CN107815494B - 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸 - Google Patents

检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN107815494B
CN107815494B CN201711071291.3A CN201711071291A CN107815494B CN 107815494 B CN107815494 B CN 107815494B CN 201711071291 A CN201711071291 A CN 201711071291A CN 107815494 B CN107815494 B CN 107815494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcm1
jak2
probe
abl
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711071291.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107815494A (zh
Inventor
刘赵玲
吴鹏飞
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HEFEI AIDIKANG MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.
Original Assignee
Hefei Aidikang Medical Laboratory Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei Aidikang Medical Laboratory Co ltd filed Critical Hefei Aidikang Medical Laboratory Co ltd
Priority to CN201711071291.3A priority Critical patent/CN107815494B/zh
Publication of CN107815494A publication Critical patent/CN107815494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107815494B publication Critical patent/CN107815494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

检测PCM1‑JAK2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸，本发明提供定量检测样本中PCM1‑JAK2融合基因相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸，均涉及检测用上游引物PCM1‑JAK2‑E36/E9‑F、PCM1‑JAK2‑E25/E9‑F，下游引物PCM1‑JAK2‑E36/E9‑R、PCM1‑JAK2‑E36/E7‑R、PCM1‑JAK2‑E25/E9‑R，探针PCM1‑E36‑Probe和PCM1‑E25‑Probe以及内参基因Abl上游引物Abl‑F、下游引物Abl‑R和探针Abl‑Probe。本发明有助于在临床上检测骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤患者体内PCM1‑JAK2融合基因相对表达量，对于调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

Description

检测PCM1-JAK2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，涉及一种定量检测人类骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤样本中的PCM1-JAK2融合基因相对表达量的方法和试剂盒及其所使用的寡核苷酸，通过采用实时荧光定量PCR技术，能够对样本中的PCM1-JAK2相对表达量进行定量检测。
背景技术
骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤(MDS/MPN)是一类以一系或多系髓系细胞(包括红系、粒系和巨核系)增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。大约有四分之三的MDS/MPN病例被称为典型的骨髓增殖性肿瘤(MPN)，带有JAK2基因上的V617F体细胞突变。这种突变可诱发血小板生成素受体(TPOR)、粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)等活化及信号传导异常，造成巨核细胞系及粒系祖细胞异常增殖，原发性血小板增多症(PT)及原发性骨髓纤维化(PMF)的发病也可能与此有关。
JAK2基因编码JAK-STAT通路中的酪氨酸激酶受体。人体内的JAK2基因发生V617F突变，可引起JAK2激酶及下游信号转导通路的持续活化和增强，导致细胞恶性增殖和凋亡抑制，最终引起真性红细胞增多症(PV)的发生。JAK2突变已经被作为原发性红细胞增多症(ET)、许多PMF和PT病例的潜在分子机制。PCM1蛋白最初是作为自体抗原在病人中发现，病人表现为系统性硬化，并且表现出明显的与中心粒复合体相关联的细胞周期依赖性。PCM1蛋白包含几个螺旋卷曲基序，这些基序被认为是用于促进特殊蛋白形成中心体、微管结构和在细胞周期进程中发生寡聚化。不同的断裂点能检在JAK2和PCM1t(8；9)(p21-23；p23-24)融合基因中检测到，大多数PCM1-JAK2融合基因是符合读码框的，其编码的融合蛋白在257～310KDa之间。这些融合蛋白包含PCM1的螺旋卷曲区域(96％来自PCM1)和JAK2的完整的酪氨酸激酶激活域(多达61％来自JAK2)。
对个别病例进行深入分析表明，PCM1-JAK2融合基因相关的异常的表型基因多效性与JAK2SH2样结构域中的精确的断裂点有关。文献报道指出，Andreas Reiter等发现PCM1外显子36分别与JAK2外显子7、外显子9发生融合的PCM1-JAK2剪接体，A Murati等发现了JAK2外显子9与PCM1外显子25发生融合的PCM1-JAK2剪接体。PCM1-JAK2融合基因是涉及JAK2的第三种融合基因，另外两种为ETV6-JAK2和TEL-JAK2。研究发现在PCM1-JAK2相关疾病中，男性患者占绝大多数，男女患病比例为7:1，临床症状经常包括肝脾肿大。大多数病例还有骨髓增生性肿瘤(MPN)或者骨髓增生异常综合征(MDS)。PCM1-JAK2相关疾病可能演化为继发性急性髓细胞白血病(AML)和B细胞型急性淋巴细胞白血病。
目前临床上已经将PCM1-JAK2融合基因作为一种骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤个体化治疗方案的选择和制定依据。PCM1-JAK2融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。
常见的RQ-PCR有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
RQ-PCR Taqman探针法，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
发明内容
鉴于现有技术中检测PCM1-JAK2融合基因的不足，本发明采用基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术定量检测PCM1-JAK2融合基因的相对表达量。本发明设计了检测内参/目的基因的引物、探针序列，采用基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术检测PCM1-JAK2融合基因的相对表达量，通过调整引物、探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。
本发明提供了定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-Probe，其碱基序列如下所示：
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA。
进一步地，所述寡核苷酸还包括内参基因Abl上游引物Abl-F、下游引物Abl-R和探针Abl-Probe，其碱基序列如下所示：
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
进一步地，所述PCM1-JAK2融合基因选自PCM1-JAK2(E36/E9)、PCM1-JAK2(E36/E7)或PCM1-JAK2(E25/E9)。
本发明还提供了一种定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的方法：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-probe定量检测样本中的PCM1-JAK2融合基因表达量；利用内参基因Abl上游引物Abl-F、Abl下游引物Abl-R和探针Abl-Probe定量检测样本中的Abl表达量，其中，
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-Probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA；
(4)计算样本中的PCM1-JAK2融合基因相对表达量。
本发明还提供了一种定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样本RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-Probe以及内参基因Abl上游引物Abl-F、下游引物Abl-R和探针Abl-Probe，其中，
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-Probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
进一步地，所述试剂盒还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。
进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取液，所述样本RNA提取液包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为去离子水。
进一步地，所述PCM1-JAK2融合基因选自PCM1-JAK2(E36/E9)、PCM1-JAK2(E36/E7)或PCM1-JAK2(E25/E9)。
本发明的有益效果：(1)本发明采用基于Taqman探针的实时荧光PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因Abl和PCM1-JAK2融合基因的定量标准曲线，检测受测者体内PCM1-JAK2的表达水平，相比于以往的FISH和△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点；
(2)鉴于PCM1-JAK2融合基因的融合方式存在三种：PCM1外显子36与JAK2外显子7融合在一起，记为PCM1-36-JAK2-7；PCM1外显子36与JAK2外显子9融合在一起，记为PCM1-36-JAK2-9；JAK2外显子9与PCM1外显子25融合在一起，记为PCM1-25-JAK2-9。在检测PCM1-JAK2融合基因时，需要设计上下游引物和探针去检测这三种融合方式。在设计引物和探针时，通过分析PCM1-36-JAK2-7、PCM1-36-JAK2-9和PCM1-25-JAK2-9的碱基序列，让PCM1-36-JAK2-7和PCM1-36-JAK2-9共用一个上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F，同时让PCM1-36-JAK2-7和PCM1-36-JAK2-9共用一个探针PCM1-E36-Probe，这样就尽可能地减少引物和探针的数量，降低检测成本和背景信号；
(3)本发明将实时荧光PCR技术反应体系所用的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率；
(4)本发明经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，有助于临床上骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤患者体内PCM1-JAK2融合基因的检测，对于调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1为PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒溶液扩增曲线图。
图2为PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒溶液扩增曲线图。
图3为PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒溶液扩增曲线图。
图4样本1的PCM1-JAK2(E36/E9)扩增曲线图。
图5样本1的PCM1-JAK2(E36/E7)扩增曲线图。
图6样本1的PCM1-JAK2(E25/E9)扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1
用于定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的核酸检测试剂盒，包括：红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA；样本RNA提取液：TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水；RNA逆转录试剂：ReverTra Ace qPCR RTKit(TOYOBO公司)；
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)；检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F各10μM，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R各10μM，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-probe 10μM；内参基因Abl上游引物Abl-F、下游引物Abl-R各10μM、探针Abl-Probe 10μM；其中，
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-Probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA；
阳性对照品：含PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液；
阴性对照品：不含PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液；
空白对照品：去离子水。
所述核酸检测试剂盒可用于辅助临床上骨髓增生性异常/骨髓增殖性肿瘤患者的个体化治疗方案制定。
实施例2
本发明方法的操作流程如下所示，所用的试剂来自于实施例1：
1.抽提血液样本中的总RNA：
在1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μL RNase-free水溶解沉淀，从而获得RNA溶液。
2.将RNA逆转录为cDNA
参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中获得的RNA逆转录为cDNA。
3.荧光定量PCR检测
(1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份23μL分装：
X＝23μL检测体系PCR反应液×(8份Abl内参基因校准品+8份PCM1-JAK2融合基因校准品+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；其中，这8份Abl内参基因校准品指的是每份Abl内参基因校准品具有一个不同的浓度梯度，每份Abl内参基因校准品都需要检测一次，用于绘制针对Abl内参基因的标准曲线；这8份PCM1-JAK2融合基因校准品指的是每份PCM1-JAK2融合基因校准品具有一个不同的浓度梯度，每份PCM1-JAK2融合基因都需要检测一次，用于绘制针对PCM1-JAK2融合基因的标准曲线。
(2)加样：加入检测体系PCR反应液中2μL cDNA；阳性对照：加2μL阳性对照品；阴性对照：加2μL阴性对照品；空白对照：加2μL空白对照品。
(3)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数。
1)内参基因Abl阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<35，为阳性；35≤Ct≤37，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞37，为阴性。
实施例3健康人群临床样本检测结果
取待检的健康体检样本12例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照实验，内参基因/PCM1-JAK2融合基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为100分钟。结果如表1所示。
表1 12例健康体检样本PCM1-JAK2mRNA表达水平
Figure BDA0001457023440000081
Figure BDA0001457023440000091
由表1可知，这12例筛查样本的内参基因abl均起线，但是它们当中未有一例样本出现PCM1-JAK2融合基因起线。
实施例4阳性质粒检测结果
取三份阳性质粒溶液：(a)PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒溶液，即含PCM1-JAK2(E36/E9)融合基因cDNA序列的阳性质粒；(b)PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒溶液，即含PCM1-JAK2(E36/E7)融合基因cDNA序列的阳性质粒；(c)PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒溶液，即含PCM1-JAK2(E25/E9)融合基因cDNA序列的阳性质粒，按实施2所述方法配置试剂并进行荧光定量PCR检测。对每份阳性质粒溶液而言，取2μL阳性质粒溶液加入到检测体系PCR反应液中。同时做内参、空白对照实验，内参基因的标准曲线各一份。检测时间仅为100分钟。PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒溶液、PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒溶液和PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒溶液扩增曲线图分别如图1、图2和图3所示。
由图1、图2和图3可知，PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒溶液、PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒溶液和PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒溶液的Ct均小于35，这就表明本发明都能够准确地检测出这三种阳性质粒溶液。
然后，对这三份阳性质粒溶液分别按10-1、10-2……10-10进行梯度稀释，分别取100copies/ml、10copies/ml和1copies/ml的PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒溶液；100copies/ml、10copies/ml和1copies/ml的PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒溶液；100copies/ml、10copies/ml和1copies/ml的PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒溶液，作为模板开展实验，每个浓度重复3管。检测结果如表2、表3和表4所示。
表2.PCM1-JAK2(E36/E9)阳性质粒灵敏度检测结果
Figure BDA0001457023440000101
表3.PCM1-JAK2(E36/E7)阳性质粒灵敏度检测结果
Figure BDA0001457023440000111
表4.PCM1-JAK2(E25/E7)阳性质粒灵敏度检测结果
Figure BDA0001457023440000112
由表2、表3和表4可知，鉴于PCM1-JAK2融合基因阳性判断标准为Ct<35，本发明检融合基因PCM1-JAK2(E36/E9)、PCM1-JAK2(E36/E7)和PCM1-JAK2(E25/E7)的灵敏度分别为10copies/ml、10copies/ml和100copies/ml。
实施例5临床样本检测
取待检的白血病患者临床血液样本12例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样本加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性，阴性，空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测12份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。实验结果如下表5所示。另外，样本1的扩增曲线如图4、图5和图6所示。
表5. 12例临床样本PCM1-JAK2 mRNA表达水平
Figure BDA0001457023440000113
Figure BDA0001457023440000121
Figure BDA0001457023440000131
在12例筛查样本中，所有样本的abl均起线，但PCM1-JAK2均未起线。另外利用金标准方法Sanger测序对这12例样本都进行检测，发现它们确实为PCM1-JAK2阴性样本，这意味着本发明检测结果都是准确的。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测PCM1-JAK2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctttgccg ttacgtttac c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacaacctca gtgggacaaa gaa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccactcag gttgtactct tca 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatgtgcat ctgcagttaa tctataa 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggacgaga ttcattttgt gaaatt 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcctgaaagc tctctggctg gaagtcc 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgggagtga tttttccatg tttgaagct 29
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcttctgatg gcaagctcta cgtctcct 28

Claims (9)

1.定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-Probe，其碱基序列如下所示：
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-Probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括内参基因Abl上游引物Abl-F、下游引物Abl-R和探针Abl-Probe，其碱基序列如下所示：
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述PCM1-JAK2融合基因选自PCM1-JAK2E36/E9、PCM1-JAK2 E36/E7或PCM1-JAK2 E25/E9。
4.一种定量检测样本中PCM1-JAK2融合基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCRMix、检测用上游引物PCM1-JAK2-E36/E9-F、PCM1-JAK2-E25/E9-F，下游引物PCM1-JAK2-E36/E9-R、PCM1-JAK2-E36/E7-R、PCM1-JAK2-E25/E9-R，探针PCM1-E36-Probe和PCM1-E25-Probe以及内参基因Abl上游引物Abl-F、下游引物Abl-R和探针Abl-Probe，其中，
PCM1-JAK2-E36/E9-F：CCCTTTGCCGTTACGTTTACC
PCM1-JAK2-E25/E9-F：TACAACCTCAGTGGGACAAAGAA
PCM1-JAK2-E36/E9-R：TCCCACTCAGGTTGTACTCTTCA
PCM1-JAK2-E36/E7-R：TGATGTGCATCTGCAGTTAATCTATAA
PCM1-JAK2-E25/E9-R：GTGGACGAGATTCATTTTGTGAAATT
PCM1-E36-Probe：FAM-TCCTGAAAGCTCTCTGGCTGGAAGTCC-TAMRA
PCM1-E25-Probe：FAM-CTGGGAGTGATTTTTCCATGTTTGAAGCT-TAMRA
Abl-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本RNA提取液，所述样本RNA提取液包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PCM1-JAK2融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为去离子水。
8.如权利要求7所述的试剂盒，所述PCM1-JAK2融合基因选自PCM1-JAK2 E36/E9、PCM1-JAK2 E36/E7或PCM1-JAK2 E25/E9。
9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。
CN201711071291.3A 2017-11-03 2017-11-03 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸 Active CN107815494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711071291.3A CN107815494B (zh) 2017-11-03 2017-11-03 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711071291.3A CN107815494B (zh) 2017-11-03 2017-11-03 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107815494A CN107815494A (zh) 2018-03-20
CN107815494B true CN107815494B (zh) 2021-07-13

Family

ID=61604688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711071291.3A Active CN107815494B (zh) 2017-11-03 2017-11-03 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107815494B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699454A (zh) * 2019-10-25 2020-01-17 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN112608997A (zh) * 2020-12-17 2021-04-06 武汉艾迪康医学检验所有限公司 多重荧光pcr法技术筛查嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法、引物及探针和组合物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8163524B2 (en) * 1998-09-22 2012-04-24 Oncomedx, Inc. Comparative analysis of extracellular RNA species
US20090136942A1 (en) * 2007-09-18 2009-05-28 Oncomedx, Inc. Analysis of Extracellular RNA

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Andreas Reiter, et al..The t(8;9)(p22;p24) Is a Recurrent Abnormality in Chronic and Acute Leukemia that Fuses PCM1 to JAK2.《Cancer Res》.2005,第65卷(第7期),第2662-2667页. *
The t(8;9)(p22;p24) Is a Recurrent Abnormality in Chronic and Acute Leukemia that Fuses PCM1 to JAK2;Andreas Reiter, et al.;《Cancer Res》;20050401;第65卷(第7期);第2663页左栏倒数第1段-右栏1段、倒数第1段，第2664页左栏第1段，第2666页图2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107815494A (zh) 2018-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5421374B2 (ja) 悪性神経膠腫におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および他の遺伝子の遺伝子変化
CN108949990B (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
WO2016095093A1 (zh) 肿瘤筛查方法、目标区域变异检测方法和装置
CN105803088B (zh) 一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒
CN107663533A (zh) 一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用
CN104131091B (zh) 用于检测人类egfr基因突变的引物及方法
CN107815494B (zh) 检测pcm1-jak2相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸
CN110699454A (zh) 检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN110004229A (zh) 多基因作为egfr单克隆抗体类药物耐药标志物的应用
CN108728538B (zh) Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN110551821B (zh) 利用荧光定量pcr检测mef2d基因重排的引物和探针及试剂盒
CN108531598B (zh) Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN113025619B (zh) 一种hook3-fgfr1新融合基因及其应用和检测试剂盒
CN107365864A (zh) 检测brca1基因、brca2基因、palb2基因突变位点的试剂盒和方法
CN110656171A (zh) 小核仁核糖核酸snord33作为生物标记物用于制备检测试剂盒中的用途
CN114107350A (zh) 一种acot7-nphp4融合基因及其应用和检测试剂盒
CN112430648A (zh) 检测样本中etv6-runx1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN112592979A (zh) 一管式筛查肿瘤患者体内etv6-ntrk3融合基因的引物、探针和方法
CN109207595A (zh) 一种人egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法
CN107151699A (zh) 检测nup214‑abl1基因相对表达量的试剂盒和方法
CN110904233A (zh) 检测样本中abcg2基因相对表达量的寡核苷酸和方法
CN111363790A (zh) 用于检测jak2v617f突变的试剂盒
CN112553309A (zh) 筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因的引物、探针和方法
CN107287325A (zh) 检测bcr‑fgfr1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN112760378A (zh) 检测tpm3-ntrk1融合基因的引物、探针和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210615

Address after: 230088 1st, 2nd, 3rd and 5th floors, block B, information industry park, No.5 Tianzhu Road, high tech Zone, Hefei City, Anhui Province

Applicant after: HEFEI AIDIKANG MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.

Address before: No.208 Zhenzhong Road, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 310030

Applicant before: ADICON CLINICAL LABORATORIES CENTER, Inc.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant