恒温基因扩增技术，构建了EGFR点突变快速检测试剂盒，有以下创新点：

特殊引物的设计：原有环介导等温扩增的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入对于多态性位点引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善，在引物设计时，根据LAMP技术的特殊性，充分考虑了引物二聚体ΔG；3’和5’末端ΔG；错配概率，优化了引物间距和扩增效率，大大提高了扩增反应的特异性和灵敏度。根据EGFR基因所设计的六条引物是扩增进行的关键。

本发明的有益效果：①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；②高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，假阳性率为0；③快速、高效扩增：扩增仅需1小时即可完成，且产率高；④灵敏度高：对EGFR基因的最低检测极限达到10个拷贝以内，标本的检出率达高到99％；⑤鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。⑥.用途广，可广泛用于临床的常规检测及流行病学调查。

附图说明

图1是本发明实施例各样本检测结果图。

其中，A为样本1的检测结果，B为样本2的检测结果，C为样本3的检测结果。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不仅限于实施例。

实施例：等温扩增法快速检检测EGFR点突变

步骤一：被检样品预处理

按照常规方法提取样本DNA。

其中样本如下：

样本1：存在EGFR基因L858R突变的样本

样本2：不存在EGFR基因L858R突变的野生型样本

样本3：去除DNAase和RNAase的无菌双蒸水

步骤二：等温扩增反应体系配置

反应体系为25μL：1.6mM的内引物1和内引物2；0.2mM的外引物1和外引物2；1.6mM的dNTPs；6mM的MgSO4；1M的甜菜碱；通过步骤一获得的2μL样本DNA；8U Bst DNA聚合酶；加蒸馏水至25μL。所用引物如下：

外引物1：TGGAGGACCGTCGCTT

外引物2：CCGTAGCTCCAGACATCA

内引物1：

CCAGCCCAAAATCTGTGATCTTGAGACCTGGCAGCCAGGAAC

内引物2：

AGAATACCATGCAGAAGGAGGCTGGTGGGTATAGATTCTGTGTA

步骤三：等温扩增反应实施

将步骤二中配置的反应液在63℃下保温1h，随后85℃加热2min以终止反应。

步骤四：结果观察

在反应产物中加入1.0μL荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。观察颜色变化。

步骤五：实验结果

样本1的结果见图1A，为绿色，说明存在EGFR基因L858R突变。

样本2的结果见图1B，为橙色，说明不存在EGFR基因L858R突变。

样本3的结果见图1C，为橙色，说明不存在EGFR基因L858R突变。

由以上的实验数据可以看出，实验检测结果与实际相符。通过对检测结果颜色的观察，可以直观、迅速的将EGFR基因L858R突变样品鉴别出来。

Claims (4)

1.一组用于检测EGFR基因L858R点突变的引物组，其包含以下引物：

外引物1：TGGAGGACCGTCGCTT

外引物2：CCGTAGCTCCAGACATCA

内引物1：

CCAGCCCAAAATCTGTGATCTTGAGACCTGGCAGCCAGGAAC

内引物2：

AGAATACCATGCAGAAGGAGGCTGGTGGGTATAGATTCTGTGTA。

2.权利要求1所述的引物组在检测EGFR基因L858R点突变中的应用。

3.权利要求1所述的引物组在制备检测EGFR基因L858R点突变的试剂盒中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：试剂盒的使用方法如下：

(1)对被检样品的预处理：用常规法快速提取样本DNA；

(2)按照以下配方配制反应液：反应体系为25μL：1-10mM的内引物1和内引物2；0.1-10mM的外引物1和外引物2，1-10mM的dNTPs，1-10mM的MgSO4，1-10M的甜菜碱，1-5μL粗提DNA，1-8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μL，温和混匀。

(3)进行环介导恒温扩增反应：在60～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应。

(4)分析判断反应产物结果：在反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。