CN112553337A - 一种基于数字pcr技术检测erbb2基因扩增的方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子诊断技术领域，特别是涉及一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试剂盒，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述预混液中包括：检测ERBB2基因的上下游引物、检测ERBB2基因的荧光探针、检测人ATCB内参基因的上下游引物、检测人ATCB内参基因的荧光探针；所述方法包括以下步骤：S1、提供被测者的检测样本，所述的检测样本为血浆样本；S2、从S1中血浆样本中，提取待测样本的ctDNA；S3、使用数字PCR平台对S2中提取样本进行扩增反应；S4、对扩增结果进行分析与判读；本发明提供的ERBB2基因扩增检测方法，是基于微液滴数字PCR检测系统，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。

Description

一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试 剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，特别是涉及一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试剂盒。

背景技术

酪氨酸激酶受体ERBB2(又名ERBB2/NEU)基因，编码185kDa的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是EGFR家族成员之一。ERBB2基因的扩增或过度表达会导致细胞过度增殖而形成肿瘤。研究显示，大约25％～30％的浸润性乳腺癌和80％的胃癌患者均有ERBB2基因扩增或蛋白过表达。

ERBB2扩增或许可用于预测机体对ERBB2靶向治疗药物的敏感度，这类药物包括拉帕提尼、曲妥珠单抗、帕托珠单抗、T-DM1等。以最早使用也是最成功的曲妥珠单抗(赫赛汀)为例，临床研究表明，赫赛汀可显著延长ERBB2阳性乳腺癌患者的PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)。赫赛汀联合化疗能将肿瘤的复发风险降低52％，将患者的死亡风险降低33％。此外，对于ERBB2表达阳性、无法手术切除的局部晚期、复发或转移的胃癌患者，接受曲妥珠单抗联合化疗的治疗效果显著优于单纯治疗。因此，准确判断ERBB2基因扩增状态对乳腺癌、胃癌等患者的预后判断及优化治疗方案均具有重要作用。

现阶段国内外一般采用免疫组织化学(IHC)法检测ERBB2蛋白的表达水平，采用荧光原位杂交(FISH)法检测ERBB2基因扩增水平。IHC具有成本低、技术简单、便于操作等特点，常是临床检测的首选方法。但IHC容易受到组织影响、缺乏标准化，结果判断存在主观差异，造成不同实验室之间的IHC检测结果可能存在差异。FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性较高，是目前ERBB2检测的金标准。但FISH存在价格昂贵、检测周期长、患者收费高、检测者专业知识和实验室条件的限制，不利于广泛应用。此外利用IHC/FISH方法无法对患者体内肿瘤细胞的ERBB2基因状态进行实时、动态的监测，来了解患者病情发展及治疗过程中ERBB2基因状态的变化情况。因此急需一种高灵敏度、准确度、易于操作标准化、多样化检测等优势检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒及其文库构建方法，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述预混液中包括：检测ERBB2基因的上下游引物、检测ERBB2基因的荧光探针、检测人ATCB内参基因的上下游引物、检测人ATCB内参基因的荧光探针；

所述检测ERBB2基因的上下游引物、探针包括如下序列：

上游引物：5'-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3'SEQ ID NO:2；

探针：5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'SEQ ID NO:3；

所述检测ATCB内参基因的上下游引物、探针包括如下序列：

上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:4；

下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:5；

探针：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:6

优选地，所述检测ERBB2基因和ACTB内参基因的上游引物和下游引物的工作浓度为900nM；

优选地，所述检测ERBB2基因和ACTB内参基因的荧光探针的工作浓度为250nM。

优选地，所述ERBB2基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和ATCB内参基因的探针SEQID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团。

优选地，MET基因扩增区域的所述探针SEQ ID No.3和ATCB内参基因的所述探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立地结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团；

本发明中，探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，MGB修饰基团和淬灭基团；探针上连接的MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高

优选地，所述的ERBB2基因探针标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ。

优选地，所述的ATCB内参基因探针标记的荧光基团为VIC；淬灭基团为NFQ。

优选地，所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列为N_1-8 CTTCAGCTTCCCGATTACGG U_2-12GCACGATCCGACGGTAGTGTN_9-16，其中U_2-12表示连接序列。

11.一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法，使用所述试剂盒进行PCR检测，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提供被测者的检测样本，所述的检测样本为血浆样本；

S2、从S1中血浆样本中，提取待测样本的ctDNA；

S3、使用数字PCR平台对S2中提取样本进行扩增反应；

S4、对扩增结果进行分析与判读。

进一步的，所述步骤S2具体操作如下：本发明适用样本类型为患者全血样本，通过QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒，提取cfDNA作为ddPCR检测的模板。

进一步的，所述S3中PCR对反应预混液进行如下扩增反应：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，57℃退火/延伸1分钟，共进行45个循环，10℃保持；

本发明中，步骤S3按照如下表1配方配置PCR反应预混液：

表1

试剂	用量
		2×ddPCR Master Mix	10μL
cfDNA模板	1μL
		各条引物	400nM
各探针	500nM
		补DEPC水至	20μL

并且，本发明中，所述步骤S4中对扩增结果进行分析与判读的具体操作如下：

1)如果ERBB2基因和ATCB内参基因检测拷贝数至少一项小于1×10拷贝/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；

2)如果ERBB2基因和ATCB内参基因检测拷贝数均在1×102拷贝/μL到1×105拷贝/μL之间，直接进行如下计算：其中，比值M＝ERBB2基因拷贝数/ATCB内参基因拷贝数；当M≥3.0，则结果判读为：ERBB2基因扩增；当M<3.0,则结果判读为：无ERBB2基因扩增；

3)如果ERBB2基因和ATCB内参基因检测拷贝数至少一项大于1X105拷贝/μL，则需将待测样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的ERBB2基因扩增检测方法，是基于微液滴数字PCR检测系统，上样后全自动检测，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。

2)本方法使用自主涉及的引物探针组合，特异性高，检测效果好，特别是对血液这样本身DNA含量较低的样品，检测结果与肿瘤组织DNA结果具有高度一致性。

3)与目前同类检测产品相比，具体优势如下：与实时荧光定量PCR相比，可以进行绝对定量，且检测下限明显低于荧光定量PCR。

附图说明

图1为本发明的样本B的ddPCR具体扩增结果；

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

利用ddPCR技术检测胃癌患者血浆样品的ERBB2基因扩增。

1、微液滴数字PCR检测的步骤如下：

1)准备样品：样品DNA来源是胃癌患者的血液样品。可将DNA样品进行适当的稀释，保证样品信号拷贝数在1×102拷贝/μL到1×105拷贝/μL之间。

2)按照以下配比配置PCR反应液：2×ddPCR Master Mix、引物、探针、1μL cfDNA模板，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配置成数字PCR混合液，其中每条引物含量分别为400nM，每条探针分别为500nM，cfDNA模板为1-10ng/μL。

3)将配制好的20μL数字PCR反应液加载到芯片上。

4)将芯片放入PCR仪中，按照以下条件进行扩增反应：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，57℃退火/延伸1分钟，共进行45个循环，10℃保持。

5)PCR扩增完成后将芯片转移到QX100微滴分析仪(Bio-Rad Laboratories,USA)对所有样品孔进行荧光检测，样本B具体扩增结果见图1。

结果分析见表2：

表2

样本编号	M值(ERBB2拷贝数/ATCB拷贝数)
		A	3.26(179.5/55)
B	2.23(174/78)

2.根据以上比值判断，样本1的M值大于3.0，判断该患者存在ERBB2基因扩增；样本2的M值小于3.0，判断该患者无ERBB2基因扩增。

实施例2

1、基于ddPCR技术比较胃癌患者血浆ctDNA和肿瘤组织DNA的ERBB2基因扩增的一致性。

本实施例2对胃癌患者的血浆ctDNA和石蜡包埋组织DNA进行ERBB2基因扩增检测，血浆ctDNA的提取方法参照实施例1所述内容，石蜡包埋组织DNA按照Qiagen DNeasy Bloodand Tissue Kit(Cat.No 69504)，按照试剂盒说明书进行操作，最后收集到50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。

2、ddPCR扩增体系、扩增条件参照实施例1中所述内容，使用微液滴数字PCR平台进行扩增，同时及利用FISH对石蜡包埋组织样本进行检测。本实验中FISH检测试剂购于雅培Vysis，实验操作参照说明书进行。

3、下表3列出对血浆ctDNA和石蜡包埋组织样本的ERBB2与ACTB内参基因的拷贝数关系以及荧光原位杂交的检测结果，表中可以看出，本发明中同一患者的血浆ctDNA和石蜡包埋样本DNA的ERBB2基因与ACTB内参基因的比例一致，并且与FISH方法的结果一致。

表3

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物探针预混液，所述预混液中包括：检测ERBB2基因的上下游引物、检测ERBB2基因的荧光探针、检测人ATCB内参基因的上下游引物、检测人ATCB内参基因的荧光探针；

所述检测ERBB2基因的上下游引物、探针包括如下序列：

上游引物：5'-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3'SEQ ID NO:2；

探针：5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'SEQ ID NO:3；

所述检测ATCB内参基因的上下游引物、探针包括如下序列：

上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:4；

下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:5；

探针：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:6。

2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于：所述检测ERBB2基因和ACTB内参基因的上游引物和下游引物的工作浓度为900nM。

3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述检测ERBB2基因和ACTB内参基因的荧光探针的工作浓度为250nM。

4.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述ERBB2基因扩增区域的探针SEQ ID No.3和ATCB内参基因的探针SEQ ID NO.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于，MET基因扩增区域的所述探针SEQ ID No.3和ATCB内参基因的所述探针SEQ ID NO.6的3'端均可独立地结合MGB修饰基团后再结合淬灭基团。

6.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述的ERBB2基因探针标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ。

7.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述的ATCB内参基因探针标记的荧光基团为VIC；淬灭基团为NFQ。

8.一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法，使用所述试剂盒进行PCR检测，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提供被测者的检测样本，所述的检测样本为血浆样本；

S2、从S1中血浆样本中，提取待测样本的ctDNA；

S3、使用数字PCR平台对S2中提取样本进行扩增反应；

S4、对扩增结果进行分析与判读。

9.根据权利要求18所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法，其特征在于，所述步骤S2具体操作如下：本发明适用样本类型为患者全血样本，通过QIAampCirculating Nuleacid Kit试剂盒，提取cfDNA作为ddPCR检测的模板。

10.根据权利要求8所述的一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法，其特征在于，所述S3中PCR对反应预混液进行如下扩增反应：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，57℃退火/延伸1分钟，共进行45个循环，10℃保持。

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