KR102067607B1 - Y 염색체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용 - Google Patents

Y 염색체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메틸화 사이트의 질병 진단 마커로써의 응용을 개시하였으며, 구체적으로는 Y 염색체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 질병에 관한 염색체 메틸화 사이트를 선별하는 방법과 표준을 확정하였으며, 전립선암을 예로 들어 전립선암의 진단에 관한 6 개의 Y 염색체 메틸화 사이트를 선별하였다. 또한 선별한 Y 염색체 메틸화 사이트는 전립선암을 진단하는 마커로써 질병 초기의 빠른 진단에 응용될 수 있다.

Description

Y 염색체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용
본 발명은 메틸화 사이트의 질병 진단 마커로써의 응용에 관한 것이며, 구체적으로는 Y 염색체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용에 관한 것이다.
DNA 메틸화는 일반적인 후성 유전학(epigenetic)적 수식으로, DNA 메틸기전달효소(DNA methyltransferase)의 촉매 작용하에, S-아데노실메티오닌(S-adenosyl methionine)이 제공하는 메틸기를 이용하여 시토신(cytosine)의 제5위치 탄소원자를 메틸화하여, 시토신을 5-메틸시토신(5－methylcytosine)으로 전환하는데, 이는 유전자 발현 조절에 있어서 아주 중요한 작용을 한다.
암은 악성 종양이라고도 불리우며, 이는 세포 생장 증식을 제어하는 시스템이 비정상적으로 되어 일어나는 질병이다. 정상적인 경우, 세포의 생장 증식은 암유전자와 암 억제 유전자를 포함하는 생장 발육을 조절하는 유전자들에 의해 엄격히 조절되어, 정상적인 생리 상태를 유지하나; 복사, 화학 오염, 바이러스 감염 및 내분비 실조 등 다양한 요소의 영향에 의해, 암유전자가 활성화 되고 암 억제 유전자가 불활성화되어 암을 유발한다. 유전자의 돌연변이 외에, 예를 들어 히스톤 수식(histone modification), DNA 메틸화와 같은 후성 유전의 비정상 조절도 종양이 발생 및 발전되는 과정에서 중요한 작용을 하는바, 다양한 암에서 모두 후성 유전학적 수식의 이상을 발견하였다. 다시 말한 즉, 암의 발생은 극히 복잡한 과정이며, 체내의 암유전자, 암 억제 유전자 및 후성 유전학적 수식 등이 비정상적으로 조절되고, 이러한 비정상적 조절이 누적된 결과이다.
DNA 메틸화와 암의 발생은 밀접한 관계가 있으며, 많은 암에서 DNA 메틸화가 비정상적인 현상을 발견하였다. DNA 메틸화는 일정한 안정성을 구비하고 있으며, 이는 암 발생의 초기 원인이다. 근래의 많은 연구결과는 비정상적인 DNA 메틸화가 일종 암 진단의 바이오마커(biomarker)로 될수 있음을 증명하였다. 현재, 많은 특정 유전자 프러모터(promoter) 구역에서의 비정상적인 DNA 메틸화는 전립선암 진단에서의 잠재적인 마커로 사용된다.
현재, 전립선암을 진단하는 주요한 방법은 직장 검사, 혈청 전립선 특이항원(prostate-specific antigen, PSA) 검사, 조직 면역 절편 검사 등 이며, 이중 조직 면역 절편 검사는 전립선암을 진단하는 가장 우수한 방법이다. 그러나 조직 면역 절편 검사는 우선 환자의 전립선 조직을 얻어야 하므로 환자에게 비교적 큰 고통을 주어 초기 진단에는 적합하지 않다. 혈청 전립선 특이항원(PSA)은 현재 전립선암의 초기 진단에 사용되는 마커이지만, 이를 이용한 검사는 준확한 편이 아니고, 일정한 회색 지대(gray zone)가 존재한다. 따라서, 전립선암의 초기 진단에 있어서, 편리하고 준확한 진단 마커를 찾아낼 것을 급히 원하고 있다.
아울러, 종래 기술에는 DNA 메틸화 검측에 관한 다양한 방법이 있으며, 예를 들어 CN104062334A에서 개시한 DNA 메틸화 검측에 관한 정량분석 방법이 있고, 더 나아가 DNA 메틸화 칩 기술 등이 있다. 그러나, 현재까지 메틸화의 정상 여부를 판단함에 있어서, 통일적이고 비교적 준확한 표준이 없으므로, 특정 사이트(SITES) 메틸화 정도(methylation level)의 변화에 따라 최대한 빠르게 암 위험성을 예측할 수 없다.
본 발명의 발명자는 통일적이고 표준적인 질병에 관한 메틸화 사이트의 선별 방법을 구축하였으며, 전립선암에 관한 Y 염색체 메틸화 사이트를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제 1 방면은, 피험자의 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 시약(reagent)의 키트 제조에서의 용도에 있어서, 상기 키트는 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 치료 약물의 선별 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상에 사용되며; 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg03052502, cg04462340, cg05163709, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833 에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 피험자의 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 시약의 키트 제조에서의의 용도에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 조직, 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg05163709와 cg27539833에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 피험자의 상기 검측대상 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 방법은, 파이로시퀀싱, 중아황산염 처리 염기서열 분석기술(Bisulfite sequencing), 정량 및/또는 정성의 메틸화 특이성 중합효소연쇄반응, 서던블롯법(southern blotting), RLGS법(restriction landmark genomic scanning), SNuPE 법(single nucleotide primer extension), CpG 섬 마이크로어레이(CpG island Microarray), SNuPE 법(single-nucleotide primer extension), COBRA법(combined bisulfite restriction analysis) 및 질량 스펙트럼법 중에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 시약은 Y 염색체 메틸화 사이트를 포함하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer) 이다.
본 발명의 제 2 방면은, 피험자의 검측대상 샘플에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 시약을 포함하고, 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 치료 약물의 선별 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상에 사용되며; 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg03052502, cg04462340, cg05163709, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833 에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 키트에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 조직, 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg05163709와 cg27539833에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 피험자의 상기 검측대상 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 방법은, 파이로시퀀싱, 중아황산염 처리 염기서열 분석기술, 정량 및/또는 정성의 메틸화 특이성 중합효소연쇄반응, 서던블롯법, RLGS법, SNuPE 법, CpG 섬 마이크로어레이, single-nucleotide primer extension법, COBRA법 및 질량 스펙트럼법 중에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 시약은 Y 염색체 메틸화 사이트를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 이다.
본 발명의 제 3 방면은, 피험자의 검측대상 샘플에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 단계를 포함하되, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg03052502, cg04462340, cg05163709, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833 에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별 방법에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 정상 샘플 또는 정상 참조값과 비교할 때, cg03052502, cg04462340, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 메틸화 사이트의 메틸화 정도가 낮을 경우, 피험자가 이미 전립선암에 걸리거나 또는 전립선암에 걸릴 위험성이 높다는 것을 나타내며; 정상 샘플 또는 정상 참조값과 비교할 때, 메틸화 사이트 cg05163709의 메틸화 정도가 높을 경우, 피험자가 이미 전립선암에 걸리거나 또는 전립선암에 걸릴 위험성이 높다는 것을 나타낸다.
일부 실시방안에 있어서, 치료전 또는 선별 약물을 사용하기 전에 비해, cg03052502, cg04462340, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 메틸화 사이트의 메틸화 정도가 높아질 경우, 피험자에 대한 치료가 유효하거나 선별 약물이 유효하다는 것을 나타내며, 치료전 또는 선별 약물을 사용하기 전에 비해, 메틸화 사이트 cg05163709의 메틸화 정도가 낮아질 경우, 피험자에 대한 치료가 유효하거나 선별 약물이 유효하다는 것을 나타낸다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 조직, 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변) 및 전립선액에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg05163709와 cg27539833에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 피험자의 상기 검측대상 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 방법은, 파이로시퀀싱, 중아황산염 처리 염기서열 분석기술, 정량 및/또는 정성의 메틸화 특이성 중합효소연쇄반응, 서던블롯법, RLGS법, SNuPE 법, CpG 섬 마이크로어레이, single-nucleotide primer extension법, COBRA법 및 질량 스펙트럼법 중에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서, 피험자의 상기 검측대상 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 상기 방법은, Y 염색체 메틸화 사이트를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제 4 방면은, Y 염색체 메틸화 사이트가 바이오마커로써 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별에서의 용도에 있어서, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg03052502, cg04462340, cg05163709, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833 에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 Y 염색체 메틸화 사이트가 바이오마커로써 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별에서의 용도에 과한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 이러한 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 것을 통해 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별을 진행한다.
본 발명의 제 5 방면은, 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별에 사용되는 바이오마커에 있어서, 상기 바이오마커는 Y 염색체 메틸화 사이트이며, 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg03052502, cg04462340, cg05163709, cg05544622, cg14466580 및 cg27539833 에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오마커에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 이러한 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 것을 통해 전립선암의 진단, 전립선암에 걸릴 위험성 평가, 전립선암 치료 효과의 평가 및 전립선암 약물의 선별을 진행한다.
본 발명의 제 6 방면은, 환자의 질병 샘플과 정상 샘플을 얻는 단계 1; 질병 샘플과 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보를 확정하는 단계 2; 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보에 따라 메틸화 보존적 사이트를 선별하는 단계 3; 질병 샘플과 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보에 따라 질병 샘플 중 정상 샘플에 비해 현저한 차이가 있는 메틸화 사이트를 선별하는 단계 4; 및 단계 3과 단계 4를 결합하여 현저한 차이가 있는 메틸화 보존적 사이트를 질병에 관한 염색체 메틸화 사이트로 얻는 단계 5,를 포함하는 것을 특징으로 하는 질병에 관한 염색체 메틸화 사이트의 선별 방법에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 질병은 암이며, 예를 들어 전립선암 이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 염색체는 상염색체(autosome) 또는 성염색체(sex chromosome)(예를 들어 Y 염색체) 이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 샘플은 조직(예를 들어 암 조직), 혈액, 소변, 대변 또는 조직액(예를 들어 전립선액)으로부터 유래된다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 메틸화 보존적 사이트는 정상 샘플 중 메틸화 정도의 표준 편차 SD값이 0.25 보다 작거나 같은 메틸화 사이트 이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 현저한 차이가 있는 메틸화 사이트는 질병 샘플과 정상 샘플을 비교할 때 메틸화 정도 변화가 0.2 이상이고 p값과 q값이 모두 0.01보다 작거나 같은 사이트 이며; 상기 변화는 상승 또는 하강을 의미한다.
또한, 본 발명은 전립선암에 관한 Y 염색체 메틸화 사이트를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 방법에 관한 것이다.
일부 실시방안에 있어서, 전립선암에 관한 Y 염색체 메틸화 사이트의 선별 방법은, 환자의 질병 샘플과 정상 샘플을 얻는 단계 1; 질병 샘플과 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보를 확정하는 단계 2; 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보에 따라 메틸화 보존적 사이트를 선별하는 단계 3; 질병 샘플과 정상 샘플의 염색체 메틸화 정보에 따라 질병 샘플 중 정상 샘플에 비해 현저한 차이가 있는 메틸화 사이트를 선별하는 단계 4; 및 단계 3과 단계 4를 결합하여 현저한 차이가 있는 메틸화 보존적 사이트를 질병에 관한 염색체 메틸화 사이트로 얻는 단계 5,를 포함한다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 샘플은 조직(예를 들어 암 조직), 혈액, 소변(예를 들어 전립선 마사지 후의 소변), 대변 또는 조직액(예를 들어 전립선액) 이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 메틸화 보존적 사이트는 정상 샘플 중 메틸화 정도의 표준 편차 SD값이 0.25 보다 작거나 같은 메틸화 사이트 이다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 현저한 차이가 있는 메틸화 사이트는 질병 샘플과 정상 샘플을 비교할 때 메틸화 정도 변화가 0.2 이상이고 p값과 q값이 모두 0.01보다 작거나 같은 사이트 이며; 상기 변화는 상승 또는 하강을 의미한다.
본 발명에서 "진단", "병에 걸릴 위험성 평가" 및 "치료 효과의 평가"는 본 분야에서 공지의 의미이며, 예를 들어 "진단"은 질병에 이미 걸렸는지 여부를 판단하며; "병에 걸릴 위험성 평가"는 병에 걸릴 위험성의 크기 및 치료 후 재발할 위험성의 크기에 대한 평가이고; "치료 효과 평가"는 치료 효과를 구비하는 여부에 대한 평가이며, 예를 들어, 증세가 완화되거나 사라지고, 병소가 작아지거나 사라지며, 또는 질병이 악화되지 않으면 치료는 유효적인 것이다.
본 발명에서, "질병 샘플"은 병소가 있는 조직 샘플 또는 해당 질병에 관한 조직 샘플을 의미하며, 예를 들어 전립선암의 질병 샘플은, 전립선암의 암 조직 샘플, 전립선암에 관한 전립선액 샘플과 소변 샘플, 특히는 전립선 마사지를 통해 얻은 소변 샘플을 포함한다.
본 발명에서 "정상 샘플"과 "정상 표본"의 의미는 동일하고, "질병 샘플"과 대응되는 정상 조직의 샘플을 의미하며, 예를 들어 질병 샘플이 암 조직 샘플일 경우, 정상 샘플은 암 주변 조직 샘플일 수 있고; 질병 샘플이 병에 걸린 후의 혈액 또는 소변 샘플일 경우, 정상 샘플은 병에 걸리기 전의 혈액 샘플 또는 소변 샘플일 수 있다.
본 발명에서 "정상 참조값"은 본 분야에서 공지된 의미이고, 일정한 수량의 정상 샘플의 기초상에 얻은 임의의 지표의 정상값 범위를 의미하며, 예를 들어 일정한 수량의 정상 샘플의 기초상에, Y 염색체 상의 임의의 메틸화 사이트의 메틸화 정도의 정상 참조값 범위를 얻을 수 있다. 따라서 임의의 샘플의 임의의 지표가 정상 범위내에 있는 여부를 판정할 경우, 해당 정상 참조값은 참조 가치가 있다.
본 발명에서 상기 키트에는 아래의 1종 또는 2종 이상의 시약이 포함될 수 있다: dNTP, 완충용액, DNA 중합효소, 제한 핵산내부 가수분해 효소(Restriction endonuclease)(메틸 특이성 핵산내부 가수분해 효소를 포함) 및 마커(형광 마커, 화확발광 마커 및 방사 마커 등을 포함).
본 발명에서 게놈의 임의의 메틸화 사이트에 따라, 해당 메틸화 사이트의 메틸화 정도의 검측에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 방법은 본 분야에 공지된 것이며, 해당 올리고뉴클레오티드 프라이머와 해당 메틸화 사이트가 위치하는 뉴클레오티드 서열은 상보(complementary)적이거나 또는 교잡(hybridization)된다.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 수량은 적어도 하나거나 또는 한그룹(group) 일 수 있으며, 예들 들어 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개, 적어도 11개 또는 적어도 12 개일 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 메틸화 사이트가 위치하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 또는 교잡된다.
본 발명의 구체적인 실시방안에서 cg05163709 사이트를 증폭하는 프라이머는:
F: GGAAAGGGGTGATTAAATATTTAGTTA(서열번호:1);
R: 5'-BIOTIN-CAACCTAATAAAAAACTATACAAACACAT(서열번호:2);
S-primer: ATAAGTATGTTTAATTATTGTTTAAG(서열번호:3) 이다.
본 발명의 구체적인 실시방안에서 cg27539833 사이트를 증폭하는 프라이머는:
F: GGAATAGTTTAGTTAAAGAAAAAGGTTAAGAT(서열번호:4);
R: 5'-BIOTIN-AATTTACCACAATACACAAAAAACTAACTA CTTA(서열번호:5);
S-primer: AGATTTTAGTAGTTTTTTGTCGTTA(서열번호:6) 이다.
본 발명에서 염색체상의 메틸화 사이트의 표시법 "cg"는 Illumina 사의 450K 칩에 근거하여 각 메틸화 사이트에 대하여 명명하였고, 해당 표시법의 의미는 본 분야에서 공지된 것이다. 이가 표시하는 메틸화 사이트는 염색체 상의 특정 메틸화 사이트와 일일이 대응되는바, 본 분야 기술자는 해당 방법에 근거하여 표시된 사이트를 준확하고 유일하게 인간 염색체에 대응할 수 있다.
본 발명에서 "메틸화"는 CpG 사이트의 메틸화를 의미한다.
본 발명에서 메틸화 정도는 본 분야에서 공지된 표시 방법을 사용하여 표시할 수 있으며, 예를 들어 시퀀싱 진행 시 검측된 메틸화 시토신 C이 검측된 전체 C에서 차지하는 비례를 통해 표시할 수 있으며, 구체적으로는 β값(beta_value)이고, 수치 범위는 0-1 또는 0-100% 이다. 일부 실시방안에서 메틸화 정도를 표시하는 방법은 β값(beta_value)이고, 수치 범위는 0-1이다.
본 발명에서, β값의 차이값(예를 들어 샘플 사이의 차이값)이 0.2 보다 크거나 같은 것에 근거하여 메틸화 정도의 상승 또는 하강을 판정한다.
본 발명에서 "SD값", 즉 표준 편차값은 본 분야에서 공지된 의미와 계산 방법을 구비하며, 예를 들어《Statistics Added Experimental Designs for Biology》(Daoxu Ming, 중국농업출판사, 2010년 8월 제 4 판)을 참조할 수 있다.
본 발명에서 "p값"과 "q값"은 본 분야에서 공지된 의미와 계산 방법을 구비하며, 예를 들어 《Statistics Added Experimental Designs for Biology》 를 참조할 수 있다. 예들 들어 p값=준확하다고 가정하였으나 거절될 확률=음성 개수/총 개수, 이는 샘플 데이터에 대한 하나의 검증 확률이고; q값=거절되었으나 정확한 확률=거짓 양성/양성으로 추측되는 개수, 이는 얻은 추론에 대한 일종 검증 확률이고, 이는 p값에 기반하여 계산되므로, q값은 p값에 대한 재통계라고도 할 수 있다.
본 발명은 질병에 관한 염색체 메틸화 사이트의 선별 방법과 표준을 확정하였으며, 전립선암을 예로 들어 전립선암의 진단에 관한 6 개의 Y 염색체 메틸화 사이트를 선별하였다. 또한 선별해낸 Y 염색체 메틸화 사이트는 전립선암을 진단하는 마커로써 질병 초기의 빠른 진단에 응용될 수 있다.
도 1은 암 주변 조직(tumor-adjacent tissues)에서 선별한 75개의 보존적 사이트(conserved sites)의 메틸화 정도를 나타내는 히트맵(heat map)이다.
도 2는 암 조직과 암 주변 조직의 비교를 통하여 선별한 37 개의 현저한 변화가 있는 메틸화 사이트를 나타낸 도면이다.
도 3은 75 개의 암 주변 조직에서 보존적인 메틸화 사이트를 나타내는 도면이다. 도 4는 75 개의 암 주변 조직에서 보존적인 메틸화 사이트 중 6개가 암 조직에서 명확히 변화된 것을 나타내내는 도면이다.
도 5에서 상측 도면은 선별된 최종 6개의 사이트의 메틸화 정도를 나타내는 도면이고, 하측 도면은 매개 사이트가 66개 암 조직 중에서 현저히 변화된 비례를 나타내는 도면 이다(하측 도면에서 흑색 표기는 명확히 변화됨을 의미함).
도 6은 소변 샘플을 통해 검측한 사이트 cg05163709와 사이트 cg27539833의 전립선 침 생검(prostate needle biopsy)의 양성과 음성 중에서의 DNA 메틸화 정도를 나타내는 도면이다.
도 7은 사이트 cg05163709와 위치 cg27539833의 메탈화를 진단 마커로하여 PSA 진단 효율과 비교한 것을 나타낸 도면이다.
이하에서는, 실시예를 결합하여 본 발명의 실시방안에 대해 구체적으로 설명할 것이며, 본 분야 기술자는 아래의 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해할 것이다. 실시예에서 구체적인 조건을 기재하지 않았으면 통상적인 조건 또는 제조 업체에서 건의하는 조건으로 진행한다. 사용되는 시약 또는 기기의 제조 업체를 기재하지 않았으면, 이들은 모두 시중에서 구매할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예 1: 전립선암의 암 조직 및 암 주변 조직의 수집 및 검증
암 제거 수술을 진행한 전립선암 환자의 수술로 부터 조직을 수집한 후, 풍부한 경험이 있는 의사에 의한 조직 면역 절편을 통해 암 조직과 암 주변 조직을 구분하여 수집한다(샘플은 상해 장해병원(Changhai Hospital of Shanghai)에서 제공함).
실시예 2: 보존적 메틸화 사이트의 선별
66명 전립선암 환자의 암 주변 조직을 수집하여 얻고, 그중에서 DNA 를 추출하여 증폭한다(QIAamp DNA Mini Kit(Cat.No.51306)). DNA 메틸화 칩 Illumina 450K(Infinium HumanMethylation450 BeadChip array)를 이용하여 66개 샘플의 전체 게놈(whole genome)의 메틸화 정도를 검측하며, GenomeStudio 소프트웨어(software)를 통해 스캔하여 얻은 원시 데이터를 illumina의 공식적인 메틸화 분석 알고리즘(Methylation Analysis Algorithms)에 따라 매개 샘플의 매개 사이트 메틸화 정도를 포함하는 Raw data를 생성한 후, 부동한 형광 및 탐침 유형으로 인한 편차에 대한 교정과 정규화(normalization), 및 사이트 필터링을 진행하여, 필터링된 후의 사이트의 메틸화 정도, 즉 Norm data를 얻으며, 매개 사이트의 메틸화 정도는 β값(0-1)로 표시한다. 그중에서 Y 염색체 메틸화 정보를 구분 및 획득하여 분석 비교를 진행하며, 샘플 간의 메틸화 정도(β값)의 SD값에 따라 75 개의 메틸화 보존적 사이트를 선별한다(SD값≤0.25). 결과는 도 1을 참조하면 된다.
실시예 3: 현저한 차이가 있는 메틸화 사이트의 선별
Illumina Methylation Analyzer(IMA) 소프트웨어를 이용하여 66 쌍의 암 조직과 암 주변 조직 사이의 Y 염색체 DNA 메틸화 정도(β값)의 비교에 근거하여, 37 개의 암 조직에서 현저한 변화가 있는 DNA 메틸화 사이트, 즉 Δβ≥0.2(암 조직과 암 주변 조직 사이의 β값의 차이가 ≥0.2)이고, p값≤0.01 인 사이트를 선별한다(도 2를 참조).
실시예 4: 현저한 변화가 있는 보존적 사이트를 선별
실시예 2와 실시예 3의 결과에 근거하여, 서로 겹치는 사이트를 선별하면(즉 암 주변 조직에서는 보존적이고, 암 조직에서 현저한 변화가 발생하는 메틸화 사이트) 총 6개의 사이트, 즉 cg03052502、cg04462340、cg05163709、cg05544622、cg14466580 및 cg27539833(도 3과 도 4를 참조)을 얻을 수 있다(상술한 6개의 사이트의 구체적인 정보는 표 1을 참조).
표 1은 암 조직에서 현저한 변화가 발생한 메틸화 사이트의 구체적인 정보이다.
Figure 112017074026911-pct00001
상술한 6개의 사이트를 매쌍의 암 조직-암 주변 조직에서 비교 검측하여, 어느 정도 비례의 암 조직에서 확실히 현저한 메틸화 변화가 발생하였는지를 계산한다. 상술한 겹치는 6개의 사이트, 즉 암 조직에서 현저한 메틸화 정도 변화가 발생된 보존적 사이트를 전립선암 진단 마커로 할 수 있다.
실시예 5: 소변 샘플에서 사이트 cg05163709와 사이트 cg27539833의 메틸화 정도
정상인의 소변 샘플과 전립선암 마사지를 통해 얻은 전립선암 환자의 소변 샘플로부터 DNA를 추출한다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하여 사이트 cg05163709와 사이트 cg27539833의 메틸화 정도를 얻고; 전립선 침 생검의 음성과 양성 샘플 간에 있어서, 이 두개 사이트가 소변 샘플에서의 메틸화 정도의 변화를 비교 분석하였다(도 7을 참조).
각 프라이머의 서열은 아래와 같다:
cg05163709: F:GGAAAGGGGTGATTAAATATTTAGTTA(서열번호: 1);
R: 5'-BIOTIN-CAACCTAATAAAAAACTATACAAACACAT(서열번호: 2);
S-primer: ATAAGTATGTTTAATTATTGTTTAAG(서열번호: 3).
Cg27539833
F: GGAATAGTTTAGTTAAAGAAAAAGGTTAAGAT(서열번호: 4);
R: 5'-BIOTIN-AATTTACCACAATACACAAAAAACTAACTA CTTA(서열번호: 5);
S-primer: AGATTTTAGTAGTTTTTTGTCGTTA(서열번호: 6).
실시예 6: 사이트 cg05163709의 메탈화를 진단 마커로써 사용하는 진단 효율은 PSA 보다 우수하다.
실시예 5의 실험 결과에 따라, 수용자 작용 특징 곡선(receiver operating characteristic curve, ROC)을 통해 사이트 cg05163709와 사이트 cg27539833의 메틸화를 진단 마커로써 사용하는 진단 효율을 분석하면, 사이트 cg27539833의 ROC의 곡선아래면적(AUC)(0.729)은 PSA(0.753)에 비해 현저한 우세가 없지만, 사이트 cg05163709의 AUC(0.944)는 PSA(0.753)에 비해 현저한 우세가 있으므로, 이가 전립선암 진단 마커로써 비교적 높은 민감성(93.9％)과 특이성(83.3％)을 구비한다는 것을 발견하였다.
비록 본 발명의 구체적인 실시형태에 대하여 상세하게 설명하여, 본 분야 기술자는 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 또한 이미 개시된 모든 계시에 따라 내용을 수정하거나 교체할 수 있으며, 이러한 개변은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다. 본 발명의 전부 범위는 첨부한 청부범위 및 이의 임의의 균등물에 의해 해석된다.
SEQUENCE LISTING <110> 중국과학원 북경게놈조연구소 <120> Y 염책체 메틸화 사이트의 전립선암 진단 마커로써의 응용 <130> IEC150021PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 1 ggaaaggggt gattaaatat ttagtta 27 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 2 caacctaata aaaaactata caaacacat 29 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 3 ataagtatgt ttaattattg tttaag 26 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 4 ggaatagttt agttaaagaa aaaggttaag at 32 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 5 aatttaccac aatacacaaa aaactaacta ctta 34 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 6 agattttagt agttttttgt cgtta 25

Claims (31)

  1. 피험자의 검측대상 샘플에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하기 위한 시약을 이용하여 키트를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 키트는 전립선암의 진단에 사용되며; 상기 Y 염색체 메틸화 사이트는 cg05163709이고,
    여기서, 피험자의 상기 검측대상 샘플 중에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하는 방법으로는 파이로시퀀싱법이고,
    상기 파이로시퀀싱법에서는 서열번호 1과 서열번호 2로 구성된 프라이머 쌍, 및 서열번호 3으로 구성된 시퀀싱 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 피험자의 검측대상 샘플에서 Y 염색체 메틸화 사이트의 메틸화 정도를 검측하기 위한 시약을 이용하여 키트를 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 검측대상 샘플은 조직, 소변 및 전립선액에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 검측대상 샘플은 전립선 마사지 후의 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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