JP5001019B2 - 生体分子検出素子、生体分子検出素子の製造方法及び生体分子検出方法 - Google Patents
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Description
(1)プローブ分子の固定密度が定量的に制御されていない。
(2)プローブ分子の相互の間隔がランダムであり、個々のプローブ分子による生体分子検出反応が、独立ではなく相互に干渉しあう。
(3)非特異的に吸着した生体分子が表面に残留し、検出信号の精度を低下させる。
金属微粒子径とリンカー分子ドットの径は互いにほぼ匹敵するサイズが好ましい。
(1) 基板表面へのポジ型電子線レジストの塗布
(2) 電子線描画及び現像による開口形成
(3) リンカー分子層の形成I(金属微粒子固定ドット:リンカー分子A)
(4) 金属微粒子の固定
(5) レジスト剥離
(6) リンカー分子層の形成II(微粒子固定ドット外表面:リンカー分子B)
(7) 吸着阻害分子の形成I(吸着阻害分子C)
(8) プローブ分子の固定
(9) 表面吸着阻害分子の形成II(金属微粒子表面:吸着阻害分子D)
(1) 基板表面へのポジ型電子線レジストの塗布:図2(a)
先ず担体基板201を洗浄する。具体的には例えば、NaOH水溶液等のアルカリ性水溶液で洗浄した後、HCl水溶液等の酸性水溶液で洗浄し、純水ですすいだ後に乾燥する。あるいは、硫酸と過酸化水素を約4:1で混合した溶液で有機物汚染を洗浄する。基板としては、ガラス基板(スライドガラス)、石英基板、プラスチック基板等を用いることができる。また、金属コーティング基板等でもよい。基板の材質は、表面にシラノール基を有するものが好ましい。
ここでは、ポジ型電子線レジストを用いているが、描画パターンによってはネガ型レジストを用いても良い。
電子線描画は、目的の解像度を満たす電子線描画装置によって実行する。ここでは、実効解像度(最小加工寸法)10nmの電界放射型電子線描画装置を用い、ドットパターンをXY座標方向ともに一定ピッチの格子状パターンを描画する。基本パターンは円形であり、サイズは最小20nmφから100nmφ程度が主要な値である。電子線走査範囲は、75μm−2400μm角の範囲であり、必要に応じて走査フィールドを繋ぎ合わせ、照射面積を確保する。レーザ干渉計を用いた高精度アライメント機構を用い、走査フィールド繋ぎ精度は3σで50nm以下(走査フィールド600μmの場合)程度を確保する。電子線描画パターンはCADデータとして設計し、コンピュータ制御により描画を実行する。描画パターンは穴加工であり、スループットの観点からポジ型レジストが向いている。ポジ型電子線レジスト塗布基板を電子線描画した後、所定の有機溶剤系現像液に浸漬して、照射部のレジストを除去し、さらにリンス液で洗浄して開口パターン203を得る。20nmφから100nmφの開口パターンは光学顕微鏡では観察できないので、電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡(AFM)を用いてパターン解像検査を行う。
電子線レジスト開口パターンを形成した基板を、リンカー分子Aの溶液に浸漬し、開口パターン底の酸化膜(SiO2)表面に反応させる。リンカー分子Aとしては、金属微粒子と結合する活性基を持つシランカップリング剤などが使える。シランカップリング剤としては、例えば、基板表面にアミノ基を固定する場合には、3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimthoxysilane)、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(3-aminopropyltriethoxysilane)、N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane)、(aminoethyl-aminomethyl) phenethyltrimethoxysilane等を用いることができる。一方、基板表面にチオール基を固定する場合には、(3-mercaptopropyltrimethoxysilane)を用いることができる。溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、トルエン、ベンゼン、水等を用いることができる。反応温度は、通常、20℃〜85℃の範囲である。ここで、リンカー分子Aは、開口部の酸化膜表面とは表面シラノール基と共有結合で固定されるが、レジスト表面部では表面に結合基が存在しないため物理吸着しているだけである。リンカー分子Aのアミノ基又はチオール基が基板と反対側に露出し、次工程の金属微粒子と結合する。
基板表面の活性基と金属微粒子の相互作用により、基板表面に金属微粒子を固定する。図2(d)は、金属微粒子205が固定化された担体表面の様子を示す。金属微粒子材料としては、貴金属類である金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、オスミウムのいずれか、あるいはそれらの合金を用いることができる。あるいは、これらの貴金属類で作られた微粒子上に他の貴金属がコーティングされたもの、例えば金微粒子上に銀がコーティングされた金属微粒子を用いてもよい。用いることができる金属微粒子径は、金属微粒子が安定に存在できる0.6nm以上である。金属微粒子の基板への固定安定性という観点から、金属微粒子径は10nm以上が望ましい。一方、蛍光を増強させるという観点から、金属微粒子径は蛍光増強効果が得られる10nm以上1μm以下を用いるのが良い。一方、後の工程で金属微粒子表面に単一生体分子を効果的に固定するという観点から、金属微粒子径は100nm以下が望ましい。以上の3つの観点から整理すると、固定する金属微粒子径は0.6nm以上1μm以下が良いが、望ましくは10nm以上100nm以下が良い。
専用レジスト剥離液に工程(4)が終了した基板を浸漬し、レジストを溶解除去する。この際、レジスト上の吸着している金属微粒子及びリンカー分子Aがリフトオフにより除去され、基板表面に共有結合した表面反応分子Aからなる微粒子固定ドットとその上に固定された金属微粒子だけが残る。この段階で重要なことは、ドットパターン上の金属微粒子が、各サイトに一個づつ固定されていることと、ドットパターンへの金属微粒子固定充填率が高いこと、ドット外のエリアには金属微粒子の残留付着が無いことである。
基板表面のうち、金属微粒子が固定されていない表面に、後のプロセスで生体分子やdNTPといった試薬が非特異的に吸着する可能性が高い。この非特異吸着は、デバイスとして用いた場合のノイズとなるため、徹底的に防止する必要がある。このため金属微粒子固定ドットパターン以外のエリアに吸着阻害分子を固定し、対策する。図2(f)は、この目的のために、まずリンカー分子Bを形成した様子を示す。ここで、金属微粒子固定ドットに用いた、アミノ基やチオール基を含むシランカップリング剤を用いると、既に表面に固定されている金属微粒子表面に対しても反応するために、最終的な金属微粒子表面へのプローブ固定の障害にもなりかねない。そこで、ここでは金属微粒子とは相互作用せず、基板表面とだけ反応するリンカー分子が望ましい。このような物質として、例えばエポキシ基やカルボキシル基を持つシランカップリング剤が有望である。
工程(6)で形成したリンカー分子Bの上に、生体分子の非特異吸着を防止する分子として吸着阻害分子Cを結合させる。リンカー分子Bが、上記エポキシ基を持つシランカップリング剤の場合は、エポキシ基やカルボキシル基と反応するアミノ基や水酸基等を持つ吸着阻害分子が有効であり、具体的には、アミノ基を末端にもつ低分子量のポリエチレングリコール(PEG)や水酸基を持つカルボキシメチルデキストラン(CM-Dextran)などが使える。ただし、リンカー分子Bのみで充分非特異吸着を防止できる場合には、吸着阻害分子Cは必ずしも必要ではない。
金属微粒子グリッドアレイ基板に固定された金属微粒子上に、この金属微粒子と結合することができる官能基を持つプローブ分子を反応させ、金属微粒子上にプローブ分子を一個だけ固定することがこの工程の目的である。図2(h)は、プローブ分子をPとして、基板表面の様子を示す。
金属微粒子表面で、プローブDNAが固定されなかった領域は、検体の生体分子を吸着させる可能性がある。よって、このプローブDNA固定部以外の金属微粒子表面をブロッキングする。図2(i)は、吸着阻害分子Dを用いて、金属微粒子表面をブロッキング処理した後の基板表面の様子を示す。
前述の(1)〜(9)に述べた工程を経て作成した金属微粒子グリッドアレイを基板とする生体分子検出素子表面に、蛍光修飾された検体試料溶液を反応させる。ここではプローブ分子としてプローブDNAを用い、検出用生体分子としても核酸を用いた場合について図3を用いて説明する。簡略化のためリンカー分子、吸着阻害分子などは図示を省略した。基板301上に金属微粒子302が等ピッチLで整列固定され、金属微粒子302上にプローブDNA303が固定されている。これに対して、蛍光分子305によって蛍光修飾されたターゲットDNA304が検体試料として供給された状況を図3(a)に示す。ここで、プローブDNAとターゲットDNAの塩基配列が完全に相補的である場合は互いに速やかに反応し、図3(b)のように相補的水素結合307で結合した2本鎖DNAを形成する。これがハイブリダイゼーション反応である。ここで重要なことは、個々のプローブDNAは均等な環境条件にありかつ一定距離で正確に分離・固定されているので、相互干渉することがない。このため、このような基板で構成した生体分子検出素子では、反応時間や反応効率のバラツキが発生しにくい。
本発明では、金属微粒子をプローブ分子の固定場に用いることで、もう一つの特徴である蛍光増強現象が利用できる。本発明において、蛍光増強現象が発現する様子を図5で説明する。図5は、図2で説明した本発明の生体分子検出素子の製造方法によって作成した素子を示しており、図2(i)においてPで表記したプローブ分子としてDNAを想定したものである。図5(a)は、基板501上の金属微粒子に固定化されたプローブDNA(502)と蛍光分子504で蛍光修飾されたターゲットDNA(503)とのハイブリダイゼーション反応前の状態であり、図5(b)は反応後の状態を示す。この図は、完全相補鎖DNA同士の反応として描いてある。
まず、前述の(1)〜(9)に述べた工程によって、配列解析対象となる単一分子DNA604を固定するためのプローブ分子603を基板601上に金属微粒子602を介して配列させる。次に、配列解析対象の単一分子DNA604をプローブ分子と1対1で反応させて基板に固定する。解析対象の単一分子DNAをプローブ分子と反応させる際の条件として、単一分子DNAを、NaCl等の塩を含む溶液に溶かし、この溶液をプローブ分子を固定したアレイ基板表面と接触させる。反応温度は、通常、20℃〜80℃、反応時間は、通常1時間〜24時間程度である。解析対象の単一分子DNAとプローブ分子を反応させるために、プローブ分子は単一分子DNAを固定するための反応サイトを持つ必要がある。例えば、解析対象の単一分子DNAがAAAAAAAAAといったPolyA配列を持つ場合、これと相補的な配列であるTTTTTTTT等のTが連続したPolyT配列を有するプローブ分子を使用する。
図7に示すように、プローブ分子702をプライマーとして、ポリメラーゼ704によるポリメラーゼ反応により、プローブ分子702の先端にヌクレオチド705を一塩基伸長させる。この反応時には、ヌクレオチドを、例えば、塩化マグネシウム等の塩を含む溶液に溶解し、この溶液を基板と接触させる。酵素であるポリメラーゼの失活を防止するため、ジチオスレイトール(DTT)やグリセロール、界面活性剤等を上記溶液に混合しても良い。図7に示すように、伸長したヌクレオチドには蛍光分子706を結合している。この蛍光分子からの蛍光を読み取ることで、ヌクレオチドが伸長したか否か、あるいは、伸長したヌクレオチドの種類、例えば、A,T,C,Gを判別する。
担体基板1101として、平坦性の高い熱酸化膜100nm付き4インチSi基板を用いた。基板を0.1wt%のNaOH水溶液で洗浄し、更に0.1wt%のHCl水溶液で洗浄し、純水で充分すすいだ後に乾燥した。ここで、レジストとして用いたポジ型レジストは、主鎖切断型のレジストである。レジストをアニソールで希釈し、スピンコーターを用いてコーティングした。コーティング後、溶剤を除去するためにN2フロー中 180℃、20minベークした。本実施例では、レジスト膜厚は充分薄く、かつEB加工による膜減りが見られない60nm膜厚(レジスト:アニソール=1:3希釈)とした。また、EB描画中の基板の帯電を防止するため、塗布したレジスト膜1102の上に導電性ポリマー(ポリイソチアナフテンスルホネート)溶液をコーティングした。この溶液は、導電性ポリマーをコロイド粒子にし、界面活性剤を用いて分散させたものである。同じスピンコーターを用いて導電性ポリマー1103をコーティングした後、溶剤を除去するためにN2フロー中で100℃、10minベークした。
電子線走査フィールド内ではx方向、y方向それぞれ60,000ステップに分割され、各ステップにてスポット径約2〜3nmの電子線をパルス照射する。どのステップ位置で電子線照射をするかをCADソフトを用いて指定することにより、所望のパターンを形成する。電子線加工開口径は、固定させる金属微粒子と同等である必要がある。本実施例では、安定に固定でき、かつ蛍光増強効果を得ることができる30nmの金ナノ粒子を用いた。したがって、EB開口径を40nmφとした。本実施例で用いた描画パターンを図14に示す。40nmφの電子線照射領域が格子状にそれぞれ100nmピッチで並んだパターンとした。この描画パターンを200μm角のエリアに加工した。またこの200μm角の加工エリアを基板上に100点作成した。加工エリアは基板上に2mmピッチで格子状に並べた。
フィールドサイズは150μm角とし、電子線ビーム電流5×10-11Aで電子線描画を行った。
電子線レジスト開口パターンを形成した基板を、シランカップリング剤である3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimthoxysilane, APTMS)溶液に浸漬した。なおAPTMSを希釈する溶媒としてメタノールを用いた。反応温度は室温、反応時間は5分とし、反応後、メタノールで充分洗浄し乾燥した。この結果、開口孔底にAPTMSが吸着する。この基板を80℃2hrアニールした。このアニールプロセスによって、APTMSと開口孔底のSiO2の間にシロキサン結合が形成され、開口孔底が安定にアミノ化される。一方、レジスト上にもAPTMSが吸着するため、レジスト上にもAPTMSが残留する。
次に、開口孔底部をアミノ化した基板に、直径が30nmの金ナノ粒子クエン酸溶液を作用させた。なお、金ナノ粒子1106の濃度は、約0.4nMである。また、反応温度は室温であり、反応時間は20時間である。この時、金ナノ粒子表面はクエン酸で覆われ負電荷を持つ。一方、アミノ化された表面は正電荷を持つため、金ナノ粒子は表面のアミノ基1105と引き合うため、金ナノ粒子1106が固定される。金ナノ粒子を反応させた後、充分純水洗浄した後に乾燥させた。
基板をジメチルアセトアミドに3分浸漬させ、レジストを除去した。この際、レジスト上に付着した金ナノ粒子が基板に再付着しないよう、充分量のジメチルアセトアミドを使用した。ジメチルアセトアミドに浸漬後、エタノール洗浄と純水洗浄を充分に行った。このプロセスによって、レジスト上に吸着された金ナノ粒子もリフトオフされ、開口部に固定された金ナノ粒子のみが残留する。従って、金ナノ粒子30nmを格子状に配列することができた。
金ナノ粒子30nmを格子状に配列させた基板をエタノールに浸漬し乾燥後、エポキシ基1107をコーティングした。Diisopropylethylamine 0.8%が添加された3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane(GOPS) 7.7%の脱水トルエン溶液中で、上記基板を85℃下で2hr反応させることによってエポキシ基を金ナノ粒子が固定されていない領域にコーティングした。反応後、脱水トルエン及びエタノールで洗浄し乾燥させた。
工程6で固定したエポキシ基1107とアミノ基を末端に持つPEG(分子量2k)1108を弱アルカリ下で反応させた。具体的には、4mMアミノ化PEG溶液に溶解し、基板を室温で1hr浸漬した。その後、純水で充分洗浄し乾燥させた。この工程によって、図7(c)に示すように、金ナノ粒子が固定されていない領域がPEG1108でブロッキングされた。
工程6及び7でエポキシ基とPEGをコーティングした基板をエタノール洗浄した後、基板表面とチオール基を末端に持つ50mer 1本鎖プローブDNA溶液を金ナノ粒子コーティング領域であるそれぞれ250μm角エリアにスポッティングした。用いたDNAの塩基配列は1種類であり、1種類のプローブDNA(1109)を100点にスポットした。これは、各スポットでの検出バラツキを調べるためである。その5’末端側からの塩基配列を下記に示す。
AGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACG
メルカプトヘキサノール水溶液1μMを作成し、この水溶液中にプローブDNAが固定された基板を浸漬した。反応温度は室温、反応時間は1時間とした。反応させた後に純水洗浄を行い、デシケータ中で減圧乾燥し、図13(b)に示すように、金ナノ粒子のプローブDNA固定部以外の表面をメルカプトヘキサノール1110でブロッキングした基板を得た。
プローブDNAを固定した基板に、プローブDNAと完全相補的な配列をもち、3’末端に蛍光分子Cy3を標識した一本鎖のターゲットDNAをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液として5×SSC(Standard Saline Citrate)と0.5%SDS溶液Sodium Dodecyl Sulphate)の混合液を用い、ターゲットDNA量1fmolを42℃で20時間ハイブリダイゼーションさせた。その後、2×SSC、0.1%SDS溶液、2×SSC溶液で洗浄を行い、乾燥した。乾燥させた基板表面に対し、蛍光スキャナーを用いて励起光を入射し、表面からの蛍光強度を測定した。この蛍光強度は、ハイブリダイゼーションによって反応したターゲットDNAの量に比例するものである。
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACG
Claims (8)
- 担体基板と、
前記担体基板の表面の格子点位置に固定されたリンカー分子と、
前記リンカー分子上に結合された金属微粒子と、
前記担体基板の前記表面において前記金属微粒子が固定された部分以外の第1の領域に固定され、前記第1の領域を被覆する第1の吸着阻害分子と、
前記格子点位置にある前記金属微粒子の表面に固定された、核酸からなる単一プローブ分子と、
前記金属微粒子の前記表面において前記単一プローブ分子が固定された部分以外の第2の領域を被覆する、前記第1の吸着阻害分子とは異なる第2の吸着阻害分子と
を備えることを特徴とする生体分子検出素子。 - 請求項1記載の生体分子検出素子において、前記金属微粒子が貴金属類に属する金属、あるいは貴金属類に属する金属の合金又は貴金属類に属する金属を積層したものであることを特徴とする生体分子検出素子。
- 請求項1記載の生体分子検出素子において、前記金属微粒子の粒子径が0.6nm以上1μm以下であることを特徴とする生体分子検出素子。
- 請求項1記載の生体分子検出素子において、前記金属微粒子の径r1とリンカー分子が固定された部分の径r2との比γが
0.5≦γ(r1/r2)≦1
を満たすことを特徴とする生体分子検出素子。 - 単一プローブ分子が担体基板上の格子点位置に配列固定された生体分子検出素子の製造方法において、
担体基板表面の格子点位置にリンカー分子を固定する工程と、
前記リンカー分子に金属微粒子を結合させる工程と、
前記担体基板表面の前記金属微粒子が固定された部分以外の第1の領域に第1の吸着阻害分子を固定する工程と、
前記第1の領域を前記第1の吸着阻害分子で被覆した状態で、前記格子点位置にある前記金属微粒子の表面に、核酸からなる単一プローブ分子を固定する工程と、
前記金属微粒子の前記表面において前記単一プローブ分子が固定された部分以外の第2の領域に、前記第1の吸着阻害分子とは異なる第2の吸着阻害分子を固定する工程と
を有することを特徴とする生体分子検出素子の製造方法。 - 請求項5記載の生体分子検出素子の製造方法において、
前記単一プローブ分子を固定する工程は、プローブ分子を有するプローブDNA溶液に、前記金属微粒子及び前記第1の吸着阻害分子を有する前記担体基板を浸漬させることで行うことを特徴とする生体分子検出素子の製造方法。 - 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の生体分子検出素子を用いて、
前記生体分子検出素子の前記プローブ分子と蛍光標識された試料生体分子とを反応させる工程と、
反応後の生体分子検出素子に励起光を照射する工程と、
前記プローブ分子が固定された領域から発生する蛍光を検出する工程と、
を有することを特徴とする生体分子検出方法。 - 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の生体分子検出素子を用いて、核酸の配列を検出する方法において、
前記生体分子検出素子の前記プローブ核酸分子と被配列検出核酸分子とを反応させる工程と、
前記被配列検出核酸分子に、蛍光標識されたヌクレオチドを反応させる工程と、
前記生体分子素子に励起光を照射する工程と、
前記標識されたヌクレオチドから発生する蛍光を検出する工程と、
を有することを特徴とする生体分子検出方法。
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