CN104131091B - 用于检测人类egfr基因突变的引物及方法 - Google Patents

用于检测人类egfr基因突变的引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别是基因突变的检测。更具体而言，本发明公开了检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的9组引物及使用其进行检测的方法。

Description

用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法
技术领域
本发明涉及基因突变的检测，特别涉及检测表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其方法。
背景技术
表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于HER或ErbB受体家族的一员，该家族包括EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR也常被称作HER1或ErbB1。EGFR及其家族成员能够调控细胞分化、凋亡、细胞运动、新血管生成、浸润和转移等多项生理过程，同时在大部分的人类肿瘤中都有表达，因此EGFR已经被证明在众多肿瘤的发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。
EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(TyrosineKinase,TK)活性的受体，TK在EGFR的活性中发挥了关键作用。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者，进行EGFR基因突变检测。需要指出，检测EGFR基因突变并不能作为患者是否患癌的依据。在我国《NCCN:非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）》中只是明确提出了临床实践中EGFR-TKI治疗前需要针对EGFR编码区第18、19、20和21外显子的突变位点开展检测。确定患者是否携带有EGFR突变在一定程度上避免无效用药和社会经济资源的浪费。近年来，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EpidermalGrowthFactorReceptor-TyrosineKinaseInhibitor,EGFR-TKI)类药物（包括吉非替尼和厄洛替尼等）已经在非小细胞肺癌等肿瘤的特定患者的临床治疗中被证明效果显著(PaezJG,etal.Science.2004;304:1497-1500)。EGFR-TKI能够有效延长患者的生存期，但研究表明患者个体EGFR的第18、19、20和21号外显子的突变状态（尤其是19号外显子的插入缺失以及21号外显子L858R点突变最为常见）和疗效密切相关，占到突变总数的90%以上(ChanSKetal.EurJCancer42,1,2006,17-23)。因此，在引物设计时包含核心突变区的高频突变点和尽可能多的突变点，检测时将会最大程度上降低EGFR突变检测的假阴性。
目前，使用最多的临床基因突变检测方法是PCR测序法，PCR测序法是目前默认的“金标准”。其它常用的方法还包括PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、RealtimePCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR测序法敏感度较低，对低质量或含量较低的样本检测会产生较大的假阳性和假阴性。ARMS法能将突变检测的选择性提高到1%，但是对于质量低或含量低的DNA样品，这样的选择性依然偏低。另外，ARMS法依靠常规凝胶电泳或探针杂交来检测PCR产物，对于因样品含量较低导致扩增效率较低的突变产物，在电泳条带上可能不能显示。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量或半定量分析。本领域需要可高灵敏度和高选择性地进行突变检测的PCR技术。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明使用了一种加荧光并结合毛细管电泳的阻滞PCR技术方法(AMP-MDS)。
具体而言，本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步骤：
1)对于EGFR基因的41种突变（位于18、19、20和21号的外显子），对每一个点突变设计包括一对外引物和两个内引物的组合；对每一个缺失突变或者插入突变，设计一对外引物，其中所述两个内引物方向相向，3’端位于突变位置处，一个内引物的3’端和正常碱基互补，另一个内引物的3’端与突变位置的突变碱基互补；所述两个外引物分别和一个内引物可以配对进行PCR扩增，它们自身也可以进行配对扩增；所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的两个产物的长度差均须在5bp以上；在所述内引物3’端倒数5个碱基的区域引入错配，按照热力学稳定性高低相间的模式引入(低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对)；将荧光加在外引物的5’端，且使用不同颜色的荧光染料对两个内引物进行标记；
2)用步骤1）中的各组引物分别扩增来自待测样品的模板序列，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物1以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物2和产物3；对于插入突变或者缺失突变，得到长度有差异的两条产物；
3)将上述产物通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，在产物1、产物2和产物3均有峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。
在一个实施方案中，所述PCR方法还包括定量步骤：
4)进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
共41种突变
在本发明中，肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变具体详见表1。
表1肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变
*Cosmic(ForbesSAetal.NucleicAcidsRes.2011Jan;39:D945-50)数据库网址:http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/。
本领域技术人员可以理解，41种突变的检测有辅助用药和其他许多生物学意义，例如用于对进化、遗传和人口迁移的研究。还例如，对未知来源的血液或其他生物样品进行检测，以排除不需要的样品。
引物
41种突变按其突变类型可以分为三类，包括：点突变，插入突变和缺失突变。本申请中对于点突变包含一对外引物和一对内引物，对于缺失突变或者插入突变仅包含一对外引物。41种突变分9个试管进行，各管检测的突变及其引物见表2。
表2特异性引物
因此，本发明提供了上述9组引物，这些9组引物用于检测人类EGFR基因突变。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
1)用上述的9组引物扩增来自待测样品的模板序列；
2)使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。
在一个实施方案中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤：
3)进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
在一个实施方案中，本发明还提供了上述9组引物任一组或它们的任意组合，包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。所述引物组或组合用于进行相应突变的检测。所述检测例如下：
在一个实施方案中，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
1)用上述9组引物任一组或它们的任意组合扩增来自待测样品的模板序列，所述引物或组合包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组；
2)使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。
在一个实施方案中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤：
3)进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
在一个具体实施方案中，所述检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰引物的定量PCR方法包括待测样品处理和模板提取步骤。本方法还适用于甲醛固定石蜡包埋的样品、血浆或新鲜组织样品。因此，在一个实施方案中，本方法适用于的样品可以是手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液，或者是它们的任意组合。
反应体系
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法中的扩增用包括如下的PCR反应体系进行：PCR缓冲液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
在一个更具体的实施方案中，反应体系如下：
反应条件：
PCR反应条件为：
95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
在另外一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的9组引物。或者，所述试剂盒可以包括本发明的9组引物的任一组或它们的任意组合，所述引物或组合包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液。在一个更具体实施方案中，所述试剂盒还包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
本发明的有益效果是：本发明基于人工修饰引物的定量突变检测系统，建立了使用人工突变碱基引物的PCR反应体系，可以同时检测41种表皮生长因子受体EGFR的基因突变，此方法：
1)可同时检测EGFR基因的41种突变，包括点突变、插入突变和缺失突变，包含了EGFR绝大部分的高频突变；
2)选择性强，可检测至10-4极低含量的缺失突变DNA；
3)灵敏度高，可检测低至10拷贝的突变；
4)特异性高，有内外两对引物，且内引物添加有人工突变碱基，共同保证体系的高特异性；
5)可进行定量分析；
6)检测速度快，整个检测过程需要一个小时。
附图说明
图1：毛细管电泳检测L858的阳性和阴性结果对照示例图。
图2：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因L858R点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。
图3：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失/未缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果示例。
图4：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。
图5：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因T790M点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。
具体实施方式
本发明以人类肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变为主要检测对象，通过人工修饰引物的定量PCR检测方法，从而实现快速、准确且选择性高的突变检测。
本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其使用方法，主要包括四个主要步骤：
1)根据Cosmic数据库公布的人类EGFR基因的41种突变数据，为每一个点突变设计内、外两对引物；为每一个插入突变或缺失突变，设计一对外引物。
2)待测样品处理和模板提取。
3)PCR扩增。
4)PCR结果检测。
步骤1）中，针对Cosmic数据公布的人类EGFR基因的41种突变数据（见表1），设计了9组引物，用于进行突变的检测，详细的引物序列见表2。其中，为了降低结果的假阳性率，我们在内引物3’端最后五个碱基的区域人为引入了突变，有限度地降低了内引物3’端与模板结合的能力，引入突变的原则是最后5个碱基的区域的结合能力均匀降低，采取结合能力高低相间的方式进行。详细原则如下：
如果3’端错配具有一定的稳定性，那么在倒数第三位和第五位可以引入相应的错配；
如果3’端错配对稳定性具有较低的破坏性，那么则需要根据倒数第二个碱基对的稳定性进一步判断是否应该引入错配，引入错配的标准是尽量保证碱基对的稳定性高低错开，避免局部稳定性过强。其中，CG碱基对是高稳定性，AT碱基对以及所有错配均为低稳定性；
如果3’端错配对于稳定性具有较强的破坏性，那么不在倒数第三位引入错配，但当倒数第二位是具有较强稳定性的碱基对时例外；
例如，AGCGA/TCGCT，这一组引物，其热力学稳定性为：_---_（“_”代表低热力学稳定性，“-”代表高热力学稳定性），因此可以在倒数第三位引入错配，其热力学稳定性改为：_-_-_，同时将倒数第四位也引入错配作为备选引物，其热力学稳定性为：___-_。
步骤2），样品处理及模板提取。来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入甲苯充分浸泡2个小时，用75%酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5mlEP管中盖好盖。加入180μLATL缓冲液和20μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200μLAL缓冲液充分混匀，再加入200μL100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAampMinElutecolumn中，8000rpm离心2min，然后分别用500μlBufferAW1和500μlBufferAW2分别6000×g(8000rpm)离心1min洗脱，最后20000×g;14000rpm离心3min甩干，加入100μLATE20000×g;14000rpm离心1min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
步骤3），以步骤1）的引物进行PCR反应，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物；对于插入或缺失，将得到长度不同的两个产物。PCR反应的反应体系和反应条件如下：
反应体系
反应体系 反应条件
rTaq酶 2.5 μL
10×缓冲液 5 μL
dNTP-MIX 200 μmol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物 各1 μL
甲酰胺 1 μL
内引物（点突变） 各1 μL
水 补足体系
DMSO 1 μL
模板 1 μL
总体系 50 μL
反应条件：
PCR反应条件为：
95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
步骤4)PCR产物检测
将上述产物通过荧光毛细管电泳进行定量分析。所述定量分析具体为STR检测，即短串联重复序列(ShortTandemRepeat,STR)分析平台，用于测定样品间遗传物质差异（短串联重复序列差异）的一种技术手段。短串联重复序列(STR)检测短串联重复序列又称微卫星DNA(micro-satelliteDNA)。
具体步骤如下：
1)用ABIGS500LIZ与甲酰胺按1:13130的比例混合。
2)将混合液体取出9μL后，加入待测样品0.5μL。
3)在ABI3730测序仪上进行毛细管电泳检测，得到对应胶图及峰图。
下面结合本发明实施例及附图对本发明进行进一步的说明。
实施例一
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor)的21号外显子第858突变位点的基因突变。
实验材料如下：
试剂 厂商
rTaq酶 TAKARA(宝生物)公司
10×缓冲液 TAKARA(宝生物)公司
dNTP-MIX TAKARA(宝生物)公司
MgCl2 TAKARA(宝生物)公司
引物合成 北京擎科新业生物技术有限公司
甲酰胺 美国SIGMA公司
DMSO 美国SIGMA公司
蛋白酶K QIAGEN公司
QIAamp MinElute柱 QIAGEN公司
AW1、AW2、ATL等 QIAGEN公司
样品和对照标准品制备过程如下：
1.检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5mlEP管中盖好盖。加入180μLATL缓冲液和20μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200μLAL缓冲液充分混匀，再加入200μL100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAampMinElutecolumn中，8000rpm离心2min，然后分别用500μlBufferAW1和500μlBufferAW2分别6000×g(8000rpm)离心1min洗脱，最后20000×g;14000rpm离心3min甩干，加入100μLATE20000×g;14000rpm离心1min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因21号外显子第858突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO.31：
5-GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCTttccattctttggatcagtagtcactaacgttcgccagccataagtcctcgacgtggagaggctcagagcctGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCKGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCT-3，其中K为T（野生型）或G（突变）
3.引物设计
CGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTT（SEQIDNO.25L858R_IN_FP）
CTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCTC（SEQIDNO.26L858R_IN_RP）
GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCT（SEQIDNO.23L858R_OUT_FP）
AGCCACCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCA（SEQIDNO.24；L858R_OUT_RP）
4.PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系 反应条件
rTaq酶 2.5 μL
10×缓冲液 5 μL
dNTP-MIX 200 μmol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物 各1 μL
甲酰胺 1 μL
内引物各 1 μL
水 补足体系
DMSO 1 μL
模板 1 μL
总体系 50 μL
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5.检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图1为检测结果示例。
6.灵敏度和选择性实验
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000（即以下所示的1:X）的量比进行混合，且使混合后总体积为100μL。根据浓度计算所需体积，过程如下：
C1V1:C2V2=1:X；
V1+V2=100；
综合以上二方程得出V1=200C2/(XC1+C2)，V2=100-V1。
已测得各样品浓度为C1=33ng/μL，C2=41.95ng/μL。
用Excel软件自动计算出各X对应下的V1和V2。得到1至7号新样品。
混比 X V1 V2 送测编号
1原样 100 0 1
2原样 0 100 2
50.00% 1 55.97 44.03 3
20.00% 4 24.12 75.88 4
1.96% 50 2.4794 97.521 5
0.20% 500 0.2536 99.746 6
0.02% 5000 0.02542 99.975 7
荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图2）结果显示，本发明方法的灵敏度较高，检测选择性可达0.02%。
7.重复性和准确率
1)标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
2)选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。
8.检测优势比较
我们选取了10例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法、AMRS法以及AMP-MDS法进行EGFR基因的L858R突变检测并进行比较，比较结果参见表3。可见AMP-MDS法的准确率最高，达到100%，假阳性率大大优于ARMS法，假阴性率大大优于PCR测序法。
表310例肺癌患者EGFR的L858R突变检测结果比较
病理号 PCR测序法 ARMS法 AMP-MDS法 临床用药后病理进程
74673 阳性 阳性 阳性 PR
74330 阳性 阳性 阳性 PR
75674 阳性 阳性 阳性 PR
111950 阳性 阳性 阳性 PR
80404 阳性 阳性 阳性 PR
72818 阴性 阳性 阳性 PR
73090 阴性 阳性 阳性 PR
71334 阴性 阳性 阳性 PR
73729 阴性 阳性 阴性 PD
74238 阴性 阳性 阴性 PD
注：CR：完全缓解，PR：部分缓解，SD：稳定，PD：进展。
实施例二
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的缺失进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor)的19号外显子E746(2235-2249DEL15)点的基因缺失。
实验材料如下：
试剂 厂商
rTaq酶 TAKARA(宝生物)公司
10×缓冲液 TAKARA(宝生物)公司
dNTP-MIX TAKARA(宝生物)公司
MgCl2 TAKARA(宝生物)公司
引物合成 北京擎科新业生物技术有限公司
甲酰胺 美国SIGMA公司
DMSO 美国SIGMA公司
蛋白酶K QIAGEN公司
QIAamp MinElute柱 QIAGEN公司
AW1、AW2、ATL等 QIAGEN公司
样品和对照标准品制备过程如下：
1.检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5mlEP管中盖好盖。加入180μLATL缓冲液和20μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200μLAL缓冲液充分混匀，再加入200μL100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAampMinElutecolumn中，8000rpm离心2min，然后分别用500μlBufferAW1和500μlBufferAW2分别6000×g(8000rpm)离心1min洗脱，最后20000×g;14000rpm离心3min甩干，加入100μLATE20000×g;14000rpm离心1min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因19号外显子E746(2235-2249DEL15)位点基因野生型和缺失基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO.32（野生型）：
5’-CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCT
CACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATG
SEQIDNO.33（缺失型）：
5’-CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCT
CACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAACAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATG
3.引物设计
TGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGT(SEQIDNO.11:Ex19-del_OUT_FP)
GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGT(SEQIDNO.12:Ex19-del_OUT_RP)
4.PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系 反应条件
rTaq酶 2.5 μL
10×缓冲液 5 μL
dNTP-MIX 200 μmol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物 各1 μL
甲酰胺 1 μL
内引物各 1 μL
DMSO 1 μL
模板 1 μL
水 补足体系
总体系 50 μL
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，65℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5.检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图3为检测结果示例。
6.选择性和灵敏度实验
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000（即以下所示的1:X）的量比进行混合，且使混合后总体积为100μL。根据浓度计算所需体积，过程如下：
C1V1:C2V2=1:X；
V1+V2=100；
综合以上二方程得出V1=200C2/(XC1+C2)，V2=100-V1。
已测得各样品浓度为C1=35.2ng/μL，C2=36.6ng/μL。
用Excel软件自动计算出各X对应下的V1和V2。得到1至7号新样品。
混比 X V1 V2 送测编号
1原样 100 0 1
2原样 0 100 2
50.00% 1 50.97 49.03 3
20.00% 4 20.53 79.37 4
1.96% 50 2.0372 97.96 5
0.20% 500 0.2075 99.79 6
0.02% 5000 0.02079 99.98 7
荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图4）显示本发明的方法的选择性检测能力在0.02%以上，检出灵敏度非常高。
7.重复性和准确率
1)标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
2)选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。
8.检测优势比较
我们选取了100例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法以及我们的AMP-MDS法进行EGFR基因的19外显子缺失检测并进行比较，比较结果参见下表4。
表4100例肺癌患者EGFR的19外显子缺失检测结果比较
检测方法 阳性检出例数 检出率
本发明的方法 5 5%
PCR测序法 2 2%
实施例三
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor)的20号外显子T790M突变位点的基因突变。
实验材料如下：
试剂 厂商
rTaq酶 TAKARA(宝生物)公司
10×缓冲液 TAKARA(宝生物)公司
dNTP-MIX TAKARA(宝生物)公司
MgCl2 TAKARA(宝生物)公司
引物合成 北京擎科新业生物技术有限公司
甲酰胺 美国SIGMA公司
DMSO 美国SIGMA公司
蛋白酶K QIAGEN公司
QIAamp MinElute柱 QIAGEN公司
AW1、AW2、ATL等 QIAGEN公司
样品和对照标准品制备过程如下：
1.检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用75%酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5mlEP管中盖好盖。加入180μLATL缓冲液和20μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200μLAL缓冲液充分混匀，再加入200μL100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAampMinElutecolumn中，8000rpm离心2min，然后分别用500μlBufferAW1和500μlBufferAW2分别6000×g(8000rpm)离心1min洗脱，最后20000×g;14000rpm离心3min甩干，加入100μLATE20000×g;14000rpm离心1min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因20号外显子第T790M突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO.34：
5-aGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCAKGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGgtaatcagggaagggagatacggggaggggagatAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGC-3，其中K为C（野生型）或A（突变）
3.引物设计
AGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAAC(SEQIDNO.17；T790M_OUT_FP)
GCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATC(SEQIDNO.18；T790M_OUT_RP)
CTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATAAC(SEQIDNO.19；T790M_IN_FP)
CAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTTCA(SEQIDNO.20；T790M_IN_RP)
4.PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系 反应条件
rTaq酶 2.5 μL
10×缓冲液 5 μL
dNTP-MIX 200 μmol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物 各1 μL
甲酰胺 1 μL
内引物各 1 μL
DMSO 1 μL
模板 1 μL
水 补足体系
总体系 50 μL
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5.检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。
6.灵敏度与选择性实验。
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000的量比进行混合，得到1至8号新样品。
序号 模板 MA CC VT CA Vc
1 未突变片断790-C-C 0.0000 34 20 35.8 0
2 突变片断790-C-A 1.0000 34 0 35.8 20
3 50%突变片断 0.5000 34 10.25788 35.8 9.7421203
4 20%突变片断 0.2000 34 5.927152 3.58 14.072848
5 10%突变片断 0.1000 34 9.731199 3.58 10.268801
6 2%突变片断 0.0200 34 6.806876 0.358 13.193124
7 0.2%突变片断 0.0020 34 6.888837 0.0358 13.111163
8 0.02%突变片断 0.0002 34 6.896977 0.00358 13.103023
MA：混合液体中突变片断的含量
CC：合成的未突变片断溶液浓度%；
VT：加入混合待测样本溶液的合成未突变片断溶液体积μL；
CA：合成的突变片断溶液浓度%；
Vc：加入混合待测样本溶液的合成突变片断溶液体积μL.
本发明检测结果（图5）显示，其选择性检测能力在0.02%以上，检出灵敏度非常高。
7.重复性和准确率
标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
8.检测优势
1)本方法通过基于PCR的技术检测突变，具有很高的灵敏度，低至5-10个拷贝即可准确检测。
2)本方法通过在引物3’端5个碱基的区域引入一个或者一个以上的人工突变，一方面保证了DNA聚合酶结合的稳定性，另外一个方面又极大的提高了选择性。
3)通过在引物5’端加荧光以及通过荧光毛细管电泳来检测PCR产物，来进一步提高选择性，总体选择性在10-4-10-5之间。
4)本方法设计的外引物位于内含子区域，通过在引物5’端添加荧光染料、避免引入额外的探针，进一步增加了特异性，降低了假阳性率。
5)本方法结合荧光毛细管电泳技术，可实现对样品突变的定量分析。
6)本方法过程简单，仅包含两步，即PCR过程和毛细管电泳，因此检测速度快，整个过程仅需不到1小时。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>思博奥科生物信息科技(北京)有限公司
<120>用于检测人类EGFR基因突变的引物及其用法
<130>20140611
<160>33
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ttgtggagcctcttacacccagtggagaag30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atatacagcttgcaaggactctgggctccc30
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgcggg32
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cttatacaccgtgccgaacgcaccggacct30
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgccgg32
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cttatacaccgtgccgaacgcaccggaaca30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atttgtccttccaaatgagctggcaagtgc30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aatatacagcttgcaaggactctgggctcc30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
aactgaattcaaaaagatcaaagtgctagg30
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cttatacaccgtgccgaacgcaccggggg29
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgtggcaccatctcacaattgccagt26
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ggatttccttgttggctttcggagatgt28
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
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gtcacttcacagccctgcgtaaacgtccct30
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<211>30
<212>DNA
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<400>14
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<211>30
<212>DNA
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<400>15
ctccctccaggaagcctacgtgatggctag30
<210>16
<211>23
<212>DNA
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<400>16
gcacacgtgggggttgtccatga23
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<212>DNA
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aggaagcctacgtgatggccagcgtggacaac32
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<400>18
gcagaccgcatgtgaggatcctggctccttatc33
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<211>30
<212>DNA
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<400>19
ctgcctcacctccaccgtgcagctcataac30
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<211>29
<212>DNA
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<400>20
caggaggcagccgaagggcatgagcttca29
<210>21
<211>26
<212>DNA
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<400>21
tgtcacttcacagccctgcgtaaacg26
<210>22
<211>26
<212>DNA
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<400>22
gatctgcacacaccagttgagcaggt26
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<211>30
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<400>23
gcagcgggttacatcttctttcatgcgcct30
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<211>30
<212>DNA
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<400>24
agccacctccttactttgcctccttctgca30
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<211>31
<212>DNA
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<400>25
cgcagcatgtcaagatcacagattttgggtt31
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
ctttctcttccgcacccagcagtttggctc30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ttggatcagtagtcactaacgttcgccagc30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
aaagccacctccttactttgcctccttctg30
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
caagatcacagattttgggctggccaagct30
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
catggtattctttctcttccgcacccaact30
<210>31
<211>272
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(256)..(256)
<223>K为T（野生型）或G（突变）
<400>31
gcagcgggttacatcttctttcatgcgcctttccattctttggatcagtagtcactaacg60
ttcgccagccataagtcctcgacgtggagaggctcagagcctggcatgaactacttggag120
gaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcag180
catgtcaagatcacagattttgggckggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaatac240
catgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggct272
<210>32
<211>430
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(252)..(252)
<223>K为GGAATTAAGAGAAG（野生型）或无（突变）
<400>32
cccagcaatatcagccttaggtgcggctccacagccccagtgtccctcaccttcggggtg60
catcgctggtaacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgcc120
agttaacgtcttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagt180
taaaattcccgtcgctatcaakcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtg240
agtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcat300
gtctggcagctgctctgctctagaccctgctcatctccacatcctaaatgttcactttct360
atgtctttccctttctagctctagtgggtataactccctccccttagagacagcactggc420
ctctcccatg430
<210>33
<211>251
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(105)..(105)
<223>K为C（野生型）或A（突变）
<400>33
agaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctg60
cctcacctccaccgtgcagctcatcakgcagctcatgcccttcggctgcctcctggacta120
tgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagat180
cgcaaaggtaatcagggaagggagatacggggaggggagataaggagccaggatcctcac240
atgcggtctgc251

Claims (9)

1.用于非疾病诊断与治疗的检测人类EGFR基因突变的引物，包括下列9组引物：
(1)G719S_OUT_FP:SEQIDNO.1、
G719S_OUT_RP:SEQIDNO.2、
G719S_IN_FP:SEQIDNO.3、
G719S_IN_RP:SEQIDNO.4；
(2)G719C_OUT_FP:SEQIDNO.1、
G719C_OUT_RP:SEQIDNO.2、
G719C_IN_FP:SEQIDNO.5、
G719C_IN_RP:SEQIDNO.6；
(3)G719A_OUT_FP:SEQIDNO.7、
G719A_OUT_RP:SEQIDNO.8、
G719A_IN_FP:SEQIDNO.9、
G719A_IN_RP:SEQIDNO.10；
(4)Ex19-del_OUT_FP:SEQIDNO.11、
Ex19-del_OUT_RP:SEQIDNO.12；
(5)S768I_OUT_FP:SEQIDNO.13、
S768I_OUT_RP:SEQIDNO.14、
S768I_IN_FP:SEQIDNO.15、
S768I_IN_RP:SEQIDNO.16；
(6)T790M_OUT_FP:SEQIDNO.17、
T790M_OUT_RP:SEQIDNO.18、
T790M_IN_FP:SEQIDNO.19、
T790M_IN_RP:SEQIDNO.20；
(7)Ex20-ins_OUT_FP:SEQIDNO.21、
Ex20-ins_OUT_RP:SEQIDNO.22；
(8)L858R_OUT_FP:SEQIDNO.23、
L858R_OUT_RP:SEQIDNO.24、
L858R_IN_FP:SEQIDNO.25、
L858R_IN_RP:SEQIDNO.26；
(9)L861Q_OUT_FP:SEQIDNO.27、
L861Q_OUT_RP:SEQIDNO.28、
L861Q_IN_FP:SEQIDNO.29、
L861Q_IN_RP:SEQIDNO.30。
2.用于非疾病诊断与治疗的检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
1)用权利要求1所述的9组引物扩增来自待测样品的模板；
2)使用荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。
3.如权利要求2所述的方法，还包括步骤：进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤1所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
5.如权利要求4所述的方法，其中扩增用包括如下的PCR反应体系进行：
PCR缓冲液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
6.如权利要求5所述的方法，其中用于扩增的PCR反应体系包括：
PCR缓冲液
rTaq酶2.5μL
10×缓冲液5μL
dNTP-MIX200μmol/L
MgCl21.5-2.0mmol/L
外引物各1μL
甲酰胺1μL。
7.一种试剂盒，包括：权利要求1所述的9组引物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，还包括PCR反应缓冲液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，还包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
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