CN107523635A - 一种tgfbi基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒由核酸释放剂、探针混合物、2X反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品和超纯水组成。本发明采用一种核酸快速释放剂，一步法完成口腔脱落细胞、全血样品以及干血斑样本中核酸的快速释放，获得的核酸可直接用于单核苷酸多态性TaqMan探针法检测，具有操作简便、使用安全，成本低廉、实验结果可重复性好等优点，适合在临床基因检测中推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
TGFBI基因编码转化生长因子β诱导分泌蛋白，该基因编码含RGD序列的蛋白与胶原蛋白I、II和IV结合，且RGD motif既调节细胞吸附也可以作为不同整合素识别配体序列。此外，该蛋白在调控细胞内胶原蛋白相互作用和诱导软骨成骨形成过程中扮演重要角色；同时该蛋白能抑制细胞吸附。
TGFBI基因的突变引起多种眼角膜营养障碍，存在R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点中任何一种变异均会使患者在近视矫正手术后引发失明风险，因此，开展TGFBI基因上述位点检测具有重要意义。
TGFBI基因的检测首先需要将其从核酸中释放出来，而单核苷酸多态性检测方法有多种，常见的有普通PCR之后，采用电泳进行分析；有采用基因芯片法进行单核苷酸多态性基因检测；有采用第二代测序技术进行基因单核苷酸多态性分析；各自有其独特的特点。传统方法技术操作复杂繁琐，准确性不高，基因芯片通量高，但也有比较大误判率，第二代测序技术准确性高，但周期长，成本昂贵；并且上述方法均需要提供高纯度的高浓度的核酸作为检测模板。因此，亟待开发出一种快速完成核酸释放，并且不影响下游检测的核酸释放剂，同时开发出一套特异性高的单核苷酸多态性检测的试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法，目的是采用核酸快速释放剂方法完成样本核酸释放，在普通PCR的基础上，在PCR体系中加入特异性地荧光基团探针或染料，达到实时监控PCR扩增反应，扩增TGFBI基因的核酸片段，再以TaqMan探针法进行单核苷酸多态性分析。
本发明的TGFBI基因多态性快速检测试剂盒由核酸释放剂、探针混合物、2X反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品和超纯水组成；
所述的核酸释放剂由5～500mM Tris-HCl,、50～1000mM NaCl，0.1～10mM EDTA、质量/体积比为0.01％～2％的十二烷基磺酸钠(SDS)、质量/体积比为0.04％～3％的十二烷基硫酸锂(LLS)和质量/体积比为0.01％～2％的甜菜碱组成，其中的百分比以无菌水体积为计算基准；
所述的探针混合物是TGFBI基因的R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L或P501T位点引物探针，探针3’端的淬灭基团可以为：BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、Eclipse-2或Dabcy1-2，具体如下：
探针混合物#1：TGFBI基因R124H位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#2：TGFBI基因R555W位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3-Q'
VIC-5'-GTCTTTACCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3-Q'；
探针混合物#3：TGFBI基因R555Q位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3'-Q
VIC-5'-GTCTTAGCCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3'-Q；
探针混合物#4：TGFBI基因R124C位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCACCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#5：TGFBI基因R124L位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCACAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#6：TGFBI基因P501T位点引物探针：
上游引物：5’-CACGACAAGAGGGGGAGGTAC-3’
下游引物5’-AAGCTCCACCCGGGGA-3’
FAM-5’-GATGGACCGGGTGCTGACCCCCCCAA-3’-Q
VIC-5-CATCCATGACAGTCCCCATTGTGGGG-3’-Q；
所述的阳性质控品是人工合成包括R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点突变经一代测序验证无误的TGFBI基因质粒。
所述的阴性质控品是人工合成不包括R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点突变经一代测序验证无误的TGFBI基因质粒。
采用上述TGFBI基因多态性快速检测试剂盒进行检测的方法按照以下步骤进行：
(1)样本核酸释放：
所述的样本是口腔脱落细胞、全血样品或干血斑样本，样本与核酸释放剂比例任意，优选的体积比为：核酸快速释放剂：待处理样本＝1/10～1/100，具体步骤如下：
(a)口腔脱落细胞样本的核酸释放是将口腔刮棒直接用所述200μL核酸释放剂进行洗脱，震荡混匀；
(b)全血样品核酸释放是取50μL全血样品加入于含150μL超纯水的1.5mL离心管中，离心弃上清，再加入100μL核酸释放剂震荡重悬；
(c)所述的干血斑样本核酸释放是用3mm打孔器打取1片样品于1.5mL的离心管中，向离心管中加入500μL超纯水，震荡混匀，室温静置5min，离心，去除上清，再向离心管中加入200μL核酸释放剂；
将上述加有核酸释放剂的样本管置于金属浴中进行孵育、离心，得到样本核酸处理液；
(2)基因检测：
将上述样本核酸处理液加入到2X反应缓冲液中，并加入探针混合物形成PCR反应体系，涡旋混匀，置于荧光定量PCR仪上进行扩增并进行SNP基因分型检测，其中样本核酸处理液占PCR反应体系体积的5％～50％，各探针用量：5pM～500pM，引物用量：10pM～500pM。
所述的震荡是涡旋震荡。
所述的孵育是加热孵育，加热温度为80～100℃，孵育时间为5～30min。
所述的荧光定量PCR仪为：ABI 7500/7300/Stepone Plus、Roche LightCycler480或泰普/TIB-8300荧光定量PCR仪。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明是采用一种核酸快速释放剂，一步法完成口腔脱落细胞、全血样品以及干血斑样本中核酸的快速释放，获得的核酸可直接用于单核苷酸多态性TaqMan探针法检测，具有操作简便、使用安全，成本低廉，实验结果可重复性好等优点，适合在临床基因检测中推广应用。
本发明单核苷酸多态性检测方法采用TaqMan探针法检测，突破了传统的荧光染料法，提高了特异性，提高分型判读准确性，本发明对探针进行特异性地修饰，具有特异性、检测灵敏度高，避免分型判读出错；同时试剂盒中采用阳性质控品和阴性质控品，分别监控反应液体系和检测环境污染情况，避免出现误判情况出现。
本发明实现了对TGFBI基因单核苷酸多态性的快速检测，为眼部疾病的精准预防提供依据；本发明无需核酸提取，既节省成本，又提高了检测通量。
附图说明
图1是本发明实施例1中TGFBI基因R124H位点SNP检测三种分型散点图；
图2是本发明实施例1中TGFBI基因R555W位点SNP检测三种分型散点图；
图3是本发明实施例1中TGFBI基因R555Q位点SNP检测三种分型散点图；
图4是本发明实施例1中TGFBI基因R124C位点SNP检测三种分型散点图；
图5是本发明实施例1中TGFBI基因R124L位点SNP检测三种分型散点图；
图6是本发明实施例1中TGFBI基因P501T位点SNP检测三种分型散点图。
具体实施方式
本发明的一个优选实施方案，试剂盒组分如下(48人份为例)：
表1：TGFBI基因多态性快速检测试剂盒(48人份)
探针混合物#1：TGFBI基因R124H位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#2：TGFBI基因R555W位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3-Q'
VIC-5'-GTCTTTACCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3-Q'；
探针混合物#3：TGFBI基因R555Q位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3'-Q
VIC-5'-GTCTTAGCCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3'-Q；
探针混合物#4：TGFBI基因R124C位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCACCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#5：TGFBI基因R124L位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCACAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#6：TGFBI基因P501T位点引物探针：
上游引物：5’-CACGACAAGAGGGGGAGGTAC-3’
下游引物5’-AAGCTCCACCCGGGGA-3’
FAM-5’-GATGGACCGGGTGCTGACCCCCCCAA-3’-Q
VIC-5-CATCCATGACAGTCCCCATTGTGGGG-3’-Q；
本实施例中测试的荧光定量PCR仪为泰普/TIB-8300荧光定量PCR仪。
实施例1：
采用上述TGFBI基因多态性快速检测试剂盒进行TGFBI基因多态性快速检测按照以下步骤进行：
将刮有口腔脱落细胞的口腔刮棒直接放置到核酸释放剂中，震荡混匀，得到样本处理液，取样本处理液、每个位点三种基因型的阳性参考品和阴性参考品分别进行PCR反应体系的配制，瞬时离心。并置于荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增并进行单核苷酸多态性分析。
将试剂盒各组分恢复室温，震荡、瞬时离心，PCR反应体系按照下表中配比：
| 组分 | 体积 |
| 探针混合物 | PCR反应体系的0.5％～5％ |
| 2x缓冲液 | PCR反应体系的50％ |
| 样本处理液/阳性参考品/阴性参考品 | PCR反应体系的5％～45％ |
| 总体积 | 10～100μL |
PCR反应条件为：
本实施例的SNP基因分型检测按照以下步骤进行：
根据TGFBI基因单核苷酸多态性位点信息，人工分别合成：R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点的100％纯合突变型质粒(也可直接用试剂盒中的阳性质控品)和100％纯合野生型质粒，分别命名为纯合突变型质粒1、纯合突变型质粒2、纯合突变型质粒3、纯合突变型质粒4、纯合突变型质粒5、纯合突变型质粒6和野生型质粒1、野生型质粒2、野生型质粒3、野生型质粒4、野生型质粒5、野生型质粒6，且上述质粒经一代测序验证无误。
按照下表配比杂合突变型质粒1～6：
完成上述配制，获得每个位点三种基因型的参考品。
结果分析：如附图1～图6所示，应用本发明的方法对TGFBI基因的单核苷酸多态性检测，同一样本进行6个位点基因的单核苷酸多态性分析。从单核苷酸多态性位点上看，位点分型合理，仪器分型判读准确，与预期结果一致。
Claims (5)
1.一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒，其特征在于由核酸释放剂、探针混合物、2X反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品和超纯水组成；
所述的核酸释放剂由5～500mM Tris-HCl,、50～1000mM NaCl，0.1～10mM EDTA、质量/体积比为0.01％～2％的SDS、质量/体积比为0.04％～3％的LLS和质量/体积比为0.01％～2％的甜菜碱组成，其中的百分比以无菌水体积为计算基准；
所述的探针混合物是TGFBI基因的R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L或P501T位点引物探针，探针3’端的淬灭基团可以为：BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、Eclipse-2或Dabcy1-2，具体如下：
探针混合物#1：TGFBI基因R124H位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#2：TGFBI基因R555W位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3-Q'
VIC-5'-GTCTTTACCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3-Q'；
探针混合物#3：TGFBI基因R555Q位点引物探针：
上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'
下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'
FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3'-Q
VIC-5'-GTCTTAGCCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3'-Q；
探针混合物#4：TGFBI基因R124C位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCACCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#5：TGFBI基因R124L位点引物探针：
上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'
下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'
FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q
VIC-5'-TCTCAGGCCACAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；
探针混合物#6：TGFBI基因P501T位点引物探针：
上游引物：5’-CACGACAAGAGGGGGAGGTAC-3’
下游引物5’-AAGCTCCACCCGGGGA-3’
FAM-5’-GATGGACCGGGTGCTGACCCCCCCAA-3’-Q
VIC-5-CATCCATGACAGTCCCCATTGTGGGG-3’-Q；
所述的阳性质控品是人工合成包括R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点突变经一代测序验证无误的TGFBI基因质粒；
所述的阴性质控品是人工合成不包括R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点突变经一代测序验证无误的TGFBI基因质粒。
2.采用如权利要求1所述的TGFBI基因多态性快速检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)样本核酸释放：
所述的样本是口腔脱落细胞、全血样品或干血斑样本，样本与核酸释放剂比例任意，优选的体积比为：核酸快速释放剂：待处理样本＝1/10～1/100，具体步骤如下：
(a)口腔脱落细胞样本的核酸释放是将口腔刮棒直接用所述200μL核酸释放剂进行洗脱，震荡混匀；
(b)全血样品核酸释放是取50μL全血样品加入于含150μL超纯水的1.5mL离心管中，离心弃上清，再加入100μL核酸释放剂震荡重悬；
(c)所述的干血斑样本核酸释放是用3mm打孔器打取1片样品于1.5mL的离心管中，向离心管中加入500μL超纯水，震荡混匀，室温静置5min，离心，去除上清，再向离心管中加入200μL核酸释放剂；
将上述加有核酸释放剂的样本管置于金属浴中进行孵育、离心，得到样本核酸处理液；
(2)基因检测：
将上述样本核酸处理液加入到2X反应缓冲液中，并加入探针混合物形成PCR反应体系，涡旋混匀，置于荧光定量PCR仪上进行扩增并进行SNP基因分型检测，其中样本核酸处理液占PCR反应体系体积的5％～50％，各探针用量：5pM～500pM，引物用量：10pM～500pM。
3.根据权利要求2所述的检测的方法，其特征在于所述的震荡是涡旋震荡。
4.根据权利要求2所述的检测的方法，其特征在于所述的孵育是加热孵育，加热温度为80～100℃，孵育时间为5～30min。
5.根据权利要求2所述的检测的方法，其特征在于所述的荧光定量PCR仪为：ABI 7500/7300/Stepone Plus、Roche LightCycler480或泰普/TIB-8300荧光定量PCR仪。
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