CN108796062A - 一种检测tgfbi基因多态性的试剂盒 - Google Patents

一种检测tgfbi基因多态性的试剂盒 Download PDF

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辛君伟
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒，试剂盒包括检测TGFBI基因上的R124H号位点的基因扩增引物和测序引物，正向引物为5'‑ACCTTTACGAGACCCTGGGA‑3'，反向引物为5'‑TTGCTAGGGGCGAAGATG‑3'，测序引物：5'‑TCAGCTGTACACGGAC‑3'其中，所述反向引物的5’端进行生物素标记。本发明的试剂盒灵敏性高、特异性强，方便应用，通过焦磷酸测序的方法测定TGFBI的基因型，为需要进行准分子激光手术或者高紫外环境工作等人提供指导建议。本发明试剂盒结果稳定且操作简便、省时，具有广泛的临床应用前景和巨大的商业价值。

Description

一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒。
背景技术
角膜营养不良(corneal dystrophy)是一组遗传性、对称性、非炎症性角膜疾病的总称，其共同特点是在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。Avellino角膜营养不良(Avellino Corneal Dystrophy,ACD)，是角膜营养不良的一种，也称为颗粒性营养不良Ⅱ型，其症状介于颗粒性角膜影响不良和晶格状角膜营养不良之间。
TGFBI基因是第一个被发现，也是目前报道的最为常见的与角膜营养不良相关的基因。它位于人第五号染色体，包含17个外显子，编码一个由683个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白存在于角膜上皮细胞和基质细胞中，发挥创伤愈合和黏附作用，其病变可以导致淀粉样蛋白的沉淀。Avellino型角膜营养不良主要是由TGFBI基因第四外显子p.R124H位点突变(CGC>CAC)引起的。患者的临床症状与R124H位点的突变剂量存在累积效应，即纯合突变的患者较杂合子患者发病更早更严重，且更容易复发。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒，为为需要进行准分子激光手术或者一些高紫外环境工作等人提供指导建议。。
本发明提供了一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒，包括检测TGFBI基因上的R124H位点的基因扩增引物和测序引物、阳性质控品、空白对照品、PCR反应试剂和焦磷酸测序试剂；
所述检测TGFBI基因上的R124H位点的基因扩增引物和测序引物的序列为：
正向引物：5'-ACCTTTACGAGACCCTGGGA-3'
反向引物：5'-TTGCTAGGGGCGAAGATG-3'
测序引物：5'-TCAGCTGTACACGGAC-3'
其中，所述反向引物的5’端进行生物素标记。
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品1，其为插入靶序列TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒；
所述插入靶序列为：
CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGTGAGATGACCTCCGTCTGCCCGGGGGACTCTTATGGGGAA
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品2，其为插入靶序列TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒；
所述插入靶序列为：
CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCACACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGTGAGATGACCTCCGTCTGCCCGGGGGACTCTTATGGGGAA
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品3，其为所述TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒与所述TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
其中，质粒载体为pUC57；所述阳性质控品3中TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒和TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒的数量比为1:1；
所述空白对照品为超纯水；
本发明的检测TGFBI基因多态性的试剂盒，其用于检测TGFBI基因多态性的方法为：
1)DNA提取：口腔上皮细胞(血液)全基因组DNA的提取；
2)实时荧光定量PCR反应：取上述基因组DNA 30-50ng进行PCR扩增反应，反应条件为95℃预变性处理5min；然后依次在95℃30s，54℃40s,72℃15s进行45个循环，然后72℃5min，最后4℃；
3)焦磷酸测序：将所获的PCR扩增产物在QIAgen PyroMark Q24上进行焦磷酸测序；
4)检测结果分析：
X、Y均为A、T、C或G的一种，当X≥90％，Y≤10％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点野生型；
当X≤10％，Y≥90％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点纯合突变型。
当40％≤X≤60％，40％≤X≤60％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点杂合突变型。
本发明所达到的有益效果是：本发明针对人TGFBI基因上的R124H位点设计基因扩增引物和测序引物，灵敏性高、特异性强；为TGFBI基因多态性检测提供新的试剂盒，方便应用。通过焦磷酸测序的方法测定TGFBI的基因型，为需要进行准分子激光手术或者一些高紫外环境工作等人提供指导建议。。本发明试剂盒结果稳定且操作简便、省时，具有广泛的临床应用前景和巨大的商业价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是TGFBI基因上R124H位点纯合野生型样本的焦磷酸测序结果；
图2是TGFBI基因上的R124H位点突变杂合型的焦磷酸测序结果；
图3是TGFBI基因上的R124H位点突变纯合型的焦磷酸测序结果；
图4是TGFBI基因上的R124H位点空白对照的焦磷酸测序结果；
图5是质控品control oligo的焦磷酸测序结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒，包括检测TGFBI基因上的R124H位点的基因扩增引物和测序引物、阳性质控品、空白对照品、PCR反应试剂和焦磷酸测序试剂；
所述检测TGFBI基因上的R124H位点的基因扩增引物和测序引物的序列为：
正向引物：5'-ACCTTTACGAGACCCTGGGA-3'
反向引物：5'-TTGCTAGGGGCGAAGATG-3'
测序引物：5'-TCAGCTGTACACGGAC-3'
其中，所述反向引物的5’端进行生物素标记。
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品1，其为插入靶序列TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒；
所述插入靶序列为：
CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGTGAGATGACCTCCGTCTGCCCGGGGGACTCTTATGGGGAA
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品2，其为插入靶序列TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒；
所述插入靶序列为：
CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCACACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGTGAGATGACCTCCGTCTGCCCGGGGGACTCTTATGGGGAA
TGFBI基因上的R124H位点阳性质控品3，其为所述TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒与所述TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
其中，质粒载体为pUC57；所述阳性质控品3中TGFBI基因上的R124H位点野生纯合子质粒和TGFBI基因上的R124H位点突变纯合子质粒的数量比为1:1；
所述空白对照品为超纯水；
本发明的检测TGFBI基因多态性的试剂盒，其用于检测TGFBI基因多态性的方法为：
1)DNA提取：用口腔拭子采集受检者的口腔上皮细胞，置于保存液中保存，提取上述所采集口腔上皮细胞的基因组DNA，并对其进行浓度和纯度的检测，A260/A280大于1.8，小于2.0；
2)实时荧光定量PCR反应：取上述基因组DNA 40ng进行PCR扩增反应，
a.PCR反应体系
组成成分 体积μl(区间)
模板 30-45ng
10x PCR Buffer 2.0-3.5
dNTP 2.0-3.0
上游扩增引物 0.3-0.7
下游扩增引物 0.3-0.8
Taq酶 0.11-0.2
ddH2O 补至29.0-33.0
所述反应中用到的上游扩增引物为5'-ACCTTTACGAGACCCTGGGA-3'；下游扩增引物为5'-TTGCTAGGGGCGAAGATG-3'；所述下游引物的5’端加有生物素标记
b-反应条件
琼脂糖凝胶电泳：扩增完成之后，取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有单一的目的条带出现则进行下一步，否则需重新试验；
3)焦磷酸测序：将所获的PCR扩增产物在QIAgen PyroMark Q24上进行焦磷酸测序；
4)检测结果分析：
X、Y均为A、T、C或G的一种，当X≥90％，Y≤10％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点野生型；
当X≤10％，Y≥90％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点纯合突变型。
当40％≤X≤60％，40％≤X≤60％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点杂合突变型。
图1-图5为焦磷酸测序结果，根据所述判断标准判定，图1为TGFBI基因上的R124H位点野生型的焦磷酸测序结果；图2为TGFBI基因上的R124H位点突变杂合型的焦磷酸测序结果；图3为TGFBI基因上的R124H位点突变纯合型的焦磷酸测序结果。图4为TGFBI基因上的R124H位点空白对照的焦磷酸测序结果；图5为质控品control oligo的焦磷酸测序结果。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 无锡正则精准医学检验有限公司
<120> 一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒
<141> 2018-06-05
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
<210> 4
<211> 241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
<210> 5
<211> 241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5

Claims (3)

1.一种检测TGFBI基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括检测TGFBI基因上的R124H位点的基因扩增引物和测序引物、阳性质控品、空白对照品、PCR反应试剂和焦磷酸测序试剂；
所述检测TGFBI基因上的R124H号位点的基因扩增引物和测序引物的序列为：
正向引物：5'-ACCTTTACGAGACCCTGGGA-3'
反向引物：5'-TTGCTAGGGGCGAAGATG-3'
测序引物：5'-TCAGCTGTACACGGAC-3'
其中，所述反向引物的5’端进行生物素标记。
2.如权利要求1所述的检测TGFBI基因多态性的试剂盒，其特征在于，阳性质控品包括阳性质控品1、阳性质控品2和阳性质控品3；
所述阳性质控品1为靶序列的野生纯合子质粒，所述靶序列为如SEQ ID No.4所示，
所述阳性质控品2为靶序列的突变纯合子质粒，所述靶序列如SEQ ID No.5所示，
所述阳性质控品3为野生纯合子质粒与突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pUC57；所述阳性质控品3中野生纯合子质粒和突变纯合子质粒的数量比为1:1。
3.如权利要求1所述的检测TGFBI基因多态性的试剂盒，其用于检测TGFBI基因多态性的方法为：
1)DNA提取：口腔上皮细胞全基因组DNA的提取；
2)实时荧光定量PCR反应：取上述基因组DNA 30-50ng进行PCR扩增反应，反应条件为95℃预变性处理5min；然后依次在95℃30s，54℃40s,72℃15s进行45个循环，然后72℃5min，最后4℃；
3)焦磷酸测序：将所获的PCR扩增产物在QIAgen PyroMark Q24上进行焦磷酸测序；
4)检测结果分析：
X、Y均为A、T、C或G的一种，当X≥90％，Y≤10％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点野生型；
当X≤10％，Y≥90％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点纯合突变型；
当40％≤X≤60％，40％≤X≤60％时，待测样本为TGFBI基因上R124H位点杂合突变型。
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