CN102648291A - 用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片及其制备方法 - Google Patents

用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，更具体地，本发明涉及能够采用LSPR(局域表面等离子体共振)光学特性的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片、其制备方法，以及用于诊断BIGH3基因突变的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，该芯片能够诊断多种角膜营养不良。根据本发明，该金属封端的纳米结构阵列核酸芯片能够与包括光源、检测器、分光光度计和计算机的分析装置组合以提供没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，并且该多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片在诊断BIGH3基因突变中的应用使得能够同时诊断作为遗传性眼病的多种角膜营养不良。

Description

用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，更具体地，本发明涉及能够采用LSPR(局域表面等离子体共振)光学特性的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片、其制备方法，以及用于诊断BIGH3基因突变的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，该芯片能够诊断多种角膜营养不良。 
背景技术
角膜营养不良是常染色体显性遗传疾病，其中在角膜中心产生阴影并且阴影随着年龄而增加，使视力下降。角膜营养不良包括Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)和Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)，并且是由于编码BIGH3蛋白的基因突变所引起的。具有杂合性Avellino角膜营养不良的患者随着年龄增长经历明显的视力丧失而纯合性Avellino角膜营养不良的患者从6岁就丧失它们的视力。Avellino角膜营养不良以前被普遍称作颗粒状角膜营养不良，但是发现其具有遗传差异并且在1988年进行了新的命名。Avellino角膜营养不良是世界范围内最常见的角膜营养不良，并且基因检测的结果表明Avellino角膜营养不良(杂合性)是显著多发性疾病，其在韩国的患病率为1/340至1/1,000(Holland，E.J.et al.，Ophthalmology，99：1564，1992；Kennedy，S.M.et al.，Br.J.Ophthalmol.，80：489，1996；Dolmetsch，A.M.et al.，Can.J.Ophthalmol.，31：29，1996；Afshari，N.A.et al.，Arch.Ophthalmol.，119：16，2001；Stewart，H.S.Hum.Mutat.，14：126，1999)。 
发现，当患有杂合性Avellino角膜营养不良的患者接受激光眼科手术时，角膜阴影在手术后2年开始迅速增加，造成失明(Jun，RM et al.，Ophthalmolgy，111：463，2004)。因此，在执行激光眼科手术前，应对Avellino角膜营养不良患者执行准确的诊断以便防止由激光眼科手术造成的症状进一步发展。然而，眼科医生通过用显微镜检查眼部阴影来诊断Avellino角膜营养不良，因此，在一些 情形下，没有产生Avellino角膜营养不良症状的患者就不会被发现并进行激光眼科手术，从而失去了视力。因此，迫切需要用于诊断Avellino角膜营养不良的准确且快速的方法。 
为了快速诊断BIGH3基因的特异突变以诊断角膜营养不良，包括Avellino角膜营养不良，本发明人开发了用于检测BIGH3基因突变的寡核苷酸，以及用于诊断角膜营养不良的核酸芯片，该核酸芯片上固定有该寡核苷酸(韩国专利申请公开号10-207-0076532)。然而，这类核酸芯片的问题在于用于检测目标DNA的标记操作复杂，测量时间长并且测量系统尺寸大，使得难于以简单容易的方式执行测量。 
为了尝试解决基于标记操作的核酸芯片的问题，制造了一种新型的基于局域表面等离子体共振(LSPR)，这种只在纳米结构展示的新型光学特性的无标记生物芯片。当用具有不同波长的光辐射具有局部表面的材料例如金属纳米颗粒时，不同于块状金属，该金属纳米颗粒的表面被极化，并且电场强度增加。通过极化形成的电子形成等离子体并且在金属纳米颗粒的表面上局部振荡。这一现象被称作LSPR。LSPR光学特性灵敏地响应在纳米颗粒附近发生的介电系数的变化，即折射系数的变化，并因此使得相比于使用石英晶体微天平(QCM)或电化学方法的无标记生物传感器，能够以简单的方式高灵敏性地分析生物分子相互作用。此外，LSPR光学特性在可见光区显示出吸收峰，并因此使得能够通过比迄今开发的使用SPR光学特性的无标记生物传感器更简单的光学体系来分析生物分子的相互作用。因此，不同于常规生物芯片，基于LSPR光学特性作为检测原理并具有多种固定在单生物芯片上的配体的生物芯片能够同时分析多个分析物，并因此能够进行无标记生物芯片所需的现场(原位)监测。 
随着基于金纳米颗粒阵列生物芯片的LSPR传感器的兴起，日本RIKEN的Okamoto小组将金纳米颗粒固定在玻璃基底上并报道了观察LSPR特性随着液体样品的折射率改变而改变的结果(T.Okamoto et.al.，Optics Letters，25：374，2000)。美国杜克大学的Nath和Chilkoti小组使用相同的技术开发了基于金纳米颗粒阵列生物芯片的LSPR生物传感器(N.Nath and A.Chilkoti，Anal.Chem.，74：509，2002)并且报道了实时观察生物分子相互作用的结果(N.Nath and A.Chilkoti，Anal.Chem.，74：509，2002)。此外，他们观察到测量灵敏性根据金纳米颗粒的尺寸的改变，由 此成功地优化了金属纳米颗粒阵列生物芯片。然而，这类LSPR生物芯片的问题在于制造金属纳米颗粒的工序复杂且耗时，难以制造具有多种尺寸的金属纳米颗粒，并且纳米颗粒不规则地被固定，使得难以确保再现性。 
在尝试解决这些问题时，日本JAIST和Osaka大学的E.Tamiya小组对开发基于2004年的新型结构的金属纳米颗粒阵列生物芯片的LSPR生物传感器进行了研究并且开发了金属封端的纳米颗粒阵列生物芯片，其通过将均匀大小的二氧化硅纳米颗粒固定在玻璃基底上然后在所排列的纳米颗粒表面上沉积金属至不同厚度，能够展现出与在基底表面排列不同尺寸的纳米颗粒相同的效果(日本专利申请公开号No.P2006-250668A)。此外，E.Tamiya小组证明了该纳米颗粒阵列生物芯片能够应用为没有基于LSPR光学特性标记的光学传感器，该传感器能检测生物分子，包括DNA、RNA、肽和蛋白质之间的相互作用。然而，这类基于LSPR的生物传感器仍旧具有制造时间长且难于同时测量多个分析物生物分子并区别多个生物分子的问题。 
因此，本发明人进行了广泛的努力来使用现有技术的上述多种特性解决现有技术中存在的上述问题，并且因此制造了用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片能够使用LSPR光学特性，通过单芯片来同时检测多个分析物DNA，并且发现该用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片能够一次检测多个目标核酸，由此完成了本发明。 
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，该芯片能够使用LSPR光学特性通过单芯片来同时检测多个分析物核酸。 
本发明的另一目的是提供一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，该芯片能够执行对于具有BIGH3基因突变的DNA的多重检测和量化用于诊断包括Avellino角膜营养不良的角膜营养不良，所述角膜营养不良应在视力矫正手术前使用核酸芯片被准确地诊断。 
为了实现上述目的，本发明提供一种制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，所述方法包括步骤：(a)在基底(第一层)上形成金属薄膜层 (第二层)；(b)在该金属薄膜层(第二层)上形成多点并且在所述多点的各表面上以恒定间隔排列纳米结构以形成纳米结构层(第三层)；(c)在该纳米结构层上形成金属薄膜层(第四层)；以及(d)在该金属薄膜层(第四层)上固定探针核酸。 
本发明提供一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片是通过上述方法所制备的，并且所述核酸芯片包括：(a)基底(第一层)；(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；(c)纳米结构层(第三层)，所述纳米结构层(第三层)包括在该金属薄膜层上形成的多点以及以恒定间隔排列在所述多点的各表面上的纳米结构；(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的探针核酸。 
本发明也提供一种检测目标核酸的方法，所述方法包括：使目标核酸与所述用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；以及向该多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。 
本发明也提供一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片包括：(a)基底(第一层)；(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；(c)纳米结构层(第三层)，该纳米结构层(第三层)包括在该金属薄膜层上形成的多点以及以恒定间隔排列在所述多点的各表面上的纳米结构；(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的用于检测BIGH3基因突变的探针核酸。 
本发明也提供一种检测BIGH3基因突变的方法，所述方法包括：使临床样品与所述用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；以及向该多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。 
通过下面详细说明和所附权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加显而易见。 
附图简要说明 
图1是示出根据本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的实例的示意图，并且是多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的一组照片。 
图2是包括根据本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性的标记的生物传感器。 
图3是示出将探针DNA固定在根据本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片上的方法以及通过使目标DNA与探针DNA反应来诱导互补结合的工序的示意图。 
图4示出使用包括根据本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性的标记的光学生物传感器，测量作为正常目标DNA和Avellino角膜营养不良(ACD)、Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)以及格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)的目标DNA各者长度的函数的核酸芯片的检测效力结果。 
图5示出使用预测程序(GeneBee)，根据结合探针DNA的各目标DNA的长度，执行用来预测二级结构的模拟测试的结果。通过Greedy方法获得作为目标DNA长度的函数而预测的二级结构，并且在作为各目标DNA长度函数而预测的二级结构中示出的红色椭圆部分表明目标DNA的结合位点，所述位点能够与探针DNA的结合位点互补结合。 
图6示出使用包括根据本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性的标记的光学生物传感器，测量作为正常目标DNA和Avellino角膜营养不良(ACD)、Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)以及格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)的目标DNA各者浓度的函数的核酸芯片的检测效力结果。 
图7示出使用包括本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性的标记的光学生物传感器，测量本发明的核酸芯片对正常目标DNA和纯合性及杂合性角膜营养不良(ACD、RBCD和LCD)的目标DNA各者的选择性检测的检测效力结果。 
图8示出使用包括本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性的标记的光学生物传感器，测量本发明的核酸芯片对正常目标DNA和纯合性及杂合性角膜营养不良(ACD、RBCD 和LCD)的目标DNA各者的选择性检测的检测效力结果。 
最佳实施方式 
除非另有定义，否则在此使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员的常规理解相同的含义。总体上，在此使用的术语和实验方法是本领域公知且常规采用的。 
在一方面，本发明涉及一种制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，所述方法包括步骤：(a)在基底(第一层)上形成金属薄膜层(第二层)；(b)在该金属薄膜层(第二层)上形成多点并且在所述多点的各表面上以恒定间隔排列纳米结构以形成纳米结构层(第三层)；(c)在该纳米结构层上形成金属薄膜层(第四层)；以及(d)在该金属薄膜层(第四层)上固定探针核酸。本发明也涉及一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片是通过上述方法所制备的，并且所述核酸芯片包括：(a)基底(第一层)；(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；(c)在该金属薄膜层上形成的纳米结构层(第三层)，所述纳米结构层(第三层)包括多点以及以恒定间隔排列在所述多点的各表面上的纳米结构；(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的探针核酸。 
在本发明中，能够使用真空沉积体系等在多点型纳米结构层(第三层)上形成金属薄膜层(第四层)，并且纳米结构层(第三层)能够使用例如，多孔罩固定在金属薄膜(第二层)上以便能够形成多点。 
在本发明中，纳米结构层(第三层)可具有单一结构，并且探针核酸可由多个能够识别多个目标DNA的探针DNA组成。 
在本发明中，基底可由选自下组的材料制造：玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯、硅和石英。上述基底并不显示出极化各向异性并且具有优异的可加工性。特别地，该玻璃、聚苯乙烯、PET和聚碳酸酯基底是对白光透明的。当基底表面具有颜色时，入射的白光将从基底表面被反射并且将影响光学特性如LSPR特性。为此原因，优选使用具有透射入射的白光而不反射该入射的白光这样的特性的透明基底。 
在本发明中，基底的厚度可在0.1mm和20mm之间，这是目前为止被制造 的或者被介绍的最小厚度和最大厚度。 
根据本发明的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的金属薄膜层(第二层和第四层)并没有特别限定，只要能够通过产生局域表面等离子体共振而获得它们即可。例如，这些层可由选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铝(Al)、铂(Pt)、镍(Ni)、锌(Zn)组成组的金属以及它们的混合物所制造。另外，由于LSPR光学特性而产生的吸收谱峰的波长区根据在以恒定间隔排列的纳米结构(第三层)的表面上的金属薄膜层的厚度而变化。因此，能够制造新型的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，该核酸芯片能够在多个可见光区反应。 
根据本发明的多点金属封端的纳米结构核酸芯片的金属薄膜层(第二层和第四层)的形成能够通过溅射、蒸汽沉积、离子镀、电镀、化学镀等来执行。金属薄膜层(第二层和第四层)的厚度能够根据第三层的纳米结构的形状、尺寸和排列状态来任选地确定。例如，在纳米结构是100-nm球形颗粒的情形下，第二层和第四层优选形成为分别具有30nm至50nm以及20nm至40nm的厚度。 
根据本发明的多点金属封端的纳米结构核酸芯片“以恒定间隔排列的纳米结构的层”意指纳米尺寸的结构以恒定间隔排列。该纳米结构不影响LSPR光学特性，并因此没有特别限制。例如，该纳米结构可选自由纳米颗粒、纳米点、纳米岛、纳米棒和纳米线组成的组。 
可使用多孔罩以便本发明的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的纳米结构层(第三层)形成为多点的形式。该多孔罩附着金属薄膜层以便纳米结构只在穿过罩表面形成的孔中以恒定间隔来排列，并且多孔形成在金属薄膜层(第二层)的表面上。可用于本发明的多孔罩可选自由橡胶平板、硅平板以及它们的混合物所组成的组。该多孔罩通过使用冲床等穿过平板表面形成孔来制备。 
在本发明中，多孔罩的孔数可在1和150之间，这是目前为止被制造的或者被介绍的多孔罩的孔数的最小值和最大值。 
在多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的金属薄膜层(第二层)上以恒定间隔排列的第三层的纳米结构能够通过在金属薄膜层(第二层)上使用4，4′-二硫代二丁酸(DDA)形成具有羧基的自组装单层(SAM)膜，在纳米结构表面上使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APTES)固定胺基，然后在SAM膜和胺基之间形 成共价键来执行。 
当用光来辐射多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面时，将在核酸芯片上发生极化，并且通过极化形成的电子将形成等离子体并在核酸芯片的表面上局部振荡，由此产生LSPR光学特性。 
本发明的一种或多种探针核酸的固定能够使用本领域常规用来固定核酸的核酸固定方法来执行。探针核酸没有限制，只要它们能够特异地结合样品中的目标核酸或者候选目标核酸并且能够被固定在金属膜上即可。探针核酸在多点金属薄膜层(第四层)上的固定优选地通过物理吸附或化学结合来执行。 
用于检测遗传信息的探针核酸是原核或真核的或者源于原核或真核细胞，它们应只对待检测的目标核酸具有特异性。为了构建此种探针核酸，首先选择一组用于各目标基因或组织的候选探针核酸。 
在目标核酸定位的基因部分内确定该组候选探针核酸。通过用BLAST检索比较碱基序列之间的相似性来确定候选探针核酸是否具有特异性，将应力应用于杂交反应，并且选择只与各目标基因反应的探针核酸用于候选组的鉴定。此外，将上面选择的用于鉴定的探针核酸应用于多种生物样品的临床检测以测定它们的灵敏性。 
根据本发明所选择的探针核酸是13-17mer寡核苷酸并且与待检测的目标物的完整互补序列优选具有70％、80％、90％、95％或更高的同一性。根据本发明用于检测和鉴定各目标物的核酸探针可包括50或更多个寡核苷酸。 
用于本发明的核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸以及被修饰的核苷酸，例如含有肌苷或修饰碱基的核苷酸，但是这些不应影响杂交特性。 
在另一方面，本发明也涉及多重诊断(multi-diagnosis)方法，所述方法包括步骤：使用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片与包括多个具有BIGH3基因突变的核酸的目标核酸相接触，并且执行该核酸的多重检测和/或定量分析，该芯片上固定有探针核酸。 
如在此所使用，术语“目标核酸”指能够特异地结合探针核酸的核酸。候选目标核酸是能够被预测为特异地结合探针核酸的核酸，并且特异的候选目标核酸与目标核酸相同。样品指含有目标核酸或候选目标核酸的溶液。样品的实例包括但不限于，血液、唾液、尿液、鼻血、眼泪、排泄物、组织提取物、肉汤培养物等等。 
为了提供本发明的用于在生物样品中诊断疾病的核酸基底，从该样品中提取目标核酸。能够使用标准技术或市售可得的试剂盒从多种样品提取DNA。例如，用于从组织样品分离RNA或DNA的试剂盒能够购自Qiagen，Inc.(USA)和Stratagene(USA)。QIAAMP血液试剂盒能够从血液、骨髓、体液或细胞悬液中分离DNA。QIAAMP组织试剂盒能够从肌肉和器官中分离DNA。如果目标核酸是双股链，那么优选在进行检测工序前执行变性。单股DNA的变性能够通过用于化学、物理或酶促变性的已知方法来执行。优选地，这能够通过加热至适当的温度，优选80℃或更高来执行。 
另外，与探针核酸杂交的目标核酸通常能够通过两种方法来制备。第一种方法是在Southern印迹或Northern印迹中使用的方法，其中基因组DNA或质粒DNA被适当的限制性酶消化然后在琼脂糖凝胶上电泳以根据大小来分离DNA片段。第二种方法是通过PCR扩增想要的DNA部分的方法。 
可用于本发明的PCR法的实例包括使用等量的正反向引物执行扩增的最常见的PCR法，能够通过不匀称地添加正反向引物而同时获得双股条带和单股条带的不对称PCR法，能够一次使用多种引物对来执行扩增的多重PCR法，使用4个特异引物以及连接酶执行扩增然后通过酶联免疫检测法测定萤光性的连接酶链反应(LCR)法，以及热启动PCR、巢式PCR、修饰的寡核苷酸引物PCR、反转录酶PCR、半定量反转录酶PCR、实时PCR、SACE(cDNA端的快速扩增)、竞争PCR、短串联重复(STR)、单链构象多态性(SSCP)、原位PCR、DDRT-PCR(差异显示反转录酶PCR)等等。 
在本发明优选的实施方式中，使用分离的分析物的DNA作为模板来执行不对称PCR，由此构建片段基因。片段基因是使用一步PCR通过以1∶5的比例添加正向引物和反向引物而获得的。 
在本发明优选的实施方式中，使用含有5μl的10 X PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2)，4μl的dNTP混合物(2.5mM的各dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，0.5μl的10pmole正向引物，2.5μl的10pmole反向引物，1μl的模板DNA(100ng)的1/10稀释液，0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl，Takara Shuzo Co.，Shiga，Japan)并且加入水得到50μl总体积，按下面的条件：94℃初始变性7min；然后94℃二次变性1min；52℃退火1min并在72℃延伸1min，10个循环；随后在94℃变性1min，54℃退火1min并且72℃延伸1 min，30个循环；以及72℃最终延伸5min，执行PCR反应。通过琼脂糖凝胶电泳来确认PCR反应产物。 
在另一方面，本发明涉及检测目标核酸的方法，所述方法包括：使目标核酸与上述用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；并且向该多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。 
本发明的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片能够与分析装置组合，以提供没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，该传感器能够执行与芯片表面附着的核酸的多重检测和量化，所述分析装置包括光源、检测器、分光光度计和诸如计算机的分析装置。 
在又另一方面，本发明涉及用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片包括：(a)基底(第一层)；(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；(c)在该金属薄膜层上形成的纳米结构层(第三层)，所述纳米结构层(第三层)包括多点以及以恒定间隔排列在所述多点的各表面上的纳米结构；(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的用于检测BIGH3基因突变的探针核酸。 
在本发明中，用于检测BIGH3基因突变的探针核酸可必然含有选自由SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：46组成组的一种或多种碱基序列。 
在本发明中，SEQ ID NOS：11至46是能够确认在造成眼病的BIGH3基因突变热点中造成Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)和Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)的突变点的突变的探针核酸。 
在又另一方面，本发明涉及检测BIGH3基因突变的方法，所述方法包括：使临床样品与权利要求16所述用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；并且向该多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。 
在本发明中，临床样品的实例可包括但不限于血液、唾液、尿液、鼻血、眼泪、排泄物、组织提取物、肉汤培养物等等。 
本发明多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片在诊断BIGH3基因突变中的应用使得能够选择性地检测纯合性与杂合性角膜营养不良的所有目标核酸的互 补目标核酸以及错配目标核酸。 
实施例
下文，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员显而易见的是这些实施例仅仅是说明的目的而不应被理解为限制本发明的范围。 
下面实例中的所有实验都是在按照赫尔辛基宣言获得所有志愿者的知情同意后经Yonsei Severance Hospital伦理审查委员会批准而进行。 
实施例1：用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的制备
使用真空沉积体系(Shinu MST Co.，Ltd.，Korea)将铬和金各真空沉积在载玻片基底(第一层，75mm×25mm×1mm)表面上，由此形成金薄膜层(第二层)。具体地，铬作为中间金属薄膜沉积为5nm的厚度，并且金薄膜层的厚度可被控制为40nm。然后，将多孔罩(15、20、60或140点)通过吸附固定到金薄膜层(第二层)上。然后，在其上吸附了多孔罩的金薄膜层(第二层)的表面上，使用1mM 4，4′-二硫代二丁酸(DDA)形成SAM膜。然后向金薄膜层(第二层)的表面添加400mM EDC，并对被引入到表面上的羧基执行活化，此后通过共价键结将用3-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APTES)进行表面修饰的直径100nm的二氧化硅纳米结构排列在金薄膜层(第二层)的表面上。然后，在由直径100nm的二氧化硅纳米结构阵列组成的纳米结构层(第三层)的表面上，金被真空沉积到30nm的厚度，由此制备具有多个点数的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片(图1)。 
实施例2：包括用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片没有基于LSPR光学特性标记的光学生物检测器的构建
图2示出了包括按上面所述制备的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物检测器的照片。包括用于诊断角膜营养不良的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物检测器包括卤钨光源(波长：360nm-2000nm，Ocean Optics，Inc.，USA)、检测器(波长：300nm-1100nm，Ocean Optics，Inc.，USA)、用于分开检测器所检测的光的分光光度计(波长：200nm- 1100nm，Ocean Optics，Inc.，USA)以及用于处理分光光度计中获得的结果的分析/处理程序(Ocean Optics，Inc.，USA)。在此，卤钨光源和检测器被包括在一个光源探针中。从没有基于LSPR光学特性标记的光学生物检测器中发射的入射光能够垂直入射到多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面上，然后所反射的光通过检测器被检测到、通过分光光度计被分开并通过分析/处理程序来分析，由此测量用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的吸收谱。 
实施例3：BIGH3基因突变类型的确定
为了构建用于诊断负责眼病，包括Avellino角膜营养不良的BIGH3基因中突变的探针，确定用于构建该探针的BIGH3基因突变位点。通过NCBI涉及基因的数据库GenBank和OMIM(在线孟德尔人类遗传学数据库)来分析并获得BIGH3基因突变位点的DNA碱基序列和氨基酸序列，并且也获得各等位基因的信息。为了检测诊断芯片的效力，首先确定待检索的突变类型。在BIGH3基因热点中，选择造成Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)和Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)的突变点(表1)。外显子4区域的突变区。 
表1、BIGH3基因突变的眼病 
Figure BPA00001545483100121
Figure BPA00001545483100131
Figure BPA00001545483100141
Figure BPA00001545483100151
实施例4：通过聚合酶链式反应(PCR)获得检索区
为了检索上表1中示出的所有突变，构建包括外显子4、外显子11、外显子12和外显子14区域的5对PCR引物。为了扩增外显子4区域的突变区，使用两对引物。在它们之中，一对引物(引物1和引物2)被确认为适用于诊断型DNA芯片实验的引物，而另一对引物(引物3和引物4)被构建用于直接碱基测序。在此，萤光物质缀合到与待检索的DNA探针互补的引物链(反向引物)的5’端的羟基残基。为了确认芯片上的有效引物对，用Cy5缀合引物2，并且用Cy3缀合引物4。使用约10-100ng的DNA(从血液收集)作为模板，基于50μl的总反应体积来执行不对称PCR，由此构建片段基因。该片段基因是使用一步PCR通过以1∶5至1∶10的比例添加正向引物和反向引物获得的。PCR反应在下面 的条件下执行：在98℃初始变性5min；然后在94℃二次变性1min；在55℃退火1min并在72℃延伸1min，35个循环；此后在72℃最终延伸7min。 
表2、用于扩增包括突变的区域的引物 
  引物# SEQ ID NOs： 碱基序列(5′→3′)
  1 1 agc cct acc act ctc aa
  2 2 cag gcc tcg ttg cta ggg
  3 3 ccc cag agg cca tcc ctc ct
  4 4 ccg ggc aga cgg agg tca tc
  5 5 ctc gtg gga gta taa cca gt
  6 6 tgg gca gaa gct cca ccc gg
  7 7 cat tcc agt ggc ctg gac tct act atc
  8 8 ggg gcc ctg agg gat cac tac tt
  9 9 ctg ttc agt aaa cac ttg ct
  10 10 ctc tcc acc aac tgc cac at
实施例5：用于诊断BIGH3基因突变的探针DNA的制备
为了检索表1中所示的负责角膜营养不良的突变，构建探针使得在突变的碱基序列的两端都放置5-8个碱基序列，最优选7个碱基序列。构建用于正常人的探针使得非突变的正常碱基序列位于所构建的碱基序列的中心。 
表3、为诊断负责眼病的突变所构建的探针DNA 
SEQ ID NOs：   基因型   正常或突变   探针序列   外显子区
11   正常   R124 acg gac cgc acg gag   4
12   Avellino营养不良   R124H acg gac cac acg gag   4
13   Reis-Bucklers(CDB1)   R124L acg gac ctc acg gag   4
14   正常   R124 cac gga ccg cac gga   4
15   格子状角膜营养不良I型   R124C cac gga ctg cac gga   4
16   正常   P501 gac ccc cc aat ggg   11
17   格子状角膜营养不良IIIA型   P501T gac ccc cac aat ggg   11
18   正常   L518 agc atg ctg gta gct   12
[0081] 
  19 格子状角膜营养不良Pro   L518P agc atg ccg gta gct   12
  20 正常   L527 gca gga ctg acg gag   12
  21 格子状角膜营养不良Arg   L527R gca gga cgg acg gag   12
  22 正常   F540 aca gtc ttt gct ccc   12
  23 Reis-Bucklers   F540缺失 ac aca gtc gct ccc ac   12
  24 正常   N544 ccc aca aat gaa gcc   12
  25 格子状角膜营养不良ser1   N544S ccc aca agt gaa gcc   12
  26 正常   N544 ccc aca aac gaa gcc   12
  27 格子状角膜营养不良ser2   N544S ccc aca agc gaa gcc   12
  28 格子状角膜营养不良ser3   N544S ccc aca tct gaa gcc   12
  29 格子状角膜营养不良ser4   N544S ccc aca tcc gaa gcc   12
  30 格子状角膜营养不良ser5   N544S ccc aca tca gaa gcc   12
  31 格子状角膜营养不良ser6   N544S ccc aca tcg gaa gcc   12
  32 正常   A546 aaa tga agc cttc cga   12
  33 格子状角膜营养不良IIIA型thr   A546T aaa tga aac cttc cga   12
  34 正常   R555 aag aga acg gag cag   12
  35 颗粒状角膜营养不良   R555W aag aga atg gag cag   12
  36 正常   R555 aga gaa cgg agc aga   12
  37 Reis-Bucklers(CDB2)   R555Q aga gaa cag agc aga   12
  38 正常   N622 ggc cac aaa tgg cgt   14
  39 正常   N622 ggc cac aaa cgg cgt   14
  40 格子状角膜营养不良his   N622H ggc cac aca cgg cgt   14
  41 正常   G623 aca aat ggc gtg gtc   14
  42 Reis-Bucklers-1   G623D aca aat gat gtg gtc   14
  43 正常   G623 caa acg gcg tgg tcc   14
  44 Reis-Bucklers-2   G623D caa acg atg tgg tcc   14
  45 正常   H626 gtg gtc cat gtc atc   14
  46 14格子状角膜营养不良   H626R gtg gtc cgt gtc atc   14
[0082]  实施例6：探针DNA在用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片表面上的固定
为了将实施例5中选择的各探针DNA施用于核酸芯片，执行探针DNA的合成。具体地，将单核苷酸(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)导入自动合成仪(ExpediteTM 8900，PE Biosystems Co.)中，并且输入碱基序列和大规模的想要的探针DNA，由此获得0.05μmole各纯的核酸探针DNA。对所获得的探针DNA进行电泳以确认是否其被合成。 
图3是示出将上面设计的探针DNA固定在多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面上的方法以及通过使目标DNA与探针DNA反应来诱导互补结合的工序的示意图。 
为了在多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面上固定上面制备的探针DNA，使用羧基和胺基之间的键合。当合成了所有的DNA探针片段探针来固定DNA探针时，使用氨基接头柱(Cruachem，Glasgrow，Scotland)将具有氨基残基的碱基插入到各探针的3’端。另外，在用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面上，使用1mM 4，4′-二硫代二丁酸(DDA)形成具有羧基的SAM膜。然后向多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的表面添加400mM EDC，并对被引入到表面上的羧基执行活化，此后在55％或更高的湿度下执行羧基-胺基键合1小时或更长，由此固定探针DNA。在此，以10-100μM的浓度固定各探针DNA。 
实施例7：作为目标DNA长度的函数的核酸芯片功能性的检查
使用包括实施例2中构建的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，测量核酸芯片作为正常目标DNA和Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)和Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)的目标DNA各者长度的函数的检测效力。将具有15mer长度的各探针DNA固定在核酸芯片的表面上，并且使具有30、50、100、147、190和225mer长度的各目标DNA与探针DNA在55％或更高的湿度下反应6小时或更长，由此诱导它们之间的互补结合。30mer目标DNA是通过合成而获得的，而其他目标DNA是通过PCR反应而获得的。 
结果，如图4所示，目标DNA在147mer长度时显示出最高效力。图5示出 用预测程序(GeneBee；http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html)执行模拟测试来根据结合至探针DNA的各目标DNA的长度而预测二级结构。根据目标DNA的长度的二级结构是通过Greedy法获得的。结果，如从图5可见，当目标DNA具有147mer或更短的长度时，目标DNA的结合位点(红色椭圆形部分)能互补地结合探针DNA的结合位点，但当目标DNA具有190mer或更长的长度时，它们的互补结合很困难。因此，使用具有147mer长度的各目标DNA来执行后续实验。 
实施例8：作为目标DNA浓度的函数的核酸芯片功能性的检查
以与实施例7相同的方式，使用包括实施例2中构建的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，测量核酸芯片根据正常目标DNA以及Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD)和Reis-bucklers角膜营养不良(RBCD)的目标DNA各者的浓度的检测效力。将各目标DNA设定在1fM至1μM的范围内。将具有15mer长度的各探针DNA固定在核酸芯片的表面上，并且使具有147mer长度的各目标DNA与各探针DNA在55％或更高的湿度下反应6小时或更长以便诱导它们之间的互补结合。结果，如图6所示，所有的目标DNA都可以在1pM浓度下以高灵敏性被分析，并且各目标DNA的吸收值和浓度之间的关系在1pM至1μM范围内是线性的。因此，看出本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片能够定量地分析低浓度的目标DNA。 
实施例9：用于患者诊断的核酸芯片的杂交结果
为了制备用于诊断角膜营养不良的、能够选择性地检测点突变飞有效的核酸芯片，以与实施例7和8相同的方式，使用包括实施例2中构建的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，测量核酸芯片选择性地检测正常目标DNA和纯合性及杂合性角膜营养不良(ACD、RBCD及LCD)的目标DNA各者的检测效力。将各目标DNA的浓度设定在1μM。将具有15mer长度的各探针DNA固定在核酸芯片的表面的各点上，并且使具有147mer长度的各目标DNA在55％或更高的湿度下反应6小时或更长并测量各互补目标DNA和错配目标DNA的特异性结合。 
图7和8示出使用包括多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，测量核酸芯片选择性地检测正常目标DNA和纯合性及杂合性角膜营养不良(ACD、RBCD及LCD)的目标DNA各者效力的结果。如图7和8所示，能选择性地检测杂合性及纯合性角膜营养不良的所有目标DNA的互补目标DNA和错配DNA。因此，发现本发明的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片能够通过一个核酸芯片实现多个检测和选择性分析并且能够准确地诊断所有被应用的患者样品。 
工业应用 
如上所述，该核酸芯片具有常规金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的优点并且能够执行BIGH3基因突变的多重检测和量化分析用于诊断角膜营养不良，包括Avellino角膜营养不良，它们应在视力矫正手术之前使用LSPR光学特性被准确地诊断。此外，本发明的核酸芯片能够与包括光源、检测器、分光光度计和计算机的分析装置组合以提供没有基于LSPR光学特性标记的光学生物传感器，并且也能够应用于现场(原位)监测。 
尽管参考特定特征详细描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见的是，这一描述仅仅是用于优选的实施方式而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等效物所限定。 
序列表文件 
以电子文件形式提供 
Figure IPA00001545482500021
Figure IPA00001545482500031
Figure IPA00001545482500041
Figure IPA00001545482500051
Figure IPA00001545482500061
Figure IPA00001545482500081

Claims (18)

1.一种制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，所述方法包括步骤：
(a)在基底(第一层)上形成金属薄膜层(第二层)；
(b)在该金属薄膜层(第二层)上形成多点并且在所述多点的各表面上以恒定间隔排列纳米结构以形成纳米结构层(第三层)；
(c)在该纳米结构层上形成金属薄膜层(第四层)；以及
(d)在该金属薄膜层(第四层)上固定探针核酸。
2.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中使用真空沉积体系在基底(第一层)上形成金属薄膜层(第二层)。
3.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中通过将多孔罩固定在金属薄膜层(第二层)上而形成纳米结构层(第三层)的多点。
4.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中探针核酸由识别多种目标核酸的多种探针核酸所组成。
5.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中基底(第一层)选自由玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯、硅和石英组成的组。
6.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中基底(第一层)的厚度在0.1mm和20mm之间。
7.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中金属薄膜层(第二层)和金属薄膜层(第四层)选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铝(Al)、铂(Pt)、镍(Ni)、锌(Zn)以及它们的混合物所组成的组。
8.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中金属薄膜层(第二层)和金属薄膜层(第四层)的形成是通过选自溅射、蒸汽沉积、离子镀、电镀和化学镀组成的组的方法而执行的。
9.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中纳米结构选自由纳米颗粒、纳米点、纳米岛、纳米棒和纳米线组成的组。
10.根据权利要求3的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中多孔罩选自由橡胶平板、硅平板及它们的混合物组成的组。
11.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中以恒定间隔排列纳米结构是通过在金属薄膜层(第二层)的表面上使用4，4′-二硫代二丁酸(DDA)形成具有羧基的自组装单层(SAM)膜，在纳米结构的表面上使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APTES)修饰胺基，然后在SAM膜和胺基之间形成共价键来执行。
12.根据权利要求1的制备多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片的方法，其中探针核酸通过物理吸附或化学结合来固定。
13.通过权利要求1-12中任一项的方法所制备的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，包括：
(a)基底(第一层)；
(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；
(c)纳米结构层(第三层)，多点形成在该金属薄膜层上以及纳米结构以规则间隔排列在所述多点的各点表面上；
(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及
(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的探针核酸。
14.根据权利要求13的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，其中探针核酸由识别多种目标核酸的多种探针核酸所组成。
15.一种检测目标核酸的方法，所述方法包括：
使目标核酸与权利要求13的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；以及
向该用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。
16.一种用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，所述核酸芯片包括：
(a)基底(第一层)；
(b)在该基底上形成的金属薄膜层(第二层)；
(c)纳米结构层(第三层)，多点形成在该金属薄膜层上以及纳米结构以规则间隔排列在所述多点的各点表面上；
(d)在该纳米结构层的表面上形成的金属薄膜层(第四层)；以及
(e)在该金属薄膜(第四层)上固定的用于检测BIGH3基因突变的探针核酸。
17.根据权利要求16的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片，其中用于检测BIGH3基因突变的探针核酸必然含有选自由SEQID NO：11至SEQ ID NO：46组成组的一种或多种碱基序列。
18.一种检测BIGH3基因突变的方法，所述方法包括：
使临床样品与权利要求16的用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片反应；以及
向该用于诊断角膜营养不良的多点金属封端的纳米结构阵列核酸芯片辐射光并分析该核酸芯片的局域表面等离子体共振(LSPR)的改变。
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