CN101374850A - 用于角膜营养不良诊断的dna芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸。具体地，本发明涉及一种检测用于角膜营养不良诊断的BIGH3基因突变的寡聚核苷酸，所述角膜营养不良包括必须在视力矫正外科手术之前进行精确诊断的Avelllino角膜营养不良，本发明还涉及一种用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其具有固定于其上的寡聚核苷酸。根据本发明，角膜营养不良的常规显微诊断可被精确的遗传学方法代替，通过视力矫正外科手术防止了在错误诊断之后患有角膜营养不良的患者丧失视力。

Description

用于角膜营养不良诊断的DNA芯片

技术领域

本发明涉及用于角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸。具体地，本发明涉及用于检测角膜营养不良诊断的BIGH3基因突变的寡聚核苷酸，所述角膜营养不良包括必须在视力矫正外科手术之前进行精确诊断的Avelllino角膜营养不良，本发明还涉及用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其具有固定于其上的寡聚核苷酸。

背景技术

角膜营养不良是常染色体显性遗传疾病，其从角膜中心的模糊症状开始并逐渐扩散，因此随着患者变老最终会丧失视力。这种疾病包括Avellino角膜营养不良、颗粒状(Granular)角膜营养不良，格子状(Lattice)I型角膜营养不良、雷-布二氏(Reis-bucklers)角膜营养不良等等，并由编码βIG-H3的基因突变引起。

受到Avellino角膜营养不良困扰的杂合体患者随着变老表现出严重的视力丧失，而纯合体患者自6岁以后就完全丧失视力。Avellino角膜营养不良是一种在1988年新命名的疾病，其区别于一般称为Granular的角膜营养不良，因为发现其具有无联系的症状和遗传基础。并且已知其为世界上最常见的角膜营养不良，基于遗传分析在韩国1/340～1/1000的流行率(杂合体的情况)表明其为常见的营养不良(Holland，E.J.等人，Ophthalmology，99:1564，1992；Kennedy，S.M.等人，Br.J.Ophthalmol.，80:489，1996；Dolmetsch，A.M.等人，Can.J.Ophthalmol.，31:29，1996；Afshari，N.A.等人，Arch.Ophthalmol.，119:16，2001；Stewart，H.S.Hum.Mutat.，14:126，1999)。

本发明的发明人已经发现，如果Avellino角膜营养不良困扰的杂合体患者进行了LASIK外科手术，2年后，角膜的不透明性开始迅速增加(Jun，R.M.等人，Ophthalmology，111:463，2004)，并逐渐引起视觉丧失。之前，已进行眼睛外科手术，期望LASIK或者Eecimer激光外科手术能够使患者免除因角膜营养不良带来的视力模糊。而且，甚至在韩国，已经进行了大约30万例LASIK外科手术，基于最保守估计1/1000的受Avellino角膜营养不良困扰的杂合体患者，可假定即300人会导致丧失它们的视觉。进行了LASIK外科手术的患者主要在是在它们从事生产活动的20多岁和30多岁的年龄；因此，视觉丧失引起社会和经济两方面的严重问题。

另外，在2000年在美国正式批准LASIK外科手术之后，已经进行了LASIK外科手术的受到Avellino角膜营养不良困扰的美洲黑人(African American)患者已经被发现丧失视力，这表明大量类似情况可能在全世界发生。

因此，虽然需要精确诊断Avellino角膜营养不良来通过LASIK外科手术防止Avellino角膜营养不良，但Avellino角膜营养不良的诊断仅仅通过角膜透明度的显微镜观察来进行，因此医生常常忽视了患者需要进行LASIK外科手术的潜在症状，导致视觉丧失。因此，非常急迫地需要角膜营养不良的快速精确诊断。

因此，本发明的发明人已经付出了极大的努力来开发DNA芯片，以便迅速准确地检测引起角膜营养不良的BIGH3基因突变，结果，产生了包括BIGH3基因的特定突变区的探针，并制造了其上固定有探针的DNA芯片，并确保了可使用DNA芯片有效地诊断角膜营养不良，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供包括引起角膜营养不良的BIGH3基因的特定突变区的寡聚核苷酸。

本发明的另一目的在于，提供用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，在该芯片上固定了所述寡聚核苷酸。

为了实现上述目的，本发明提供了用于诊断角膜营养不良的寡聚核苷酸，其基本含有选自下组的一个或多个核苷酸序列，包括：：17，序列号：19，序列号：21，序列号：23，序列号：25，序列号：27，序列号：28，序列号：29，序列号：30，序列号：31，序列号：33，序列号：35，序列号：37，序列号：40，序列号：42，序列号：44，序列号：46，序列号：50，序列号：53和序列号：59。

在本发明中，基本包括核苷酸序列序列号：50的寡聚核苷酸优选在序列号：12中阐明，基本包括核苷酸序列序列号：53的寡聚核苷酸优选在序列号：13中阐明。

在本发明中，基本含有核苷酸序列序列号：59的寡聚核苷酸优选在序列号：15中阐明，基本含有核苷酸序列序列号：35的寡聚核苷酸优选在序列号：65中阐明。

在本发明中，寡聚核苷酸的长度为13bp到17bp。

本发明还提供了用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，在该芯片上固定了所述寡聚核苷酸。

在本发明中，用于诊断角膜营养不良的DNA芯片优选为另外在其上固定基本含有选自下组的一种或多种核苷酸序列的寡聚核苷酸，包括序列号：16，序列号：18，序列号：20，序列号：22，序列号：24，序列号：26，序列号：32，序列号：34，序列号：36，序列号：38，序列号：39，序列号：41，序列号：43，序列号：45，序列号：47，和序列号：56。

在本发明中，基本含有核苷酸序列序列号：47的寡聚核苷酸优选在序列号：11中阐明，基本含有核苷酸序列序列号：56的寡聚核苷酸优选在序列号：14中阐明，基本含有核苷酸序列序列号：34的寡聚核苷酸优选在序列号：62中阐明。

在本发明中，用于诊断角膜营养不良的DNA芯片具有固定于其上的所有寡聚核苷酸，基本含有选自下组的核苷酸序列：包括序列号：16至序列号：47，序列号：50，序列号：53，序列号：56和序列号：59。

本发明还提供了用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其具有固定于其上的由下组构成的所有寡聚核苷酸，包括序列号：11至序列号：15，序列号：62和序列号：65。

本发明还提供了一对选自下组的引物，包括序列号：1和序列号：2；序列号：3和序列号：4；序列号：5和序列号：6；序列号：7和序列号：8；以及序列号：9和序列号：10。

通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和实施方式将更完全明确。

附图说明

图1显示了DNA芯片上的点，以基于点样溶液来测定DNA芯片的检测效率。

图2显示了将来自正常个体的外显子4PCR产物应用到图1的DNA芯片之后的杂交结果。

图3显示了将来自杂合体Avellino角膜营养不良患者的外显子4PCR产物应用到图1的DNA芯片之后的杂交结果。

图4显示了将来自纯合体Avellino角膜营养不良患者的外显子4PCR产物应用到图1的DNA芯片之后的杂交结果。

图5显示了将来自杂合体雷-布二氏角膜营养不良(CD1)患者的外显子4PCR产物应用到图1的DNA芯片之后的杂交结果。

图6示出了被设计成基于探针浓度的DNA芯片的点布置。

图7显示了当使用图6的DNA芯片时根据每个患者的预期杂交结果。

图8显示了当使用图6的DNA芯片时基于每个引物组的杂交时间的杂交结果。

图9显示了基于探针长度的DNA芯片的杂交结果的图表。

图10示出了DNA芯片的点布置，以基于探针长度来评估DNA芯片的杂交效率。

图11显示了基于探针长度的DNA芯片的杂交结果。

图12示出了使用3 X SSC点样溶液制成50μM 15mer探针的DNA芯片的点布置。

图13显示了图12的DNA芯片的杂交结果。

具体实施方式

本发明的发明人已经注意到BIGH3基因突变引起具有角膜不透明症状的角膜营养不良的事实，并构建了基于在各种角膜营养不良患者中显示的BIGH3基因中的点突变来诊断每个角膜营养不良的探针，所述角膜营养不良例如为Avellino角膜营养不良，格子状角膜营养不良，颗粒状角膜营养不良，雷-布二氏角膜营养不良。

在本发明中构建的探针包括核苷酸序列序列号：11到序列号：67。

为了生产能够使用探针有效检测角膜营养不良的DNA芯片，检测了最佳点样溶液、用于固定的最佳时间和探针的最佳长度。因此，通过使用3X SSC作为点样溶液，以15mer探针通过6小时的杂交时间来检测患有角膜营养不良的患者中外显子4突变或者以17mer探针来检测外显子12突变分别产生了最佳结果。

下面的定义用于解释如下面阐明的本发明的不同实施方式中使用的术语和表达。

“分离的”核酸分子是从核酸的天然源中存在的其它核酸分子中分离的核酸分子。例如，有关基因组DNA，术语“分离的”包括从天然结合有基因组DNA的染色体分离的核酸分子。

术语“探针”或者“核酸探针”指的是单链和序列专一的寡聚核苷酸，其序列充分互补以与待检测的靶标核苷酸序列杂交。

“合成物”指的是与原核和真核基因序列互补的探针可以是纯化的核酸或者与其它探针结合。另外，探针可以以干燥状态与盐或者缓冲液结合，并且可以是在酒精溶液或者水溶液中的沉淀。

术语“靶标”指的是来自生物样品的核酸分子，其具有与本发明的核酸探针中任何一个互补的核苷酸序列。靶标核酸可以是单链或者双链DNA(任选地在扩增后得到)或RNA，并包括至少部分地与至少一个寡聚核苷酸探针互补的序列。

短语“生物样品”指的是样本诸如临床样品(例如脓、痰液、血液、尿液等)、环境样品、细菌菌落、污染或者纯净的培养物、纯化核酸等，感兴趣的靶标序列被限制在其中。

“寡聚核苷酸”指的是一般大约为10到大约100个核苷酸长度的核苷酸聚合物，但其长度可大于100或者短于10个核苷酸。

“核苷酸”指的是包括磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基的核酸的亚单位。在RNA中，5-碳糖为核糖。在DNA中，其为2-脱氧核糖。对于5-核苷酸来说，糖包括第二碳原子上的羟基(-OH)。该术语还包括在核糖的第二碳原子处的甲氧基相同的所述亚单位的类似物。

术语“同源性”与一致性同义，指的是多聚核酸例如90％同源是当序列排列时在相同位置具有90％的相同碱基对。

“杂交”涉及互补序列与其靶标核酸(待检测序列)退火。包括互补序列的两个核酸聚合物通过碱基配对作用彼此识别和退火的能力是公知现象。

术语“引物”指的是提供用于与待复制核酸链互补的产品的合成和延长的起始位点的DNA单链寡聚核苷酸序列。引物的长度和序列被建议为它们允许引发产物合成和延长的长度。优选地，引物大约长5-50个核苷酸。特定长度和序列将取决于靶标DNAs或者RNAs的组成以及引物使用的环境条件诸如温度和离子强度。

在本文中使用的术语“标记”指的是可被用于产生可检测(优选可定量)信号并与核酸连接的任何原子或分子。

标记可提供荧光、放射性、比色、重量测定、X-射线衍射或吸收、磁性以及类似的可检测信号。

“杂交”指的是在两条单链核酸序列之间通过Watson-Crick碱基配对或者互补碱基之间的非经典(non-canonical)碱基配对形成的复合。

短语“探针特异性”指的是探针的特性，描述了其区分靶标和非靶标序列的能力。从这个方面讲，术语“专一”的意思是核酸序列将与限定的靶标序列杂交，并且基本不与非靶标序列杂交或者极少与其杂交。探针特异性取决于序列和测定条件。

短语“标准菌株”包括从市场购买或者在本领域很容易获得的微生物。

探针识别

为了生产可检测各种原核或者真核基因序列的核酸探针，每个检测探针都需要对靶标序列专一。为此，进行了对每个靶标基因或者有机体专一的候选探针的筛选。

候选探针在包含它们的靶标序列的基因区域中选择。候选探针的特异性首先通过同源检索(BLAST search)来检查，比较每个核苷酸序列的同源性，通过在体外使用“靶标”进行杂交来确定。并且在候选探针中仅仅与靶标基因退火的探针最终被确定用于基因识别。

另外，通过上述步骤选择的探针对于基因识别的灵敏性通过使用各种生物样品的临床试验来进行检查。

本发明的探针为11-17mer寡聚核苷酸，优选与它们的待检测靶标序列具有70％、80％、90％或者95％以上的同源性并精确互补。本发明的用于检测并识别每个“靶标”探针长度可以是50个或者大于50个核苷酸。在本发明中使用的核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和修饰核苷酸诸如肌苷或者含有类似物基团的核苷酸，但不应当改变它们的杂交特性。

探针的利用

本发明的探针可被用于处于诊断目的研究生物样品中靶标核酸存在与否的所有良好认识的杂交技术，诸如在被称为“Dot-blot”的滤纸上的点点样(point-spotting)技术(Maniatis等人，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor，1982)，Southern杂交(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.98，503(1975))，或者Northern杂交。

本发明的探针还可被用于三明治杂交系统，增强基于核酸探针的检测的特异性。在基于核酸探针检测中三明治杂交的原理和步骤已经被描述(Dunn和Hassel，Cell，12：23-36；1977；Ranki等人，Gene，21：77-85；1983)。三明治杂交技术使用捕获探针和/或检测探针。这些探针可与它们的靶标核酸的两个不同区域杂交，并且至少一个探针(一般为检测探针)可与对靶标物种特异的靶标区域杂交。已经证明捕获探针和检测探针必须具有至少部分不同的核苷酸序列。

虽然直接杂交测定具有有利的动力学，但三明治杂交在高信噪比方面是有利的。此外，三明治杂交可提高以核酸探针为基础的测定的特异性。构成三明治杂交过程的关键步骤的温育和随后的洗涤步骤每次都在大约20℃和65℃之间的恒定温度下进行。已经知道，核酸杂交具有依赖于杂交碱基的数目(温度倾向于与杂交的尺寸成比例升高)的解链温度，并且该解链温度还依赖于杂交碱基以及它们相邻碱基的性质的。在三明治杂交技术中使用的杂交温度应当被选择成低于与给定探针及其互补靶标序列有关的半解链温度。并且温度可通过简单的常规试验来确定。

本发明的探针还可在竞争性杂交方案中被使用。在竞争性杂交中，靶标分子与特异性探针及其互补序列竞争以便杂交形成。存在的靶标越多，探针互补的杂交量变得越少。与没有靶标的系统相比，表示特异性探针存在的阳性信号在杂交反应中趋于降低。在特定实施方式中，通常被标记的特异性寡聚核苷酸探针与其靶标分子杂交。接着，混合物被转移到微孔板的孔中，在其中固定了互补的寡聚核苷酸和特异性探针，并允许保持所有杂交。洗涤后，互补寡聚核苷酸和探针的杂交被测定，优选基于使用的标记定量测定。

另外，本发明的探针可在反向杂交中使用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6230-6234，1989)。对于该方法，靶标序列可首先使用5’-生物素化的引物通过PCR进行酶扩增。在第二步，扩增的产物基于与固定在载体上的特异性寡聚核苷酸杂交进行检测。反向杂交还可在没有扩增步骤下进行。在该特定情况下，在杂交之前，生物样品中存在的核酸必须通过加入一些燃料或者化学反应而特异性或者非特异性地被标记或者修饰。

本发明的核酸探针可包括在试剂盒中，该试剂盒可应用于迅速确定感兴趣的致病样本存在与否。试剂盒包括对于确定靶标基因来说所有必须的成分。在通用概念中，试剂盒包括含有标记探针的稳定剂，干燥形式或者液体形式的用于杂交靶标和探针多聚核苷酸的杂交液，用于洗涤并除去不需要和未结合的多聚核苷酸的溶液，用于检测标记双链的底物以及任选地用于检测标记的仪器。

本发明的一种特定实施方式包括利用三明治测定概念的试剂盒。该试剂盒包括用于从患者收集样品的第一成分，包括刮擦装置或者纸尖、用作容器的小瓶以及用于分散并溶解样品的缓冲液。第二成分包括干燥或者液体形式的用于将靶标和探针多聚核苷酸杂交的培养基，以及用于洗涤以除去不需要和未结合多聚核苷酸的培养基。第三成分包括固相载体，未标记并与靶标多聚核苷酸的一部分互补的核酸探针结合于其上或者于其结合。在多靶标分析的情况下，一个以上的捕获探针，每个捕获探针对其自身的核糖体RNA专一，被应用到量杆的不同离散区域。

第四成分包括标记探针，其与来自与第三成分的固定和未标记核酸探针杂交的相同rRNA带的不同区域互补。在本文中描述的探针成分包括干燥形式诸如冻干的核苷酸或者沉淀形式诸如酒精沉淀的核酸或者缓冲液中沉淀的探针组合。标记可以是上述任何一种标记。

例如，探针可以使用常规方法生物素化，并且生物素化探针的存在可通过加入抗生物素蛋白结合的酶诸如辣根过氧化物酶，然后提供可视觉监测或者通过比色计或者分光光度计检测的过氧化物酶的底物来检测。与放射性标记方法相比，这种标记方法和其它酶结合的标记具有经济、高度灵敏以及相对安全的优点。配全了成分的试剂盒包括各种用于通过标记探针进行检测的试剂，操作说明，用于将阳性和阴性对照混合并反应的容器等。

DNA芯片

本发明的探针还在DNA芯片中使用。在优选实施方式中，本发明提供了核酸探针固定在其固相载体上的DNA芯片。安装有高密度各种核苷酸片段的狭窄载体的DNA芯片被应用，通过将从未知样品中提取的未知DNA与固定在其上的DNA来识别DNA信息。用于保持探针寡聚核苷酸的固相载体的例子包括无机材料诸如玻璃和硅、以及聚合材料诸如丙烯、聚乙烯对苯二酸盐(PET)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。固相载体的表面可以是平坦或高度多孔的。探针通过与基板上的3’-端或者5’-端共价结合而固定。固定可通过常规技术来实现，例如使用静电力、固定与醛包被的载玻片上的低聚体连接的胺、或者在胺包被的载玻片、赖氨酸包被的载玻片或者硝酸纤维包被的载玻片上点样。在本发明的一个实施例中，具有氨基的碱基在其合成过程中结合到探针的3’位置上，使其很容易共价结合到醛包被的载玻片上。

各种探针固定和设置到载玻片基板上通过针微阵列(pinmicroarray)、喷墨、光刻、电阵列等来进行。在本发明的实施方式中，探针独立地溶解在缓冲液中，得到的溶液通过使用由已知方法制备的微阵列仪(Yoon等人，J.Microbiol.Biotechnol.，10(1)，21-26，2000)在基板上点样。

微阵列的原理在于精密构建的针选取来自容器的探针DNA并输送到由计算机指定的一个位点。为了通过微阵列固定被输送的探针，在45％到65％优选50％到55％的潮湿条件下固定反应至少进行1小时，并将其静置至少6小时以诱导探针3’端氨基与包被在载玻片上的醛基之间的反应。

为了检测来自活的有机体的细胞或者活的有机体本身，细胞有时候需要部分或者全部通过化学和/或机械方法裂解，以便容易获得它们的RNA和/或DNA，然后将它们与本发明的一个或多个探针接触。接触可在合适的载体诸如溶液中的硝酸纤维、纤维或者尼龙滤纸上进行或者在液体培养基上进行，这可在亚最佳、最佳或者限制条件下进行。所述条件包括温度、反应物的浓度，降低核酸配对的最佳温度的物质的存在(例如甲酰氨、二甲基亚砜和尿素)，以及明显降低反应体积和/或加速杂交形成的物质的存在(例如硫酸葡聚糖、聚乙二醇或者苯酚)。

探针制备

传统的菌落方法可通过所需序列的基因操作产生大量的核酸探针，如Maniatis，T.等人在.Molecular Cloning中的描述：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1982，或者使用可从市场上购买的DNA合成仪化学合成。

本发明的探针可通过常规方法制成单链或者双链。制备单链探针的代表性例子是在二对甲氧基三苯甲基(DMT)方法之后通过自动DNA合成仪和脱模保护合成包括在的所需核苷酸数的探针。

在合成时，探针的一个末端用荧光染料(异硫氰酸荧光素，FITC)标记以确信感兴趣的核酸是否存在。作为替代，与单链DNA模板互补的DNA探针通过将引物与其模板DNA退火并使用已知的Klenow酶和荧光标记的dNTP聚合来制备。由于荧光染料，探针因而显示了高度的灵敏性和特异性。

为了制备双链探针，基因组DNA或者质粒DNA用特异性限制酶消化以得到包括所需基因区域或者核苷酸片断的探针。随机引物延伸方法是一种通过六个随机六聚物聚合具有各种长度的荧光标记探针的方式。作为替代，探针可通过使用T4核苷酸聚合酶将³²P与DNA的5’-端连接来合成，并且还可通过在双链DNA分子中以DNase I产生缺刻，以DNA聚合酶I和荧光标记的dNTP聚合DNA来生产。合成的双链探针变形使其变成单链，然后用于杂交。

本发明的探针可有利地被标记。任何常用标记都可被利用。探针可通过放射性示踪剂诸如³²P、³⁵S、¹²⁵I、³H和¹⁴C标记。放射性标记可根据任何常规方法进行，诸如在3’或者5’端使用放射性标记的核苷酸、核苷酸聚合酶、末端转移酶或者连接酶进行末端标记。

用于放射性标记的另一种方法是在探针上连接有数个¹²⁵I的本发明的探针的化学碘化作用。如果本发明的探针之一是放射性的，电离辐射的检测一般通过自动射线照相术、液体闪烁、γ计数或者任何其它常规方法进行。

本发明的探针可通过非放射性残基特征来标记：免疫学性质(例如抗原或者半抗原)；对于一些试剂的特异性亲和(例如配体)；通过酶反应的可检测性质(例如酶、辅酶、酶底物或者参与酶反应的中间物)；以及物理性质包括荧光、某些波长的光发射或吸收。抗体可被用于特异性检测探针和靶标的杂交。当本发明的探针是化学合成的时，非放射性标记可被提供。腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷很容易与其它化学残基连接，使得可对探针或者探针的杂交以及它们的互补DNA或者RNA片段进行检测。

靶标

核酸从样品中提取以提供用于诊断生物学样品的疾病的核酸底物。核酸可使用标准技术或者从市场上购买的试剂盒从各种临床样品中提取。例如，用于从组织样品中分离RNA或者DNA的试剂盒可购自Qiagen，公司(Chatsworth，CA，USA)和Stratagene(La Jolla，CA，USA)。例如，QIAamp血液提取试剂盒可从血液、骨膜、体液或者细胞悬液中分离DNA。QIAamp组织提取试剂盒可从组织诸如肌肉和器官中提纯DNA。

如果是双链，推荐将靶标DNA在进行检测之前变性。双链DNA的变性可通过化学、机械或者酶法加热到80℃以上的合适温度来进行。

与探针杂交的靶标DNA通常使用两种方法制备。第一种方法为Southern杂交法，其中基因组DNA或者质粒DNA以合适的限制酶消化，被消化的DNA片段使用琼脂糖凝胶电泳分离并纯化。第二种方法是通过PCR扩增所需DNA区域。

PCR的例子包括：使用等量的正向和反向引物的典型PCR；使用不同量的引物并产生双链带和单链带的非对称PCR；使用各种引物对并同时扩增不同区域的多重PCR；使用特定的4引物和连接酶通过ELISA(酶联免疫测定，Enzyme Linked Immunosorbent Assay)并测定荧光的连接酶链反应(LCR)；此外，热启动PCR，巢式PCR，DOP-PCR(变性寡聚核苷酸引物PCR，Denaturated oligonucleotide primer PCR)，RT-PCR(逆转录PCR，Reverse Transcription PCR)，半定量RT-PCR，实时PCR，RACE(cDNA末端的快速扩增，Rapid Amplification of cDNA Ends)，竞争性PCR，STR(短串联重复序列，Short Tandem Repeats)，SSCP(单链结构多态性，Single Strand Conformation Polymorphism，)，DDRT-PCR(差显逆转录酶，Differential Display Reverse Transcriptase)等等。

在本发明一优选实施例中，进行不对称PCR以使用从样品中提取的DNA作为模板聚合基因片段。基因片段通过使用1：5比例的不同量正向和反向引物进行一次PCR反应来聚合。

在PCR的优选实施例中，将5μl 10X PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂)，4μl dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP，dTTP，每种2.5mM)，0.5μl 10pmole正向引物，2.5μl 10pmole反向引物，1μl 1/10稀释的模板DNA(100ng)和0.5μl Taq聚合酶(5单位/μl，Takara Shuzo Co.，Shiga，Japan)混合并将蒸馏水加入到混合物中直至50μl。PCR通过下列步骤进行：首先在94℃下7min变性一次，在第二变性温度94℃下1min并循环10次，52℃下退火1min并在72℃下延伸1min；在第三变性温度94℃下1分钟并循环30次，52℃下退火1min并在72℃下延伸1min；然后在72℃下仅进行5min最后的延伸.PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来确认。

杂交和洗涤

特定杂交技术对本发明来说不是必须的。杂交技术一般在NucleicAcid Hybridization：A Practical Approach，Ed.Hames，B.D.和Higgins，S.J.，IRL Press，1987；Gall和Pardue(1969)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A，63：378-383，以及John，Burnsteil和Jones(1969)Nature，223：582-587中描述。

杂交条件通过“严格”也就是说操作条件的严格来确定。条件越严格，探针和靶标的杂交越特异。严格尤其表明探针/靶标双螺旋的碱基组成以及核酸之间的错配程度。严格可同样反映杂交反应的功能参数，诸如在杂交液中存在的离子浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。杂交条件的严格尤其依赖于使用的探针。有关条件的所有数据都是公知的，单个杂交的合适条件可通过常规实验来建立。关于探针长度，杂交反应温度一般大约在以下范围中，在大约20℃和65℃，特别是在大约0.8M到1M的盐溶液中在35℃和65℃之间。

标记寡聚核苷酸探针和核酸靶标的核酸杂交可通过使用在美国专利US5,030,557中公开的“未标记辅助探针”来增强。辅助探针为与核酸的另一区域结合的寡聚核苷酸，该另一区域不是测定探针靶向的区域。添加的探针的帮助反应加速了测定探针的结合，在单链核酸的靶向区域上形成新的第二和第三结构。

本领域技术人员将会理解，影响探针/靶标杂交的热稳定性的因素也影响探针的特异性。因此，探针/靶标杂交的熔解方案包括熔解温度(Tm)需要被确定。优选的方法在美国专利US5,283,174中描述。

探针/靶标杂交的Tm可通过如下杂交保护测定来确定。使用过量的靶标，探针/靶标杂交在含有十二烷基硫酸锂的琥珀酸锂缓冲液中形成。所“进行”的杂交的每等分在杂交缓冲液中被稀释并在不同温度下温育5分钟，一般从低于预期Tm(通常为55℃)之下增加2-5℃。溶液然后用弱碱性硼酸盐缓冲液缓冲并在更低温度下(例如50℃)温育10分钟。在这种条件下，在与单链探针连接的吖啶酯被水解的同时，与单链探针连接的吖啶酯被相对保护。这被称为杂交保护测定(HPA)。化学发光残余杂交量成比例，并在依次加入过氧化氢和碱之后在光度计中被测定。数据以最大信号(通常来自最低温度)的百分比对温度点样。

Tm由到达最大信号的50％的点来确定。作为替代，探针/靶标杂交的Tm也可通过本领域技术人员公知的同位素法来确定。应当注意，给定杂交的Tm可基于盐、去垢剂和杂交液中存在的其它溶质的浓度而变化，这些物质影响热变性过程中杂交的相对稳定性(Molecular Cloning：ALaboratory Manual Sambrook等人编著，Cold Spring Harbor Lab Publ.，9.51(第二版，1989))。

杂交条件可通过多个参数来监测，例如杂交温度、介质中成分的性质和浓度以及对杂交进行洗涤的温度。杂交和洗涤温度通过与探针的核酸组成相应的最大温度、组成和长度来限定，用于在本文中描述的探针杂交或洗涤的最大温度大约为30℃到60℃。在更高的温度处，双螺旋完成探针/靶标杂交的解偶联和变性。优选的杂交介质包括大约3X SSC(1XSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)，大约25mM pH 7.1的磷酸缓冲液，和20％去离子甲酰氨，0.02％Ficoll，0.02％牛血清蛋白，0.02％聚乙烯吡咯烷酮和大约0.1mg/ml剪切的变性沙门氏菌DNA。优选的洗涤缓冲液包括大约3X SSC，25mM pH 7.1的磷酸缓冲液和20％的去离子甲酰氨。但是，当修饰被引入探针或者介质中时，适于进行杂交进行所要求的特异性的温度应当基于在下列参照文献中的已知关系而变化：B.D.HAMES和S.J.HIGGINS，(编著).Nucleic acid hybridization.Apractical approach，IRL Press，Oxford，U.K.，1985。

在该方面，还应当注意，一般因为DNA：DNA杂交比RNA：DNA或者RNA:RNA杂交的稳定性差，它们的杂交条件需要仔细调节以实现给予杂交性质的专一检测。

在本发明的优选实施方式中，扩增的基因靶标片段被加入到杂交缓冲液(6X SSPE(0.15M NaCl，5mM C₆H₅Na₃O₇，pH 7.0)，20％(v/v)甲酰氨)中，施加到保持探针的载玻片上，然后在30℃下温育6小时，使所述探针可与所述靶标互补杂交。载玻片用3X SSPE，2X SSPE和1X SSPE顺序洗涤5分钟。

杂交可根据常规方法通过荧光化学或者放射性同位素标记靶标来定量。标记结合可通过在聚合和扩增过程中使用被标记引物或者被标记核苷酸来进行。

实施例

此后将通过实施例进一步详细描述本发明。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，这些例子仅仅用于说明的目的而被给出，本发明的范围并不被限制成这些例子或者由这些例子限定。

实施例中的所有下列实验由韩国Severance医院的IRB(InstitutionalReview Board)许可并根据知情同意(Helsinki)声明经每个参与者事先同意而进行。

实施例1：确定BIGH3蛋白的突变类型

为了构建用于测定BIGH3的基因突变的诊断探针，引起眼科疾病包括Avellino角膜营养不良的原因之一、其突变位点被确定以产生探针。

BIGH3蛋白的突变位点被识别，通过基因库和OMIM(OnlineMedelian Inheritance in Man)、NCBI核苷酸序列数据库(National Centerfor Biotechnology Information)来保证它们的氨基酸和核苷酸序列，并且每种疾病的等位基因信息被理解。待检查的突变类型被确定以测试DNA芯片的效力。尤其是在用于BIGH3基因突变的热点中，引起Avellino营养不良、格子状I型营养不良和雷-布二氏I的突变区域被选择(表1)。

表1.由BIGH3基因突变引起的眼科疾病

 

表现型	突变的氨基酸	序列变化	外显子
				Avellino营养不良	R124H	CGC→CAC	4
颗粒状营养不良	R555W	CGG→TGG	12

 

格子状营养不良	R124C	CGC→TGC	4
				格子状营养不良	L518P	CTG→CCG	12
格子状营养不良	L527R	CTG→CGG	12
				格子状营养不良	H626R	CAT→CGT	14
格子状营养不良	N622H	AAC→CAC	14
				格子状营养不良	N544S	AAT→AGT	12
格子状IIIA型	P501T	CCA→ACA	11
				格子状IIIA型	A546T	GCC→ACC	12
雷-布二氏I(雷-布二氏(CDB1))	R124L	CGC→CTC	4
				雷-布二氏	F540 缺失	TTT→---	12
雷-布二氏(CDB2)	R555Q	CGG→CAG	12
				雷-布二氏	G623D	GGC→GAT	14

实施例2：通过PCR获得检索区

为了检索表1中显示的所有突变，设计了包括外显子4、外显子11、外显子12和外显子14的5对引物。在这些引物中，两对引物被用于扩增外显子4的突变区。这两对引物中的一对(引物1和引物2)被认为适于诊断DNA芯片的实验，另一对被设计成用于直接DNA序列分析(引物3和引物4)。另外，DNA探针和它们待检索的互补引物(反向引物)在它们的5’羟基上标记上荧光化学物质。通过分别与引物2和引物4结合的Cy5和Cy3，那些引物对因此而有效地被区分。

表2：用于扩增包括突变位点的基因区域的引物

 

引物#	序列号.	序列(5＇->3＇)
			1	1	agc cct acc act ctc aa
2	2	cag gcc tcg ttg cta ggg

 

3	3	ccc cag agg cca tcc ctc ct
			4	4	ccg ggc aga cgg agg tca tc
5	5	ctc gtg gga gta taa cca gt
			6	6	tgg gca gaa gct cca ccc gg
7	7	cat tcc agt ggc ctg gac tct act atc
			8	8	ggg gcc ctg agg gat cac tac tt
9	9	ctg ttc agt aaa cac ttg ct
			10	10	ctc tcc acc aac tgc cac at

基因片段通过非对称PCR使用从血液中提取的10-100ng的DNA作为模板而产生，考虑PCR反应体积为总体积50μl。片段通过一次PCR反应使用1：5到1：10的比例的不同量的正向和反向引物聚合。第一次变性在98℃下5min。仅仅一次，然后主PCR通过在94℃下第二次变性1min，55℃下退火1min并在72℃下延伸1min来进行并循环35次。通过在72℃下保持7分钟用于最后一次延伸终止PCR。

实施例3：制造用于诊断BIGH3基因突变的探针

为了检索表1中显示的角膜营养不良的突变，设计了包含从热点两侧扩展5-8个更多核苷酸序列的探针，优选扩展7个更多的核苷酸。设计了用于正常对应部分的探针，包括与上述相同序列的但在中心突变的核苷酸序列被正常替代。

表3：构建的用于诊断眼科疾病突变的探针

 

序列号	基因型	正常/突变	探针序列	外显子
					11	正常	R124	acg gac cgc acg gag	4
12	Avellino营养不良	R124H	acg gac cac acg gag	4
					13	雷-布二氏(CDB1)	R124L	acg gac ctc acg gag	4

 

14	正常	R124	cac gga ccg cac gga	4
					15	格子状I型	R124C	cac gga ctg cac gga	4
16	正常	P501	gac ccc ccc aat ggg	11
					17	格子状111A型	P501T	gac ccc cac aat ggg	11
18	正常	L518	agc atg ctg gta gct	12
					19	格子状营养不良Pro	L518P	agc atg ccg gta gct	12
20	正常	L527	gca gga ctg acg gag	12
					21	格子状营养不良Arg	L527R	gca gga cgg acg gag	12
22	正常	F540	aca gtc ttt gct ccc	12
					23	雷-布二氏	F540缺失	ac aca gtc gct ccc ac	12
24	正常	N544	ccc aca aat gaa gcc	12
					25	格子状营养不良ser1	N544S	ccc aca agt gaa gcc	12
26	正常	N544	ccc aca aac gaa gcc	12
					27	格子状营养不良ser2	N544S	ccc aca agc gaa gcc	12
28	格子状营养不良ser3	N544S	ccc aca tct gaa gcc	12
					29	格子状营养不良ser4	N544S	ccc aca tcc gaa gcc	12
30	格子状营养不良ser5	N544S	ccc aca tca gaa gcc	12
					31	格子状营养不良ser6	N544S	ccc aca tcg gaa gcc	12
32	正常	A546	aaa tga agc cttc cga	12
					33	格子状111A型thr	A546T	aaa tga aac cttc cga	12
34	正常	R555	aag aga acg gag cag	12
					35	颗粒状营养不良	R555W	aag aga atg gag cag	12
36	正常	R555	aga gaa cgg agc aga	12
					37	雷-布二氏(CDB2)	R555Q	aga gaa cag agc aga	12
38	正常	N622	ggc cac aaa tgg cgt	14
					39	正常	N622	ggc cac aaa cgg cgt	14

 

40	格子状营养不良his	N622H	ggc cac aca cgg cgt	14
					41	正常	G623	aca aat ggc gtg gtc	14
42	雷-布二氏-1	G623D	aca aat gat gtg gtc	14
					43	正常	G623	caa acg gcg tgg tcc	14
44	雷-布二氏-2	G623D	caa acg atg tgg tcc	14
					45	正常	H626	gtg gtc cat gtc atc	14
46	14格子状营养不良	H626R	gtg gtc cgt gtc atc	14

实施例4：生产用于诊断角膜营养不良的DNA芯片

实施例3中的每个选择的探针被合成以应用于DNA芯片。将单核苷酸(Proligo Biochemie GmbH Hambrug Co.GE)以核苷酸顺序和输入模式注射到自动合成仪(Expedite TM 8900，PE Biosystems Co.USA)中，并聚合成0.05μM的纯核酸探针。得到的探针的合成通过电泳来确认。

为了将DNA探针固定在固相载体上，氨基-醛基共价结合被使用。合成的寡聚核苷酸探针的3’-端使用氨基连接臂(Cruachem，Glasgow，Scotland)修饰成插入氨基残基用于固定，并溶解在点样缓冲液(3X SSC；0.45M NaCl；15mM C₆H₅Na₃O₇，pH 7.0)中。使用微阵列仪将得到的溶液在醛基包被的载玻片(CEL Associates，Inc.Huston，USA)上点样，然后将玻片保持在超过55％的湿度条件下，允许氨基和醛基结合1小时以上，接着将DNA探针固定6小时。位置标记和每个探针分别以2-5μM and10-100μM的浓度被固定。为了评估固定的效率，将载玻片用SYBRO绿II(Molecular Probes，Inc.，Leiden，Netherlands)干燥。

实施例5：使用用于诊断角膜营养不良的DNA芯片对其进行诊断

为了确认探针的特异性和灵敏性，通过将实施例2中制备的PCR产物应用到捕获在实施例4中产生的探针的DNA芯片进行杂交。在与从患者或者正常个体的血液中提取的基因组DNA杂交之后，检验是否产生阳性杂交信号和与其它探针的交叉反应性(特异性)。

DNA芯片与水蒸气水合然后浸泡在70％的乙醇中以除去没有固定在DNA芯片的载玻片上的任何探针。将DNA芯片转移到封闭液(1.3gNaBH₄，375ml PBS，125ml 100％乙醇)中并震荡5分钟以便防止荧光化合物与玻璃表面上的醛基连接，这种连接可能导致总荧光的增加并引起专一的阳性信号减弱。DNA芯片然后用0.2％SDS洗涤5分钟，并用于无菌水接着洗涤2到3次，每次1分钟。通过离心除去保留在DNA芯片的玻璃表面上的液体(1,000rpm，2分钟)。

将10-20μl非对称PCR产物加入到杂交缓冲液[6X SSPE(0.9MNaCl，10mM NaH₂PO₄-H₂O，1mM EDTA，pH 7.4)或者20X SSPE(3MNaCl，0.2M NaH₂PO₄-H₂O，0.02M EDTA，pH 7.4)]，20％(v/v)甲酰氨(Sigma Co.，St.Louis USA)中至总量为200μl。将得到的混合物施加到探针固定于其上的载玻片上，并用探针夹压封(probe-clip press-seal)的温育室(Sigma Co.，St.Louis，MO)覆盖。

在30℃摇动培养箱中持续进行4-6小时的杂交反应，在杂交过程中通过在小室中设置湿的棉织物来防止玻璃周围的环境空气脱水以诱导互补结合。在杂交完成之后，相继用3X SPE(0.45M NaCl，15mMC₆HsNa₃O₇，pH 7.0)，2X SSPE(0.3M NaCl，10mM C₆HsNa₃O₇，pH 7.0)，然后用1X SSPE(0.15M NaCl，10mM C₆HsNa₃O₇，pH 7.0)洗涤玻片，每次5min。残留在DNA芯片的玻璃表面上的液体通过离心除去(1000rpm2min)。

通过DNA芯片扫描仪(基于CCD照相机的扫描仪，ArrayWoRx，Applied Precision LLC，USA)对杂交进行检测，暴光时间为0.2～0.5秒。在595nm处测定Cy3的荧光强度，在685nm处测定Cy5的荧光强度，并在530nm处测定FITC的荧光强度，测得的信号由ImaGene6.0软件(Biodiscovery Inc.，USA)解释。

实施例6：基于点样缓冲液的DNA芯片的检测效率

基于点样缓冲液对DNA芯片的检测效率进行评估，以便生产可选择性检测一个或两个核苷酸点突变的高效DNA芯片，用于诊断角膜营养不良。

以不同点样溶液制造DNA芯片，但这些点样溶液中都包含实施例4中产生的探针0.1M。在图1中所示的4个区域中左侧的2个区域上的探针用市售缓冲液(Telechem，USA)点样，上左侧的一个区域以3X SSC点样，上右侧的另一个区域用50％DMSO溶液点样。黄色区域代表检测正常个体的探针，粉红色和浅青色区域分别表示检测Aellino营养不良和雷-布二氏CD1的探针。

图2-图5显示了使用上述设计的DNA芯片和外显子4PCR产物的杂交结果。Cy5(红色)荧光代表通过施加以引物1和引物2扩增的PCR产物的结果，Cy3(绿色)代表引物3和引物4得到的结果。定位在右侧的盒代表比较结果，诸如图2中用于正常个体，图3中用于杂合体Avellino营养不良，图4中用于纯合体Avellino营养不良和图5中用于杂合体雷-布二氏CD1。

如图2-图5所示，以3X SSC点样产生最精确和清晰的信号，因此，在下列实施例中，所有杂交均以3X SSC进行。

实施例7：基于探针浓度和杂交时间的DNA芯片效率检测

DNA芯片的检测效率基于探针浓度和杂交时间被评估以便生产可选择性检测一个或两个核苷酸点突变的高效DNA芯片，用于诊断角膜营养不良。

DNA芯片通过将实施例4中以3X SSC生产的10-100μM探针点样来制造。如图6所示，一个DNA芯片被制造成包括两个区域。图7显示了基于患者的预期杂交结果。

图8显示了使用上述DNA芯片和引物组基于杂交时间的杂交结果。红点是以引物1和引物2扩增并以Cy5标记的PCR产物的杂交结果。杂交时间和施加的患者在每幅图中列出。

作为以引物1和引物2扩增的外显子4区域的PCR产物的结果，用于杂交的最佳条件证明探针浓度为30-50μM的探针，杂交时间建议为2-6小时，更优选4-6小时，最优选6小时。

实施例8：基于探针长度的DNA芯片检测效率

DNA芯片的检测效率基于探针长度被评估，以便生产可选择性检测一个或两个核苷酸点突变的高效DNA芯片，用于诊断Avellino角膜营养不良、雷-布二氏I角膜营养不良、格子状I型角膜营养不良和颗粒状角膜营养不良。

基于表3中列举的突变位点，基于引物11到引物15以及引物34和引物35的探针序列合成了不同探针长度诸如11mer、12mer、15mer和17mer。

 表4：用于确定最佳探针长度的探针序列

 

探针	长度h	序列	序列号.
					非ACD	111315	ggaccgcacggcggaccgcacggaacggaccgcacggag	474811	正常/杂合

 

	17	cacggaccgcacggaga	49
					ACD	11131517	ggaccacacggcggaccacacggaacggaccacacggagcacggaccacacggaga	50511252	Avellino
RBCD	11131517	ggacctcacggcggacctcacggaacggacctcacggagcacggacctcacggaga	53541355	雷-布二氏I
					非LCD I	11131517	cggaccgcacgacggaccgcacggcacggaccgcacggaacacggaccgcacggag	56571458	正常/杂合
LCD I	11131517	cggactgcacgacggactgcacggcacggactgcacggaacacggactgcacggag	59601561	格子状I型
					非GCD	15171616	aagagaacggagcagcaagagaacggagcagacaagagaacggagcagaagagaacggagcaga	34626364	正常/杂合
GCD	171616	caagagaatggagcagacaagagaatggagcagaagagaatggagcaga	656667	颗粒状型

以3X SSC点样液和实施例4中产生的50μM探针生产DNA芯片。

突变信号(M)与正常信号(W)的比值(M/W)由检测正常序列的探针点信号(W)与检测营养不良的探针的点信号(M)的比值来定义。并且该比值被优化并解释。如图9所示，Avellino角膜营养不良通过13mer探针非常成功地被检测，并且15mer探针也是非常有效的。雷-布二氏I角膜营养不良和格子状I型角膜营养不良通过15mer探针最有效地被检测。因此，用于Avellino角膜营养不良、雷-布二氏I角膜营养不良和格子状I型角膜营养不良的外显子4的突变区域的检测以15mer探针进行。在表4中，用于角膜营养不良的诊断DNA芯片的探针最佳长度通过粗体字强调。

含有外显子12中的点突变的颗粒状角膜营养不良的检测使用图10中的DNA芯片(图11)以17mer探针进行最有效。

实施例9：用于诊断应用的DNA芯片的杂交

基于实施例6、实施例7和实施例8的结果，DNA芯片的检测效率基于探针浓度和杂交时间被评估，以便生产可选择性检测一个或两个核苷酸点突变的高效DNA芯片，用于诊断角膜营养不良。

逐步地，以3X SSC点样溶液和50μM 15mer探针生产DNA芯片(图12)。图13显示了基于患者的预期杂交结果。

图13显示了使用上述生产的DNA芯片和以引物1和引物2扩增的患者的PCR产物的杂交结果。主题在每幅图中列出。本发明的DNA芯片在诊断中应用到患者确定了对于所有患者的精确诊断的可能性，并证明具有非常高的特异性以及灵敏性。

通过杂交的结果，生产了DNA芯片，其被应用于诊断眼科疾病，以15mer探针检测Avellino角膜营养不良、雷-布二氏I角膜营养不良和格子状I型角膜营养不良，以17mer探针检测颗粒状角膜营养不良。发现3X SSC中30-50μM探针被点样并在30℃下杂交6小时的过程产生了最佳诊断结果。并且该结果显示杂交可以比与探针长度对应的Tm高15-20℃的温度下进行的事实。因此，本发明的DNA芯片可通过控制由固定在芯片上的探针长度确定的杂交温度来处理，并用于角膜营养不良的诊断包括由BIGH3突变引起的Avellino角膜营养不良。

使用上述生产的用于诊断角膜营养不良的优化DNA芯片，来自98位患者的血样被检测以诊断角膜营养不良。结果，如表5所示，27位患者被证明是正常的，10位患者为纯合体Avellino角膜营养不良，57位患者为杂合体Avellino角膜营养不良，1位患者为杂合体格子状I型角膜营养不良，1位患者为杂合体雷-布二氏I型角膜营养不良，以及2位患者为颗粒状角膜营养不良。

表5：临床样品诊断结果

 

疾病	突变	突变位点	突变类型	外显子	患者编号
						Avellino	R124H	CGC→CAC	杂合体	外显子4	57
Avellino	R124H	CGC→CAC	纯合体	外显子4	10
						格子状I型	R124C	CGC→TGC	杂合体	外显子4	1
雷-布二氏I	R124L	CGC→CTC	杂合体	外显子4	1
						颗粒状型	R555W	CGG→TGG		外显子12	2
正常	无		正常		27
						总计					98

所述诊断结果通过临床样品的DNA序列分析来确认，证明其准确率为100％。

工业实用性

如上面详细描述的那样，本发明具有提供寡聚核苷酸的效果，该寡聚核苷酸包括引起角膜营养不良的BIGH3基因的突变区域，本发明具有提供诊断角膜营养不良的DNA芯片的效果，该DNA芯片具有固定在其上的寡聚核苷酸。根据本发明角膜营养不良的常规显微诊断可被精确地遗传学方法代替，通过视力矫正外科手术防止了在错误诊断之后患有角膜营养不良的患者丧失视力。

虽然已经参照特定特征对本发明进行了描述，但本领域技术人员将会理解，本说明书仅仅用于优选实施方式而不是用于限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由权利要求书及其等同物来限定。

序列表

Claims (14)

1.一种用于诊断角膜营养不良的寡聚核苷酸，其基本含有选自下组的一个或多个核苷酸序列，包括：序列号:17，序列号:19，序列号:21，序列号:23，序列号:25，序列号:27，序列号:28，序列号:29，序列号:30，序列号:31，序列号:33，序列号:35，序列号:37，序列号:40，序列号:42，序列号:44，序列号:46，序列号:50，序列号:53和序列号:59。

2.根据权利要求1所述的角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:50的所述寡聚核苷酸在序列号:12中阐明。

3.根据权利要求1所述的角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:53的所述寡聚核苷酸在序列号:13中阐明。

4.根据权利要求1所述的角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:59的所述寡聚核苷酸在序列号:15中阐明。

5.根据权利要求1所述的角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:35的所述寡聚核苷酸在序列号:65中阐明。

6.根据权利要求1所述的角膜营养不良诊断的寡聚核苷酸，其特征在于，寡聚核苷酸长度为13bp到17bp。

7.一种用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，在DNA芯片的基板上固定有权利要求1到6中任一项所述的寡聚核苷酸。

8.根据权利要求7所述的用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，另外在其上固定基本含有选自下组的一种或多种核苷酸序列的寡聚核苷酸，包括序列号:16，序列号:18，序列号:20，序列号:22，序列号:24，序列号:26，序列号:32，序列号:34，序列号:36，序列号:38，序列号:39，序列号:41，序列号:43，序列号:45，序列号:47和序列号:56。

9.根据权利要求8所述的用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:47的所述寡聚核苷酸在序列号:11中阐明。

10.根据权利要求8所述的用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，基本含有核苷酸序列序列号:56的所述寡聚核苷酸在序列号:14中阐明。

11.根据权利要求8所述的用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，所述寡聚核苷酸基本含有核苷酸序列序列号:34的所述寡聚核苷酸在序列号:62中阐明。

12.根据权利要求7所述的用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，DNA芯片固定有所有寡聚核苷酸，寡聚核苷酸基本含有由下组构成的核苷酸序列：序列号:16至序列号:47，序列号:50，序列号:53，序列号:56和序列号:59。

13.一种用于诊断角膜营养不良的DNA芯片，其特征在于，其上固定有所有寡聚核苷酸，寡聚核苷酸包括由下组构成的核苷酸序列：序列号:11至序列号:15，序列号:62和序列号:65。

14.一对选自下组的引物，包括序列号:1和序列号:2；序列号:3和序列号:4；序列号:5和序列号:6；序列号:7和序列号:8；以及序列号:9和序列号:10。

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