CN107365864A - 检测brca1基因、brca2基因、palb2基因突变位点的试剂盒和方法 - Google Patents

检测brca1基因、brca2基因、palb2基因突变位点的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1‑12所示序列的ARMS引物以及如SEQ ID NO.20‑23所示序列的探针。此外，本发明还公开一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的方法，该方法包括步骤：1)提取样本DNA，作为DNA模板；2)利用如SEQ ID NO.1‑12所示的ARMS引物和如SEQ ID NO.20‑23所示的探针，对DNA模板进行荧光PCR扩增；3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的突变。本发明能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、特异性好、灵敏度高等优点。

Description

检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒和 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒；此外，本发明还涉及检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的方法。
背景技术
乳腺癌(mammary carcinoma)是女性最主要的恶性肿瘤，在北美、西欧等发达国家，乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤发病率的首位。据美国癌症协会估计，2003年，美国每10万名妇女中就有124.2人患乳腺癌。近年来，乳腺癌在我国的发病率也明显增高，全国乳腺癌发病率以每年3％的比率递增，成为发病率增长最快的肿瘤。沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。
以往经典研究者认为大约5-20％的乳腺癌是由于遗传性的基因突变引起的，其中肿瘤抑制基因BRCA1(breast cancer 1,early onset)、BRCA2(breast cancer 2,earlyonset)、PALB2(partner and locaizer of BRCA)基因与乳腺癌发病的关系较为密切。
BRCA1基因定位于17q21，约81kb,内含高达4115％的Alu重复序列和418％的其它重复序列。含有23个外显子。BRCA1编码蛋白的N末端序列含有一环状结构域(ringdomain)，能够与BRCA1相关环状蛋白(BRCA12associated ring domain protein，BARD1)组成环2环异二聚体。现代研究认为BRCA1的N末端在调节RNA合成酶功能方面起着重要作用。BRCA2基因定位于13号染色体q12。全基因组DNA长约70kb，其中编码区含有10987bp，且富含AT(约64％)，其基因序列与BRCA1无明显关系。BRCA2由27个外显子组成，其中第11个外显子长约4932bp，mRNA长约10.2kb，编码的BRCA2蛋白含3418个氨基酸。正常BRCA2蛋白位于细胞核内，参与DNA的修复。在细胞周期的扩增期的表达方式和BRCA1相似。
美国一项对1008名妇女乳腺癌患者以及她们的家庭进行的研究，美国所有乳腺癌病例中有7％与BRCA1和BRCA2的突变有关，而在犹太妇女中，比例更高约为10％。具有BRCA1和BRCA2的突变基因，终身患乳腺癌风险高达80％。
在我们的研究中，对489例早发性乳腺癌进行BRCA1/2基因一代测序检测，发现在这些患者中，BRCA1基因上两种突变重复出现：分别为5589del8(15例)，BRCA1基因变位点1100delAT(4例)，BRCA2 2442delC(2例)。
PALB2(partner and localizer of BRCA2)是BRCA2互作蛋白，对BRCA2发挥基因组管理员功能非常重要。著名期刊位New England Journal of Medicine发表文章，于人体第16号常染色体上的PALB2基因与不同年龄段女性乳腺癌发病率有密切联系，会增加乳腺癌患病风险。Lancet Oncol期刊也有文章报道，研究人员发现：之前关于家族遗传学乳腺癌的研究已经证实携带PALB2突变的女性患乳腺癌的风险增加，与非携带者相比较，PALB2突变还增加了死于乳腺癌的预后风险。17900名乳腺癌患者被邀请参加此项研究，其中12529名患者基因成功分型。12529例患者中有116例存在一个PALB2突变(0.93％，95％Cl 0.76-1.09)，4702名对照组女性中有10名携带突变(0.21％，0.08-0.34)(OR 4.39，95％Cl 2.30-8.37，P<0.0001)。乳腺癌并携带一个PALB2突变的女性10年生存率为48.0％(95％Cl 36.5-63.2)，乳腺癌患者没有携带突变基因的10年生存率为74.7％(73.5-75.8)(调整死亡风险比2.27，95％Cl 1.64-3.15，P<0.0001)。
在我们的研究中，发现PALB2 1052_1053insT突变重复出现，在所有489例乳腺癌患者中有4例，肿瘤中重复出现的突变属于高频发生的突变位点，预示这些位点与肿瘤的发生相关性很高。BRCA突变携带者可以通过乳房切除术联合用药，来预防和治疗乳腺癌发生发展，而PALB2突变可以预示乳腺癌患者预后，因此，对这几种高频突变进行检测，对乳腺癌的预防、治疗和预后具有重要意义。
目前，BRCA1、BRCA2、PALB2基因突变位点的检测主要以一代测序技术为主：一代测序技术检测前有PCR扩增过程，再通过测序仪检测，操作繁复、检测通量低且耗时长，不适用于乳腺癌高发大量人群筛选检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒。为此，本发明还提供检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的方法。该发明是基于ARMS-qPCR系统的荧光PCR检测方法，其能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1-12所示序列的ARMS引物以及如SEQ ID NO.20-23所示序列的探针。
作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒包括如下荧光PCR反应体系：
作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒还包括：如SEQ ID NO.24-25所示的质控基因引物和SEQ ID NO.26所示的质控基因探针。
在本发明的另一方面，提供一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的方法，该方法不包括疾病的诊断和治疗方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组如SEQ ID NO.1-12所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.20-23所示的探针，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增(即进行荧光PCR扩增突变基因序列)；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的突变。
所述步骤1)中，样本包括：血液等。
所述步骤2)中，所述探针为特异性双环分子信标荧光探针，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构，通过与特异性引物扩增得到的产物相结合，双环探针环状结构消失，引起荧光的产生。此外，探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，5’端的荧光基团包括：FAM、HEX、CY5或ROX，优选为FAM或ROX；3’端的淬灭基团可包括：BHQ(如BHQ 1等)、Eclipse和TAMRA，优选为BHQ 1。
步骤2)中，所述荧光PCR扩增的总体积为40μL的反应体系如下：
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
所述步骤2)中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：
95℃预变性10分钟，15个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒；35个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ ID NO.24-25所示的质控基因引物和SEQ IDNO.26所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
所述步骤3)中，判断BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的突变的标准为：
检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM荧光信号，以质控基因FAM荧光信号达到设定阈值时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为突变阴阳性判断的标准，Ct值≥35：阴性；Ct＜35：阳性。
表1序列
本发明中，根据人类BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点野生型基因序列和相应突变基因序列，设计一组ARMS引物和一个特异性双环分子信标荧光探针，并配制荧光PCR扩增突变位点基因序列的反应体系，以及用上述引物和特异性双环分子信标荧光探针同时扩增待测的基因序列，利用双环分子信标荧光探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，从而最终进行BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的检测。
通过分析，本试剂盒中检测乳腺癌中高频发生的4个突变热点为BRCA1基因的5589del8、1100delAT突变位点，BRCA2基因的2442delC突变位点以及PALB2基因的1052_1053insT突变。本发明设计了基于ARMS荧光定量技术的引物探针检测试剂盒，并建立了检测方法，得到了很好的检测结果，适用于遗传性乳腺癌的预防和个体化用药筛选检测。
本发明的有益效果如下：本发明能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、特异性好、灵敏度高等优点。
1)通量高：本发明采用的定量PCR技术，尤其是ARMS荧光定量技术(ARMS-qPCR方法)，可以实现一个样本多位点同时检测，并且一次检测可以多个样本同时操作，可一次性分析17个样本的4个突变位点；
2)灵敏度高：10ng基因组DNA即可完成精准分析；
3)特异性好，精度高，检测成功率为100％；
4)污染少：检测过程为闭管检测，减少污染的可能性；
5)操作简单快速，整个检测过程耗时短，90分钟内即可得到检测结果，检测效率很高，成本低；
6)安全：整个体系不包含有毒有害物质，避开电泳检测，对实验人员和环境无危害。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
本发明以基因工程构建的突变质粒和野生质粒为模板，构建人类BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点ARMS实时荧光PCR检测体系，以FAM为荧光信号检测对象，通过特异ARMS引物的优化组合以及荧光探针检测体系优化，从而实现快速准确、简单地，通量化检测。
检测BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的方法，包括以下步骤：
1.针对突变位点设计合成ARMS引物组合和探针
根据BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的序列，针对突变位点设计多对ARMS引物组合和探针(表2)，通过实验优化，实现高灵敏和特异性检测。
针对突变位点序列，应用primer 5.0引物设计软件设计多对ARMS引物组合和探针，引物和探针序列如表2所示。其中，引物Actin forward和Actin reverse作为质控基因引物，探针Actin Probe作为质控基因探针，以进行质控。
表2引物探针序列
2、待测样本制备和提取
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
3、荧光PCR扩增，建立扩增反应体系
将步骤2中得到的DNA样本(即DNA模板)，经紫外分光光度计检测并读取其含量。将DNA模板稀释至10ng/μL。
按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积40μL)：
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
实时PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，15个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒；35个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4、检测荧光信号，以达到设定阈值所需的循环数Ct值作为结果判断的标准：
其中，以FAM的荧光信号为例，具体如下：
检测反应体系的FAM荧光强度，以actin基因的FAM信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明DNA上样量在允许范围内，FAM信号可信。以FAM达到设定阈值所需Ct值作为判断标准：Ct值大于等于35：阴性；Ct值小于35：阳性。
实施例1
运用含BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的质粒模板(与各待测位点对应)，利用表2中引物和探针，分别进行qPCR以优化选择最佳的ARMS引物。
其中，对于下述涉及的野生型质粒及突变型质粒均可按照常规的质粒构建方法并利用PCR克隆方法制备得到。
1)质粒处理和抽提：
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit，DP116)的质粒提取试剂盒进行，具体操作步骤详见产品说明书。所提DNA溶解于Tris-HCl中(10mmol/L，pH8.0)，紫外分光光度计检测样本质量并测定浓度。然后，将样本稀释至2000copies/uL。取5μL进行PCR反应。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(qPCR体系，总体积20μL)
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
3)PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，15个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒；35个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)优化ARMS引物，将表中引物分为15组(表3)。
表3引物探针组合
组内上游引物同下游引物配对检测相应突变位点，其他qPCR体系中成分固定不变，结果如表4所示，引物组1-8结果最佳。
表4引物探针优化研究结果
6)灵敏度分析：将质粒模板从2000个拷贝开始稀释，直至稀释至1拷贝，然后分别对其进行检测，结果表明本发明的荧光PCR方法灵敏度高，引物检测对应质粒样本，10拷贝/40微升即可检出(如表5所示)。
表5质粒梯度稀释结果
检测结果表明，本发明的检测体系选择最优的ARMS引物对和探针(即SEQ IDNO.1-12所示的引物和SEQ ID NO.20-23所示的探针)，可准确识别突变位点，检测的灵敏度可达到10拷贝/40微升。
实施例2
运用本发明检测临床样本，97个血液样本抽提DNA后，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并同时进行测序验证。
步骤如下：
1)样本处理和DNA提取：
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
样本稀释至10ng/μL。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积40μL)
其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1-12所示的ARMS引物探针为如SEQID NO.20-23所示的探针。
另外，PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFETECH公司。
3)PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，15个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒；35个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)检测结果表明本发明检测结果同DNA测序结果一致(如表6所示)。
表6样本检测统计结果
样本数 qPCR检测结果 一代测序结果 一致性
2 BRCA2 2442delC BRCA2 2442delC 一致
4 PALB2c.1052_1053insT PALB2c.1052_1053insT 一致
4 BRCA1 1100delAT BRCA1 1100delAT 一致
15 BRCA1 5589del8 BRCA1 5589del8 一致
72 无突变 无突变 一致
序列表
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 16
agattttaaa gatttctctg tca 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 17
gggctggaag taaggaaggc a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 18
gtgttctctg tctccagcaa t 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 19
cttgtgttct ctgtctccag ca 22
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
agatgtagca catacatctt gattcttttc cagaatca 38
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
cttacccatt tgctggtaag ttattgtagg tgagcaataa 40
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
tccgatgata ggcggactcc cagcacaggg ag 32
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
ttggactaca ctgtccaaca cccactctcg ggggtg 36
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 24
ggcattgccg acagga 16
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 25
gcaggaaaga cacccacc 18
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
atctcgtaag gagatcactg ccctgcagtg 30

Claims (10)

1.一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1-12所示序列的ARMS引物以及如SEQ ID NO.20-23所示序列的探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括如下荧光PCR反应体系：
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：如SEQ ID NO.24-25所示的质控基因引物和SEQ ID NO.26所示的质控基因探针。
4.一种检测BRCA1基因、BRCA2基因、PALB2基因突变位点的方法，该方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组如SEQ ID NO.1-12所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.20-23所示的探针，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的突变。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述样本包括：血液；
步骤2)中，所述探针为特异性双环分子信标荧光探针；所述探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团包括：FAM、HEX、CY5或ROX；淬灭基团包括：BHQ、Eclipse和TAMRA。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为FAM或ROX；所述淬灭基团为BHQ1。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，荧光PCR扩增的总体积为40μL的反应体系如下：
8.如权利要求4或7所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：
95℃预变性10分钟，15个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒；35个循环，95℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ IDNO.24-25所示的质控基因引物和SEQ ID NO.26所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，判断BRCA1基因第10外显子和第23外显子、BRCA2基因第11外显子、PALB2基因第4外显子突变位点的突变的标准为：
检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM荧光信号，以质控基因的FAM信号达到设定阈值时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为突变阴阳性判断的标准，Ct值≥35：阴性；Ct＜35：阳性。
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