TWI417546B

TWI417546B - 肺腺癌預後之甲基化分子指標

Info

Publication number: TWI417546B
Application number: TW100119258A
Authority: TW
Inventors: Yi Ching Wang; I Ying Kuo; I Shou Chang; Shih Sheng Jiang; Chung Hsing Chen; Fang Yu Tasi
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2013-12-01
Also published as: TW201250245A

Description

肺腺癌預後之甲基化分子指標

本發明係關於一種肺腺癌之診斷指標，特別是關於一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，以及將該肺腺癌預後之甲基化分子指標應用於肺腺癌分子診斷之用途。

肺癌乃工業國家惡性腫瘤死亡率之首位，五年存活率僅10至15%，其高死亡率之主因在於肺癌之高復發率及習用偵測技術之不足。

肺腺癌(lung adenocarcinoma)屬於非小細胞癌，係肺癌的主要種類，佔所有肺癌之40-50%，其比例逐年增加。不同於鱗狀細胞肺癌，肺腺癌主要好發於肺部周邊位置，如外側肺葉，且容易侵犯女性及非吸煙患者，肺腺癌的致病原因尚未明朗，並且初期症狀不明顯，因此在其早期診斷及預後分析上更顯困難。

習用肺癌篩檢之方法包含胸部X光、痰液細胞學檢查以及靈敏度較高之電腦斷層及正子攝影，其中，該胸部X光及痰液細胞學檢查雖為臨床慣用之肺癌診斷手段，卻具有專一性及靈敏度不佳等問題，無法善盡早期偵測以有效改善肺癌高致死率之意義。而電腦斷層及正子攝影雖係現今腫瘤部位及腫瘤分期判斷的重要指標，惟價格昂貴，非一般常人所能負擔，因此在臨床肺癌偵測之應用上往往受限。

按，美國公開第2010/0167296號專利案，揭示一種非小細胞肺炎之預後偵測方法，係以上皮細胞生長因子接受體(epithelial growth factor receptor；EGFR)、巨噬細胞聚落刺激因子(macrophage colony stimulating factor；CSF-1)及碳酸酐酶抑制劑(carbonic anhydraseIX；CAIX)等生物標記之表現值作為非小細胞肺癌預後狀況之判斷依據。

又，美國公開第2010/0317002號、第2010/00068207號、第2009/0214536號及第2009/0297507號專利案則分別揭示與肺癌診斷相關之蛋白質標記，包含CACNA1E、ADAM10、DDR2及ADAMTS-7等。

然而，前述各前案所示之分子診斷方法皆係利用偵測各生物標記於RNA或蛋白質層面之表現值，作為肺癌診斷的手段，而RNA及蛋白質皆屬不易保存且極不穩定之分子層次，不僅在檢體處理上較為複雜、困難，更容易因該RNA及蛋白質檢體之不穩定性而衍生偽陽性等問題，以致前述各檢測方法之專一性與靈敏度無法有效提升，無法適任於臨床肺癌檢測之使用。

據此可知，習用技術缺乏一具有高專一性、靈敏度，並且可廣泛應用於臨床肺腺癌早期診斷及預後分析之工具，因此，有必要針對習用技術加以改進，以有效預測肺腺癌之預後狀況而改善其高致死率。

基因體的甲基化為當代生醫研究的重點之一，據研究指出，基因啟動子上CpG島群(CpG island)的過度甲基化與癌症的形成與轉移息息相關。抑癌基因(tumor suppressor genes)啟動子的過度甲基化可導致許多參與調控的轉錄因子及聚合酶酵素無法正常結合至啟動子位置，造成該抑癌基因不表現，並導致染色體的不穩定及突變，因而衍生癌症的產生。因此，特定基因的甲基化可作為腫瘤形成的分子指標，惟，現今仍未有與肺腺癌相關之甲基化分子指標的開發及應用。

本發明之主要目的係提供一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，係針對肺腺癌之早期偵測及預後判斷具有高度專一性及靈敏度。

本發明之次一目的係提供一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，係直接針對檢體之DNA層面進行檢測，可避免習用RNA或蛋白質分子指標衍生偽陽性之疑慮。

本發明之再一目的係提供一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，係可以應用於臨床肺腺癌分子診斷，可兼具有高診斷率及低成本之效益。

本發明之再一目的係提供一種肺腺癌預後之甲基化分子指標於臨床肺腺癌分子診斷之用途，以建立一肺腺癌早期診斷及預後分析的工具，進而有效改善肺腺癌的高致死率。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，包含CTSE、NFAM1、TMEM129、EFNA2、AGTRL1、BDKRB1、SEMA4A、ALDH1A3之組合；其中，該上述之8個甲基化分子指標組合係與肺腺癌轉移與致死率相關。

其中，該肺腺癌包含第一期至第四期之肺腺癌。

其中，該肺腺癌致死率係指預後存活3年以下。

如申請專利範圍第1項所述之肺腺癌預後之甲基化分子指標應用於肺腺癌分子診斷之用途，包含偵測檢體基因的甲基化程度；以及依據該檢體基因中該甲基化分子指標的甲基化程度，作為肺腺癌預後之判斷依據。

其中，該檢體係癌組織、血液、血漿或帶有游離核酸之體液。

其中，該檢體基因的甲基化程度係由焦磷酸測序或基因體甲基化晶片之方法進行分析。

其中，該肺腺癌包含第一期至第四期之肺腺癌。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明所述之「篩檢族群」，係指自台北地區榮民總醫院的39名初期肺腺癌患者，包含第一期及第二期的肺腺癌患者，其中，27名肺腺癌患者的預後狀況較佳，存活率達3年以上，12名肺腺癌患者的預後狀況則較差，存活率僅3年以下。該「篩檢族群」係用於本發明之甲基化分子標記的篩選。

本發明所述之「驗證族群」，係指自台北地區榮民總醫院內與該「篩檢族群」完全獨立的另外30名肺腺癌患者，包含第一期及第二期的肺腺癌病患，其中26名肺腺癌患者的預後狀況較佳，存活率達3年以上，4名肺腺癌患者的預後狀況則較差，存活率僅3年以下，係用於本發明甲基化分子標記之診斷性的驗證。

本發明所述之「臨床病理資料」，係依據該「篩檢族群」或「驗證族群」的臨床預後資料所建立，包含各患者的存活率、腫瘤轉移程度及其他預後狀況等。

本發明所述之「基因體甲基化變異圖譜」，乃由肺腺癌組織檢體進行基因體甲基化分析所得之結果，經比對本發明之「臨床病理資料」而建立，係具有與肺腺癌預後較差有關之甲基化基因。

請參照第1圖所示，本發明係利用基因甲基化分析法，綜合本發明之臨床病理資料，進而建立一基因體甲基化變異圖譜，該基因體甲基化變異圖譜包含與肺腺癌預後較差高度相關之甲基化分子標記。該甲基化分子標記係針對臨床肺腺癌患者之預後狀況具有高度指標性及靈敏度，因此，可進一步應用於臨床肺腺癌分子診斷之開發，以提升肺腺癌之診斷率，並且改善肺腺癌之高致死率。

請再參照第1圖所示，本發明之甲基化分子標記乃係經由以下各步驟之操作而獲得，包含一甲基化分析步驟S1；一篩選步驟S1；以及一驗證步驟S3。

該甲基化分析步驟S2則係先採取該篩檢族群之癌組織檢體，利用一基因甲基化分析法偵測各檢體基因的甲基化程度，同時配合該篩檢族群的臨床病理資料，歸納並選取各檢體基因中，與肺腺癌預後較差具有關連性的甲基化基因。本實施例係利用一商用基因體甲基化晶片-Illumina humanmethylation27 bead chip(Illumina,CA,USA)分析各檢體中約14,000個基因的甲基化狀態，同時配合各檢體之臨床病理資料，自該14,000個基因中擷選與肺腺癌預後差相關，如存活率低於3年以下，之甲基化探針約27,578個。本實施例中，各基因之甲基化狀態係先經計算而換得一甲基化數值(β-value)，再依據該甲基化數值之高低挑選與肺腺癌預後差有關的27,578個探針。

該篩選步驟S2則係由該甲基化分析步驟S1所獲得之甲基化基因中，進一步挑選具有特異性且專一性地與肺腺癌之存活率低及轉移相關之基因。本發明之篩選步驟S2較佳係包含二階段，第一篩選階段S21；以及第二篩選階段S22。其中，該第一篩選階段係先於該甲基化基因中去除區隔性較低或者係具有干擾性的甲基化基因，包含具有基因多型性(single-nucleotide polymorphism)、重複片段(repeated sequences)以及甲基化數值(β-value)過高或過低之基因，如β-value大於0.9或者小於0.1，此外，為避免X染色體上之基因所衍生的劑量補償作用(dosage compensation)產生干擾，位於該X染色體上之基因同步於該第一篩選階段S21中剔除。該第二篩選階段S22係利用統計分析的方式，如cox迴歸分析(cox regression analysis)或貝氏迴歸分析(bayesian logistic regression software)等，再進一步於該第一篩選階段S21所選取之基因中，挑選與肺腺癌之存活率、預後狀況較差有關的基因，如存活率低於3年或產生轉移情形者。

本實施例之篩選步驟S3則係先自該27,578個探針中刪除含有基因多型性(SNP)、重複片段(repeated sequences)、X染色體基因以及不具區分性的探針，如篩選族群樣本經分析獲得之甲基化數值皆大於0.9或者皆小於0.1的探針，再利用統計軟體Super PC analysis進行嚴謹的計算，得出與肺腺癌預後狀況有關之甲基化探針約200個。該Super PC analysis係為進一步分析基因與疾病預後關係的統計軟體，為相關分析領域者所能了解並應用之統計分析方式。

該驗證步驟S3係利用一定量甲基化分析方法再次檢視該篩選步驟S2所擷選之基因，以建立一基因體甲基化變異圖譜，該基因體甲基化變異圖譜包含與肺腺癌預後較差高度相關之基因。本實施例之驗證步驟S3係採用焦磷酸測序(pyrosequencing)之方式驗證該200個甲基化探針，藉由統計分析的方法，挑選可同時於該Illumina humanmethylation27 bead chip及該焦磷酸測序之分析平台中得到相同結果的探針，以獲得本發明與肺腺癌轉移及存活率低於3年以下高度相關之基因體甲基化變異圖譜。

請參照第1表所示，本實施例之基因體甲基化變異圖譜係具有38個與肺腺癌預後高度相關之探針，係分別對應37個基因以及序列代碼為C16orf25的序列[參考自美國國家衛生院(Nation Institution of Health)，生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)]。其中，該第1表所示之R值係為相關數值(correlation coefficient)，係指各基因甲基化程度在晶片篩選平台與焦磷酸測序分析平台間之相關性，該R值愈趨近於1則代表二者之相關性愈好。

此外，請參照第2圖所示，組合該38個與肺腺癌預後高度相關之探針進行該篩檢族群之診斷試驗。本實施例係利用焦磷酸測序(pyrosequencing)之方式針對該篩檢族群的癌組織檢體進行分析，計算各癌組織檢體基因中的甲基化程度，再與該篩檢族群之臨床病理資料進行比對，以推得該38個探針的操作者接受特徵曲線(receiver operating characteristic curve；又稱ROC曲線)。據此可得知，該38個探針對於肺腺癌的預後狀況具有良好的專一性及靈敏度，具有應用於臨床肺腺癌檢測之潛力。

綜上所述，經由各步驟之篩選而獲得的38個探針，係與肺腺癌預後較差相關，並且具有良好的專一性及靈敏度，該38個探針即為本發明之甲基化分子標記，並且可進一步應用於臨床肺腺癌檢測方法之開發，藉由偵測患者檢體中，包含該38個探針序列之基因的甲基化程度，進一步與正常檢體進行比對，並且作為肺腺癌預後狀況之判斷依據。其中，該患者檢體可以係癌組織、血液或者其他可能帶有游離核酸之體液，以方便自各患者取得檢體進行試驗；而各基因的甲基化程度則可利用焦磷酸測序或基因體甲基化晶片等分析方法加以計算，較佳係利用焦磷酸測序的方式，以便於臨床診斷之快速操作與進行，同時可降低診斷成本。另外，該38個探針中包含少數具有低訊號，或者高偽性的探針，如SEQ ID No：8、18及38之探針，較佳係於檢測過程中屏除，以提升該甲基化分子標記於臨床檢測上之靈敏度與專一性。

為進一步證實本發明之甲基化分子標記確實針對肺腺癌的預後狀況具有高度的專一性及靈敏度，本實施例係組合該35個探針(屏除SEQ ID No：8、18及38之探針)，利用焦磷酸測序的方式，針對該篩檢族群及驗證族群的癌組織檢體進行分析，並且分別計算各檢體基因的甲基化程度。

請參照第3、4圖及第2表所示，係該35個探針的甲基化程度示意圖，顯示該35個探針皆在肺腺癌患者中呈現高度的甲基化，並且該35個探針的甲基化與肺腺癌患者具有明確的顯著性。

本發明之甲基化分子標記於實際應用於臨床肺腺癌之預後診斷分析，係先自篩檢患者中採得檢體，該檢體可以為組織，較佳為0.5立方公分(0.5cm³)，或者係血漿較佳為500微升(500μl)，再分別針對各檢體進行基因體核酸或游離核酸的萃取，所取得之核酸DNA經定量分析後，另取1微克(1μg)之核酸DNA進行亞硫酸鹽(sodium bisulfite)處理。再將處理後之核酸DNA純化回收成20微升(20μl)之體積，擷取其中的1微升(1μl)並利用聚合酶連鎖反應(PCR)進行獨立基因的放大，再將所獲得之產物(PCR products)加入特定的定序引子進行焦磷酸測序，由各基因所呈現的訊號以焦磷酸測序儀定量該基因的甲基化程度(範圍：0~100%)，並且配合各基因統計之權重係數進一步分析及判斷，如第3表所示，係列出本實施例之8個範例基因的權重係數，該權重係數係代表各基因的重要程度。

本實施例係利用公式(A)計算而推得各基因所代表之風險值，其中，各基因的風險值還須經加總而得一總值，該總值係代表各篩檢患者的死亡風險值，並且依據各基因權重係數及基因甲基化程度之不同，該總值可能有正負值的差異，其中數值愈趨近於正值且數值愈大，代表高死亡風險，也就是篩檢患者的預後較差。

(A)：單一基因甲基化程度(%)x權重係數=風險值

請參照第5圖所示，係該35個探針的甲基化程度，與該篩檢族群、驗證族群之臨床病理資料所推算而得之ROC曲線，由此可知，該35個探針，對於肺腺癌的預後狀況具有良好的專一性及靈敏度，確實可應用於臨床肺腺癌的診斷，作為肺腺癌預後狀況之判斷依據。

本發明之甲基化分子標記，乃係利用基因甲基化分析法，綜合本發明之臨床病理資料，經由嚴謹的統計方式計算而獲得，包含8個與肺腺癌預後較差高度相關的探針，對於臨床肺腺癌病患的預後具有指標性、專一性以及良好的靈敏度。

本發明之甲基化分子標記，係屬DNA分子標記，可直接就檢體之DNA層面進行偵測、分析，可避免檢體的過度處理及製備，以及容易衍生偽陽性等缺點，具有提升肺腺癌診斷之專一性及靈敏度的功效。

本發明之甲基化分子標記可應用於臨床肺腺癌新興檢測方法的開發，作為肺腺癌預後的評估指標，可藉由偵測患者檢體中，包含該8個探針序列之基因的甲基化程度，進一步與正常檢體進行比對，以作為肺腺癌預後狀況之判斷依據，並且建立一個具有高專一性、靈敏度，並且可廣泛應用於臨床肺腺癌早期診斷及預後分析之工具，改善肺腺癌之高致死率，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

S1‧‧‧甲基化分析

S2‧‧‧篩選步驟

S21‧‧‧第一篩選階段

S22‧‧‧第二篩選階段

S3‧‧‧驗證步驟

第1圖：本發明之甲基化分子指標之篩選流程圖。

第2圖：本發明之甲基化分子指標之診斷性示意圖。

第3圖：本發明之甲基化分子指標之甲基化程度示意圖。

第4圖：本發明之甲基化分子指標之甲基化程度示意圖。

第5圖：本發明之甲基化分子指標之診斷性示意圖。

<110> 國立成功大學

<120> 肺腺癌預後之甲基化分子指標及其應用於肺腺癌分子診斷之用途

<140> 100119258

<141> 100-06-01

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<212> DNA

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S1‧‧‧甲基化分析

S2‧‧‧篩選步驟

S21‧‧‧第一篩選階段

S22‧‧‧第二篩選階段

S3‧‧‧驗證步驟

Claims

一種肺腺癌預後之甲基化分子指標，包含：CTSE、NFAM1、TMEM129、EFNA2、AGTRL1、BDKRB1、SEMA4A、ALDH1A3之組合；其中，該上述之8個甲基化分子指標組合係與肺腺癌轉移與致死率相關。
依申請專利範圍第1項所述之肺腺癌預後之甲基化分子指標，其中該肺腺癌包含第一期至第四期之肺腺癌。
依申請專利範圍第1項所述之肺腺癌預後之甲基化分子指標，其中該肺腺癌致死率係指預後存活3年以下。