JP2018504906A - Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断用マーカとする使用 - Google Patents
Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断用マーカとする使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、メチル化部位を疾患診断用マーカとする使用に関するものであり、具体的には、Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断マーカとしての使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、疾患に関連する染色体のメチル化部位をスクリーニングする方法及びその基準を確立すると共に、前立腺ガンを例として、前立腺ガンの診断に関連する６つのＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングした。スクリーニングされたＹ染色体のメチル化部位を、前立腺ガンの診断マーカとして疾患の早期、迅速な診断に使用することができる。
Description
本発明は、メチル化部位を疾患診断用マーカとする使用に関し、特に、Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガン診断用マーカとする使用に関する。
ＤＮＡメチル化は、通常よく知られたエピジェネティク修飾であり、ＤＮＡメチル基転移酵素による触媒作用下、Ｓ−アデノシルメチオニンにより提供されるメチル基を用いて、シトシンの第５位の炭素原子をメチル化することで、シトシンを５−メチルシトシンに変換し、遺伝子の発現制御に対して重要な役割を有するものである。
ガンは、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の成長増殖メカニズムの制御に異常が発生することにより発生する疾患である。正常の場合、細胞の成長増殖は、ガン遺伝子及びガン抑制遺伝子を含む、いくつかの成長発育を制御する遺伝子により厳密に制御され、正常の生理状態が維持されている。しかしながら、輻射、化学汚染、ウィルス感染及び内分泌失調等の多くの要因により、体内におけるガン遺伝子の活発化及びガン抑制遺伝子の失活をもたらし、その結果、ガンの発生に至る。遺伝子変異のほか、例えば、ヒストン修飾、ＤＮＡメチル化等の異常調節等のエピジェネティクスも、腫瘍の発生過程において、重要な役割を果たし、多くのガンにおいて、表現型修飾の異常が発見されている。すなわち、腫瘍の発生は、極めて複雑な過程であり、体内のガン遺伝子、ガン抑制遺伝子及び表現型修飾等において制御が異常になり、その異常が蓄積した結果である。
ＤＮＡメチル化は、ガンの発生に密に関係している。多くのガンにおいて、ＤＮＡメチル化の異常現象が存在していることが発見されている。ＤＮＡメチル化は、ある程度に安定しており、ガン発生の初期イベントである。近年、多くの研究により、ＤＮＡメチル化の異常は、ガン診断のバイオマーカとして使用できることが証明されている。現在、多くの特異的遺伝子プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化の異常は、前立腺ガン診断用の潜在的なマーカとして用いられている。
現在、前立腺ガンの主要な診断方法は、直腸診断、血清ＰＳＡ検査、免疫組織染色法等であり、ここで、免疫組織染色法は、前立腺ガンのキー診断法である。しかしながら、当該方法では、患者の前立腺組織を採取する必要があるため、患者に大きな苦痛をもたらし、初期診断法に適するものと言えない。ＰＳＡは、前立腺ガンの初期診断に用いられるマーカではあるが、検査の精度が十分ではなく、検査に適さない範囲も存在する。よって、前立腺ガンの早期診断において、簡便で正確な診断用マーカの開発は、非常に緊迫した課題となっている。
また、従来技術として、ＤＮＡメチル化に関する各種検出方法が知られている。例えば、中国特許出願公開公報第１０４０６２３３４号（特許文献１）には、ＤＮＡメチル化検出の定量分析法が開示されている。また、例えばＤＮＡメチル化のチップ技術もある。しかしながら、現段階では、メチル化が異常であるか否かを判断するために、比較的正確性のあり、かつ統一された基準はまだ存在しておらず、特定の部位のメチル化度の変化に基づき、ガンを罹患するリスクについて早期に予測することができない。
本発明の発明者は、統一され、且つ標準となる、疾患と関連するメチル化部位のスクリーニング方法を創出すると共に、前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングした。これにより、本発明が創出された。
本発明に係る第１態様は、受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する試薬の、試薬キットにおける使用であって、前記試薬キットは、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価、及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングからなる群から選択される一つ又は複数の用途に使用され、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である使用に関する。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、尿液（例えば前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される。
いくつかの実施形態において、前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される。
いくつかの実施形態において、前記試薬は、オリゴヌクレオチドプライマであり、前記オリゴヌクレオチドプライマは、Ｙ染色体のメチル化部位を含有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される。
本発明に係る第２態様は、受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する試薬を含む試薬キットであって、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価、及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングからなる群から選択される一つ又は複数の用途に使用され、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である試薬キットに関する。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ｙ染色体のメチル部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される。
いくつかの実施形態において、前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される。
いくつかの実施形態において、前記試薬は、オリゴヌクレオチドプライマであり、前記オリゴヌクレオチドプライマは、Ｙ染色体のメチル化部位を含有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される。
本発明に係る第３態様は、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングの方法であって、前記方法は、受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出するステップを含み、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である。
いくつかの実施形態において、正常サンプル又は正常参照値と比較し、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数のメチル化部位のメチル化度が低下した場合に、受検者が前立腺ガンを罹患し、又は受検者が前立腺ガンを罹患するリスクが高いことが示され、あるいは正常サンプル又は正常参照値と比較し、メチル化部位ｃｇ０５１６３７０９のメチル化度が増大した場合に、受検者が前立腺ガンを罹患し、又は受検者が前立腺ガンを罹患するリスクが高いことが示される。
いくつかの実施形態において、治療前又はスクリーニングされた薬剤の使用前と比較し、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数のメチル化部位のメチル化度が増大した場合に、受検者の治療が有効、又はスクリーニングに使用された薬剤が有効であることが示され、あるいは治療前又はスクリーニングされた薬剤の使用前と比較し、メチル化部位ｃｇ０５１６３７０９のメチル化度が低下した場合に、受検者の治療が有効、又はスクリーニングに使用された薬剤が有効であることが示される。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記検出されるサンプルは、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される。
いくつかの実施形態において、前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される。
いくつかの実施形態において、前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、オリゴヌクレオチドプライマを使用するステップを含み、前記オリゴヌクレオチドプライマがＹ染色体のメチル化部位を有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される。
本発明に係る第４態様は、Ｙ染色体のメチル化部位をバイオマーカとして、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングに使用される、使用であって、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である使用に関する。
いくつかの実施形態において、これらＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出することにより、立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングを行うことができる。
本発明に係る第５態様は、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングに使用されるバイオマーカであって、前記バイオマーカは、Ｙ染色体のメチル化部位であり、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数であるバイオマーカに関する。
いくつかの実施形態において、これらＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出することにより、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングを行うことができる。
本発明に係る第６態様は、疾患に関連する染色体のメチル化部位をスクリーニングする方法であって、（１）患者の疾患サンプルと正常サンプルを取得するステップ、（２）疾患サンプルと正常サンプルとの染色体のメチル化情報を特定するステップ、（３）正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、メチル化保存部位をスクリーニングするステップ、（４）疾患サンプル及び正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、疾患サンプルのうち、正常サンプルと比較して、有意な差のあるメチル化部位をスクリーニングするステップ、及び、（５）ステップ（３）の結果とステップ（４）の結果とを組み合わせることで、有意な差のあるメチル化保存部位、即ち、疾患に関連する染色体のメチル化部位を得るステップを含む方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記疾患はガンであり、例えば前立腺ガンである。
いくつかの実施形態において、前記染色体は常染色体又は性染色体（例えばＹ染色体）である。
いくつかの実施形態において、前記サンプルは組織（例えばガン組織）、血液、尿液、糞便又は組織液（例えば前立腺ガン液）に由来する。
いくつかの実施形態において、前記メチル化保存部位は、正常サンプルにおけるメチル化度の標準偏差ＳＤ値が０．２５以下であるメチル化部位である。
いくつかの実施形態において、前記有意な差のあるメチル化部位は、疾患サンプルと正常サンプルとを比較するとき、メチル化度の変化が０．２以上であり、且つｐ値及びｑ値がいずれも０．０１以下である部位であり、前記変化は、増大又は低下である。
また、本発明は、前立腺ガンを診断する方法であって、前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングするステップを含む方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングするステップは、（１）前立腺ガン患者の疾患サンプルと正常サンプルとを取得するステップ、（２）疾患サンプルと正常サンプルとのＹ染色体メチル化情報を特定するステップ、（３）正常サンプルのＹ染色体メチル化情報に基づき、メチル化保存部位をスクリーニングするステップ、（４）疾患サンプル及び正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、疾患サンプルのうち、正常サンプルと比較して、有意な差のあるメチル化部位をスクリーニングするステップ、及び、（５）ステップ（３）の結果とステップ（４）の結果とを組み合わせることで、有意な差のあるメチル化保存部位、即ち、前立腺ガンと関連する染色体のメチル化部位を取得することを含む。
いくつかの実施形態において、前記前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングするステップは、（１）前立腺ガン患者の疾患サンプルと正常サンプルとを取得するステップ、（２）疾患サンプルと正常サンプルとのＹ染色体メチル化情報を特定するステップ、（３）正常サンプルのＹ染色体メチル化情報に基づき、メチル化保存部位をスクリーニングするステップ、（４）疾患サンプル及び正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、疾患サンプルのうち、正常サンプルと比較して、有意な差のあるメチル化部位をスクリーニングするステップ、及び、（５）ステップ（３）の結果とステップ（４）の結果とを組み合わせることで、有意な差のあるメチル化保存部位、即ち、前立腺ガンと関連する染色体のメチル化部位を取得することを含む。
いくつかの実施形態において、前記サンプルは、組織（例えばガン組織）、血液、尿液（例えば前立腺をマッサージした後の尿液）、糞便又は組織液（例えば前立腺液）に由来するものである。
いくつかの実施形態において、前記メチル化保存部位は、正常サンプルにおけるメチル化度の標準偏差ＳＤ値は、０．２５以下であるメチル化部位である。
いくつかの実施形態において、有意な差のあるメチル化部位とは、疾患サンプルと正常サンプルとを比較する場合に、メチル化度の変化が０．２以上であり、且つｐ値とｑ値とがいずれも０．０１以下である部位であり、前記変化は、増大又は低下である。
本発明において、「診断」、「罹患リスクの評価」及び「治療効果の評価」はいずれも、当該技術分野で周知されている意味を有する。例えば、「診断」とは、当該疾患を罹患したか否かを判断することであり、「罹患リスクの評価」とは、罹患リスク及び治療後再発リスクに関する評価であり、「治療効果の評価」とは、治療効果の有無に関する評価であり、例えば、症状が軽減し、消失し、病巣が減少し若しくは消失し、又は、疾患がさらに進行していないことは、治療が有効であるといえる。
本発明において、「疾患サンプル」とは、病巣のある組織サンプル又は当該疾患に関連する組織サンプルであり、例えば、前立腺ガンの疾患サンプルは、前立腺ガンのガン組織サンプルを含むほか、前立腺ガンと関連する前立腺液のサンプル及び尿液サンプルも含み、特に、前立腺ガンをマッサージした後の尿液サンプルを含む。
本発明において、「正常サンプル」と「正常標本」とは同じ意味を有し、「疾患サンプル」と対比する正常組織のサンプルを意味し、例えば、疾患のサンプルはガン組織サンプルである場合には、正常サンプルは、ガン近傍組織のサンプルでもよい。疾患サンプルは罹患後の血液及び尿液のサンプルである場合には、正常サンプルは、罹患前の血液サンプル又は尿液サンプルでもよい。
本発明において、「正常参照値」は、当該技術分野で周知された意味を有し、所定数量の正常サンプルから得られた所定指標の正常値の範囲のことである。例えば、所定数量の正常サンプルに基づき、Ｙ染色体のあるメチル化部位のメチル化度の正常参照値の範囲を取得することができる。あるサンプルのある指標が、正常範囲内にあるか否かを判定する場合には、当該正常参照値は参照的意義を有する。
本発明において、前記試薬キットは、ｄＮＴＰ、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ（メチル基特異的な制限エンドヌクレアーゼを含む）、及びマーカ（蛍光マーカ、化学発光マーカ及び放射マーカ等を含む）からなる群から選択される一つ又は複数である。
本発明において、ゲノムにおけるあるメチル化部位に基づき、当該メチル化部位のメチル化度を検出するオリゴヌクレオチドプライマをデザインする方法は、当該技術分野で周知されており、当該オリゴヌクレオチドプライマと当該メチル化部位のある核酸配列とは、相補的であり又はハイブリダイズされている。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドプライマの数は、少なくとも１つ又は少なくとも１セットであり、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０つ、少なくとも１１つ又は少なくとも１２つであり、前記メチル化部位のある核酸配列に相補的であり又はハイブリダイズされている。
本発明に係る具体的な実施形態において、ｃｇ０５１６３７０９部位を増幅させるプライマは、
Ｆ：ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＡＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。
Ｆ：ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＡＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。
本発明に係る具体的な実施形態において、ｃｇ２７５３９８３３部位を増幅させるプライマは、
Ｆ：ＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）である。
Ｆ：ＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）である。
本発明において、染色体におけるメチル化部位の表示方法「ｃｇ」は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ会社の４５０Ｋチップにより、各メチル化部位に対する命名である。当該表示方法の定義は、当該技術分野で周知されており、表示されたメチル化部位と染色体上の特異的なメチル化部位とはそれぞれ対応しており、当業者は、当該方法により表示された部位に基づき、ヒトの染色体に対して、正確、且つ特異的な対応関係をつけることができる。
本発明において、「メチル化」はＣｐＧ部位のメチル化を意味する。
本発明において、メチル化度は、当該技術分野において周知された表示方法を用いて表示することができる。例えば、シークエンシング時に検出したメチル化されたシトシンＣが、検出した全てのＣに対して占める割合で表示することができる。具体的には、β値（ｂｅｔａ ｖａｌｕｅ）で表示し、その数値範囲は０〜１又は０〜１００％である。いくつかの実施形態において、メチル化度の表示方法は、β値（ｂｅｔａ ｖａｌｕｅ）で表示し、その数値範囲は０〜１である。
本発明において、メチル化度の増大又は低下に関しては、β値の差（例えばサンプル間の差）が０．２以上であることで判断される。
本発明において、「ＳＤ値」は、標準偏差値であり、当該技術分野で周知された意義及び計算方法に基づいたものであり、例えば、『生物統計及びその実験設計』（著者：明道緒、中国農業出版社、２０１０年８月第四版）が参照される。
本発明において、「ｐ値」及び「ｑ値」は、当該技術分野で周知された意義及び計算方法に基づいたものであり、例えば、『生物統計及びその実験設計』を参照することができる。例えば、ｐ値は、仮に正確であるとしたものの外された場合の確率であり、陰性の数と総数との比であり、サンプルデータを検証するための確率である。ｑ値は、外されたものの正確なものである確率であり、偽陽性の数と陽性と推測されるものの数との比であり、得られた推定的な結論を検証するための確率であり、ｐ値に基づいて算出されたものである。換言すると、ｑ値はｐ値に対する再統計になるといえる。
本発明は、疾患に関連する染色体のメチル化部位をスクリーニングする方法及び基準を確立し、前立腺ガンを例として、前立腺ガンの診断に関連する６つのＹ染色体メチル化部位をスクリーニングした。スクリーニングされたＹ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断マーカとして、疾患の早期及び迅速な診断に用いることができる。
以下、実施例を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。下記実施例は、本発明を限定するものではなく、本発明を説明するために用いられるだけであることが当業者により理解すべきである。実施例において、具体的な条件を示していない場合に、通常の条件又は製造者の条件に基づくものと理解される。ここで、試薬や装置については、メーカーを明記していないものであれば、いずれも市販で入手可能な通常の商品である。
実施例１ 前立腺ガンのガン組織及びガン近傍組織の採集鑑定
前立腺ガン患者の腫瘍切除手術から組織を採取し、経験の豊富な医者が、免疫組織化学法を用いて、ガン組織とガン近傍組織とを分けることで、採集を行った（サンプルは、上海長海医院より提供された）。
前立腺ガン患者の腫瘍切除手術から組織を採取し、経験の豊富な医者が、免疫組織化学法を用いて、ガン組織とガン近傍組織とを分けることで、採集を行った（サンプルは、上海長海医院より提供された）。
実施例２ メチル化保存部位のスクリーニング
６６例の前立腺ガン患者のガン近傍組織を取得し、当該組織からＤＮＡを採取すると共に増幅させる（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．５１３０６））。ＤＮＡメチル化チップＩｌｌｕｍｉｎａ ４５０Ｋ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ ａｒｒａｙ）を用いて、６６例のサンプルの全遺伝子配列のメチル化度を検出し、スキャンにより得られた初期データを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ ソフトを用いて、ｉｌｌｕｍｉｎａの公式メチル化解析アルゴリズムに基づいて、各サンプルの各部位のメチル化度、即ちＲａｗ ｄａｔａを生成する。次に、異なる蛍光、プローブ種により生じた偏差校正及び正規化、部位のフィルタリングを経て、フィルタリングされた部位のメチル化度、即ちＮｏｒｍ ｄａｔａを算出し、各部位のメチル化度は、β値（０−１）で表示される。そのうちのＹ染色体のメチル化情報を用いて、分析対比を行い、サンプル間のメチル化度（β値）のＳＤ値に基づき７５つのメチル化保存部位（ＳＤ値≦０．２５）をスクリーニングする。その結果は、図１に示される。
６６例の前立腺ガン患者のガン近傍組織を取得し、当該組織からＤＮＡを採取すると共に増幅させる（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．５１３０６））。ＤＮＡメチル化チップＩｌｌｕｍｉｎａ ４５０Ｋ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ ａｒｒａｙ）を用いて、６６例のサンプルの全遺伝子配列のメチル化度を検出し、スキャンにより得られた初期データを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ ソフトを用いて、ｉｌｌｕｍｉｎａの公式メチル化解析アルゴリズムに基づいて、各サンプルの各部位のメチル化度、即ちＲａｗ ｄａｔａを生成する。次に、異なる蛍光、プローブ種により生じた偏差校正及び正規化、部位のフィルタリングを経て、フィルタリングされた部位のメチル化度、即ちＮｏｒｍ ｄａｔａを算出し、各部位のメチル化度は、β値（０−１）で表示される。そのうちのＹ染色体のメチル化情報を用いて、分析対比を行い、サンプル間のメチル化度（β値）のＳＤ値に基づき７５つのメチル化保存部位（ＳＤ値≦０．２５）をスクリーニングする。その結果は、図１に示される。
実施例３ 有意な差のあるメチル化部位のスクリーニング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＩＭＡ）ソフトパッケージを用いて、６６セットのガン組織とガン近傍組織との間におけるＹ染色体のＤＮＡメチル化度（β値）を比較することで、ガン組織中の有意な変化を有する３７つのＤＮＡメチル化部位をスクリーニングし、当該部位は、即ち、Δβ≧０．２（即ち、ガン組織とガン近傍組織との間におけるβ値の差が≧０．２）、且つｐ値≦０．０１の部位である。図２に示される。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＩＭＡ）ソフトパッケージを用いて、６６セットのガン組織とガン近傍組織との間におけるＹ染色体のＤＮＡメチル化度（β値）を比較することで、ガン組織中の有意な変化を有する３７つのＤＮＡメチル化部位をスクリーニングし、当該部位は、即ち、Δβ≧０．２（即ち、ガン組織とガン近傍組織との間におけるβ値の差が≧０．２）、且つｐ値≦０．０１の部位である。図２に示される。
実施例４ 有意な変化のある保存部位のスクリーニング
実施例２及び実施例３の結果に基づき、両者の共通集合（即ち、ガン近傍組織において保存され且つガン組織において有意な変化を起こしたメチル化部位）をスクリーニングし、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３との６つの部位が得られる（図３及び図４）。この６つの部位の詳細情報は表１に示されている。
実施例２及び実施例３の結果に基づき、両者の共通集合（即ち、ガン近傍組織において保存され且つガン組織において有意な変化を起こしたメチル化部位）をスクリーニングし、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３との６つの部位が得られる（図３及び図４）。この６つの部位の詳細情報は表１に示されている。
表１は、ガン組織において有意な変化を起こしたメチル化部位の詳細情報である。
これら６つの部位を、各ガン組織とガン近傍組織とのセットにおいて比較検出を行い、ガン組織において、有意なメチル化変化を確実に起こした割合を計算する（図５）。共通集合における６つの部位は、ガン組織において有意なメチル化度の変化を起こした保存部位であり、前立腺ガン診断のマーカとすることができる。
実施例５ 尿液サンプルにおける部位ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３のメチル化度の検出
前立腺をマッサージし、前立腺ガン患者と正常者との尿液サンプルを採集し、採集された尿液サンプルからＤＮＡを採集する。パイロシークエンスにより、部位ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３のメチル化度を取得する。前立腺生体穿刺陰性及び陽性のサンプルの二つの部位が、尿液サンプルにおいてメチル化度の変化を対比して分析する。図７に示される。
前立腺をマッサージし、前立腺ガン患者と正常者との尿液サンプルを採集し、採集された尿液サンプルからＤＮＡを採集する。パイロシークエンスにより、部位ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３のメチル化度を取得する。前立腺生体穿刺陰性及び陽性のサンプルの二つの部位が、尿液サンプルにおいてメチル化度の変化を対比して分析する。図７に示される。
各プライマの配列は以下に示す。
ｃｇ０５１６３７０９
Ｆ：ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＡＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
ｃｇ２７５３９８３３
Ｆ：ＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
ｃｇ０５１６３７０９
Ｆ：ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＣＡＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
ｃｇ２７５３９８３３
Ｆ：ＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｒ：５’−ＢＩＯＴＩＮ−ＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
Ｓ−ｐｒｉｍｅｒ：ＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
実施例６ 部位ｃｇ０５１６３７０９のメチル化度を診断マーカとする場合の診断効率がＰＳＡより優れている。
実施例５の実験結果に基づき、受検者の操作曲線（ＲＯＣ）により、部位ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３のメチル化を診断マーカとする場合の診断効率を分析する。部位ｃｇ２７５３９８３３のＲＯＣ曲線における面積ＡＵＣ（０．７２９）がＰＳＡ（０．７５３）に対して有意な優位性が見出されていないものの、部位ｃｇ０５１６３７０９のＡＵＣ（０．９４４）は、ＰＳＡ（０．７５３）と比較して明らかな優位性を有し、前立腺ガン診断マーカとして、比較的高い感度（９３．９％）及び特異性（８３．３％）を有するといえる。
実施例５の実験結果に基づき、受検者の操作曲線（ＲＯＣ）により、部位ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３のメチル化を診断マーカとする場合の診断効率を分析する。部位ｃｇ２７５３９８３３のＲＯＣ曲線における面積ＡＵＣ（０．７２９）がＰＳＡ（０．７５３）に対して有意な優位性が見出されていないものの、部位ｃｇ０５１６３７０９のＡＵＣ（０．９４４）は、ＰＳＡ（０．７５３）と比較して明らかな優位性を有し、前立腺ガン診断マーカとして、比較的高い感度（９３．９％）及び特異性（８３．３％）を有するといえる。
本発明に係る具体的実施態様は、上記詳述した通り、当業者により理解することができる。既知のあらゆる技術に基づき、細部に対して修飾及び代替を行うことができ、これらの改変はいずれも本発明の保護範囲に属するものである。本発明の範囲は、特許請求の範囲及びその均等的範囲により決められる。
Claims (30)
- 受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する試薬の、試薬キットにおける使用であって、前記試薬キットは、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価、及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングからなる群から選択される一つ又は複数の用途に使用され、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である、使用。
- 前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項１に記載の使用。
- 前記検出されるサンプルは、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項２に記載の使用。
- 前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される、請求項３に記載の使用。
- 前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される、請求項１に記載の使用。
- 前記試薬は、オリゴヌクレオチドプライマであり、前記オリゴヌクレオチドプライマは、Ｙ染色体のメチル化部位を含有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される、請求項１に記載の使用。
- 受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する試薬を含む試薬キットであって、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価、及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングからなる群から選択される一つ又は複数の用途に使用され、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である、試薬キット。
- 前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項７の試薬キット。
- 前記検出されるサンプルは、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項８に記載の試薬キット。
- 前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される、請求項９に記載の試薬キット。
- 前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される、請求項７に記載の試薬キット。
- 前記試薬は、オリゴヌクレオチドプライマであり、前記オリゴヌクレオチドプライマは、Ｙ染色体のメチル化部位を含有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される、請求項７に記載の試薬キット。
- 前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングの方法であって、前記方法は、受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出するステップを含み、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である、方法。
- 正常サンプル又は正常参照値と比較し、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数のメチル化部位のメチル化度が低下した場合に、受検者が前立腺ガンを罹患し、又は受検者が前立腺ガンを罹患するリスクが高いことが示され、正常サンプル又は正常参照値と比較し、メチル化部位ｃｇ０５１６３７０９のメチル化度が増大した場合に、受検者が前立腺ガンを罹患し、又は受検者が前立腺ガンを罹患するリスクが高いことが示される、請求項１３に記載の方法。
- 治療前又はスクリーニングされた薬剤の使用前と比較し、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数のメチル化部位のメチル化度が増大した場合に、受検者の治療が有効、又はスクリーニングに使用された薬剤が有効であることが示され、治療前又はスクリーニングされた薬剤の使用前と比較し、メチル化部位ｃｇ０５１６３７０９のメチル化度が低下した場合に、受検者の治療が有効、又はスクリーニングに使用された薬剤が有効であることが示される、請求項１３に記載の方法。
- 前記検出されるサンプルは、組織、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記検出されるサンプルは、尿液（例えば、前立腺をマッサージした後の尿液）及び前立腺液から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０５１６３７０９及びｃｇ２７５３９８３３から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、パイロシーケンシング、バイサルファイト処理、定量及び／又は定性のメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ、単一ヌクレオチドプライマの伸張（ＳＮＵＰＥ）、ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）及び質量分析法から選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記受検者の検出されるサンプルにおけるＹ染色体のメチル化部位のメチル化度を検出する方法は、オリゴヌクレオチドプライマを使用するステップを含み、前記オリゴヌクレオチドプライマがＹ染色体のメチル化部位を有するヌクレオチド配列を増幅するために使用される、請求項１３に記載方法。
- Ｙ染色体のメチル化部位をバイオマーカとして、前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングに使用される、使用であって、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である、使用。
- 前立腺ガンの診断、前立腺ガンの罹患リスクの評価、前立腺ガンの治療効果の評価及び前立腺ガンの治療薬のスクリーニングに使用されるバイオマーカであって、前記バイオマーカは、Ｙ染色体のメチル化部位であり、前記Ｙ染色体のメチル化部位は、ｃｇ０３０５２５０２、ｃｇ０４４６２３４０、ｃｇ０５１６３７０９、ｃｇ０５５４４６２２、ｃｇ１４４６６５８０及びｃｇ２７５３９８３３からなる群から選択される一つ又は複数である、バイオマーカ。
- 疾患に関連する染色体のメチル化部位をスクリーニングする方法であって、（１）患者の疾患サンプルと正常サンプルを取得するステップ、（２）疾患サンプルと正常サンプルとの染色体のメチル化情報を特定するステップ、（３）正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、メチル化保存部位をスクリーニングするステップ、（４）疾患サンプル及び正常サンプルの染色体のメチル化情報に基づき、疾患サンプルのうち、正常サンプルと比較して、有意な差のあるメチル化部位をスクリーニングするステップ、及び、（５）ステップ（３）の結果とステップ（４）の結果とを組み合わせることで、有意な差のあるメチル化保存部位、即ち、疾患に関連する染色体のメチル化部位を得るステップを含む、方法。
- 前記疾患はガンであり、例えば前立腺ガンである、請求項２３に記載の方法。
- 前記染色体は常染色体又は性染色体（例えばＹ染色体）である、請求項２３に記載の方法。
- 前記サンプルは、組織（例えばガン組織）、血液、尿液、糞便又は組織液（例えば前立腺液）に由来する、請求項２３に記載の方法。
- 前記メチル化保存部位は、正常サンプルにおけるメチル化度の標準偏差ＳＤ値が０．２５以下であるメチル化部位である、請求項２３に記載の方法。
- 前記有意な差のあるメチル化部位は、疾患サンプルと正常サンプルとを比較するとき、メチル化度の変化が０．２以上であり、且つｐ値及びｑ値がいずれも０．０１以下である部位であり、前記変化は、増大又は低下である、請求項２３に記載の方法。
- 前立腺ガンを診断する方法であって、前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングするステップを含む、方法。
- 前記前立腺ガンと関連するＹ染色体のメチル化部位をスクリーニングするステップは、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の方法を含む、請求項２９に記載の方法。
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