JP2007003439A - バイオセンサの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】バイオセンサの定量性や再現性を向上させるために、センサ表面に固定するプローブ生体分子を効率良く均一にコーティングする。
【解決手段】プローブ生体分子を基板表面に固定する際に、界面活性剤(相関移動触媒)を添加して反応させる。その結果、プローブ生体分子の固定効率及プローブ生体分子の均一性を向上させることができる。
【選択図】図1
【解決手段】プローブ生体分子を基板表面に固定する際に、界面活性剤(相関移動触媒)を添加して反応させる。その結果、プローブ生体分子の固定効率及プローブ生体分子の均一性を向上させることができる。
【選択図】図1
Description
本発明は、生体分子及び化学反応をセンシングするための核酸やたんぱく質等が表面に固定されたバイオセンサの製造方法に関する。
ヒトゲノム計画により、ヒトゲノムシーケンスの全てが解読され、現在では研究の主題が従来の「シーケンス解析」からその機能を調べる「機能解析」へと移行している。ここから得られる情報は、生命現象を解明するための重要なヒントを提供すると考えられ、医療、環境、食品など、生物が関わるあらゆる分野の問題を解く鍵になると予測されている。そこでは、膨大な情報量を持つ遺伝子や、遺伝子から作られるたんぱく質を網羅的にかつ迅速に解析することが求められている。そこで開発されたのがDNAマイクロアレイやプロテインチップに代表されるバイオセンサの一種であるバイオチップである。
バイオチップの製造方法として大きく2つの方法がある。一つは、フォトリソグラフィーやインクジェットを用いて、基板上でアミノ酸や核酸塩基をひとつひとつ逐次的に化学結合させることにより、たんぱく質や一本鎖のDNAといったプローブ用の生体分子を基板上でin-situ合成する方法である(US5,424,186)。もう一つは、プローブ用生体分子をex-situで合成した後に、これらを基板上に固定化する方法である(US5,700,637)。
バイオチップは、将来例えばガンの診断などの医療診断に使われると予想されている。医療診断にチップを用いる場合には、チップから得られるデータが高い信頼性を持つことが必要である。フォトリソグラフィーやインクジェットを用いてプローブ生体分子を基板表面でin-situ合成する方法では、合成すべき核酸塩基やアミノ酸の種類のミスや欠損部が生じた場合、それらを検査し、製造後に除去することが現状では不可能である。更に、長いDNAやたんぱく質を得るためには莫大な製造コストが必要になる。これに対し、DNAやたんぱく質をex-situで合成してから基板上に固定する方法では、合成した後に精製することで、欠損部等を持つ生体分子を事前に除去することができる。よって、純度の高いプローブ用生体分子を表面に固定することができ、信頼性の高いチップを製造することが可能である。この方法では、多くの場合、反応活性な官能基を持つ生体分子と表面を反応させ、共有結合を作ることで固定化させている。この時、光化学反応を用いる場合もある。しかしながら、基板表面にDNAやたんぱく質といった分子量の大きい高分子を固定化させるチップは、固定化されたプローブ生体分子の量・構造にバラツキが生じやすく、これがデータの再現性を低下させる要因になっている(Nature Vol.21, pp.5-9, 1999)。また、チップを用いて生体分子を検出する際に、生体分子が基板表面に非特異的に吸着することや、固定化されたプローブ生体分子の密度が低いために感度が低いことも定量的な解析を困難にする原因である(Nature Biotech. 19, p.342, 2001)。このような問題の原因として主に下記の三つが挙げられる。
(1)ex-situで合成したプローブ生体分子をチップ表面に固定する際の固定反応効率が低い。
(2)チップ表面の反応活性サイトの均一性が悪い。
(3)非特異的に吸着した生体分子が表面に残留し易い。
(1)ex-situで合成したプローブ生体分子をチップ表面に固定する際の固定反応効率が低い。
(2)チップ表面の反応活性サイトの均一性が悪い。
(3)非特異的に吸着した生体分子が表面に残留し易い。
上記(1)の原因として、基板表面が疎水性であることが多いのに対し、プローブ生体分子は比較的親水性であり、両者の親和性が低いことが挙げられる。上記(2)の原因として、基板表面の反応活性サイトのコーティング膜が不均一であることが挙げられる。上記(3)の原因として、非特異的に吸着した生体分子が付着しやすくかつ除去され難いことが上げられる。
以上の問題は、プローブ生体分子が効率良くかつ均一性良く固定化でき、また非特異的な吸着が抑制できるコーティング方法を提供することで解決できる。具体的には、(1)プローブ生体分子と基板表面との親和性を向上させ、(2)表面の反応活性サイトを均一化し、(3)非特異的に吸着した生体分子が付着し難くかつ除去され易いコーティング方法を提供することで解決できると考える。
Rickmanらは、プローブcDNAをUV光による光化学反応で固定する際に、均一に固定するためのコーティング反応溶液を検討している。検討の結果、プローブcDNAを反応させる溶液として、3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonateを、formamideあるいはdimethyl sulfoxide(DMSO)溶液に添加した溶液を用いることで、固定量が増加し、均一性や再現性が向上すると報告している(Nucleic Acids Research Vol. 31, No. 18 e109 (2003))。Rickmanらは固定するためにUV光を使用しているが、UV光を用いた場合、プローブDNAへのダメージが大きくプローブDNAの変性が懸念される。よって、UV光を用いずに固定化を行う方が望ましい。本発明では、UV光を用いずにプローブ生体分子を効率良くかつ均一性良く固定する方法を提供する。
Rickmanらは、プローブcDNAをUV光による光化学反応で固定する際に、均一に固定するためのコーティング反応溶液を検討している。検討の結果、プローブcDNAを反応させる溶液として、3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonateを、formamideあるいはdimethyl sulfoxide(DMSO)溶液に添加した溶液を用いることで、固定量が増加し、均一性や再現性が向上すると報告している(Nucleic Acids Research Vol. 31, No. 18 e109 (2003))。Rickmanらは固定するためにUV光を使用しているが、UV光を用いた場合、プローブDNAへのダメージが大きくプローブDNAの変性が懸念される。よって、UV光を用いずに固定化を行う方が望ましい。本発明では、UV光を用いずにプローブ生体分子を効率良くかつ均一性良く固定する方法を提供する。
本発明は、第一に、基板上に生化学反応を検出するプローブ用生体分子を固定したバイオセンサの製造方法において、基板上にプローブ用生体分子を固定する際に、界面活性剤を添加して反応させることを特徴とするものである。
第二に、前記プローブ用生体分子が核酸の場合、前記界面活性剤が陽イオン性界面活性剤であることを特徴とするものである。
第三に、前記プローブ用生体分子がたんぱく質の場合で、たんぱく質分子の実効電荷がマイナスの場合、前記界面活性剤として陽イオン性界面活性剤を用い、実効電荷がプラスの場合、前記界面活性剤として陰イオン性界面活性剤を用いることを特徴とするものである。
第四に、前記界面活性剤の濃度Cが、0.1CMC≦C≦100CMC(CMC:臨界ミセル濃度)であることを特徴とするものである。
第五に、前記界面活性剤の濃度Cが、1CMC(CMC:臨界ミセル濃度)以上であることを特徴とするものである。
第六に、前記バイオセンサにおいて、プローブ用生体分子を固定する際に、活性基含有シランカップリング剤分子を介して前記生体分子を固定する場合、シランカップリング剤を基板表面と反応させる時の反応溶液の水含有量が10%以上、反応時間が1時間以下であることを特徴とするものである。
以上で説明したように、本発明では、バイオセンサのプローブとなる生体分子を基板表面に効率良く、均一性良く固定することができ、また非特異的に吸着する生体分子の量を低減することができる。したがって、バイオセンサの感度を大幅に向上させることができ、更には、バイオセンサの定量性や再現性を向上させることもできる。よって、少量の検査サンプルを用いて精度・信頼性の高い遺伝子・タンパク検査等を行うことを可能にする。
図1は、本発明の一実施形態が適用されたバイオセンサの製造方法のプロセス図である。
本実施形態のバイオセンサの製造方法は、
(1)担体(基板、ビーズなど)の洗浄工程、
(2)担体表面へアミノ基の導入工程、
(3)活性基の導入工程、
(4)界面活性剤を用いたプローブDNAの固定工程、からなる。
以下、それぞれの工程について説明する。
(1)担体(基板、ビーズなど)の洗浄工程、
(2)担体表面へアミノ基の導入工程、
(3)活性基の導入工程、
(4)界面活性剤を用いたプローブDNAの固定工程、からなる。
以下、それぞれの工程について説明する。
(1)担体の洗浄工程
目的に応じた担体を用意し、洗浄する。具体的には、例えば、NaOH水溶液等のアルカリ性水溶液で洗浄した後、HCl水溶液等の酸性水溶液で洗浄し、純水ですすいだ後に減圧乾燥する。
目的に応じた担体を用意し、洗浄する。具体的には、例えば、NaOH水溶液等のアルカリ性水溶液で洗浄した後、HCl水溶液等の酸性水溶液で洗浄し、純水ですすいだ後に減圧乾燥する。
担体としては、例えば、ガラス基板(スライドガラス)、石英基板、プラスチック基板等を用いることができる。また、金属コーティング基板等でもよい。担体の材質は、表面にシラノール基を有するものが好ましい。
担体は平板型でなくてもよい。例えば、ビーズ状、ファイバー状、粉状等であってもよい。ビーズ状の場合は、ポリスチレン等のプラスチックビーズ、金属コーティングビーズ、磁気ビーズ等を用いてもよい。
また、洗浄溶液として、硫酸と過酸化水素の混合液を用いることもできる。
(2)アミノ基の導入工程
洗浄した担体表面に、アミノ基を有するシランカップリング剤を反応させ、担体表面にアミノ基を固定する。
洗浄した担体表面に、アミノ基を有するシランカップリング剤を反応させ、担体表面にアミノ基を固定する。
シランカップリング剤としては、例えば、3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimthoxysilane)、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(3-aminopropyltriethoxysilane)、N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane)、(aminoethyl-aminomethyl) phenethyltrimethoxysilane等を用いることができる。
溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、トルエン、水等を用いることができる。
反応温度は、通常、25℃〜85℃の範囲である。
図2(1)に、こうして固定化された第一層目の分子をAとして、担体(図2ではガラス)の表面の様子を示す。Aの末端にはアミノ基が存在する。また、図3(1)は、シランカップリング剤として3-アミノプロピルトリエトキシシランを用いた場合である。
(3)活性基の導入工程
担体表面のアミノ基に、活性基を有する化合物を反応させ、担体表面に活性基を固定化する。
担体表面のアミノ基に、活性基を有する化合物を反応させ、担体表面に活性基を固定化する。
活性基を有する化合物としては、末端にイソチオシナート基を有するPDC(Phenylenediisothiocyanate)等、スクシンイミド基を有するDSG(Disuccinimidyl glutarate)等、マレイミド基を有するKMUS(N-(11-maleimidoundecanoyloxy)succinimide)等を用いることができる。ここで、末端のイソチオシアナート基、あるいはスクシンイミド基、マレイミド基を活性基と呼ぶ。
溶媒としては、例えば、DMF(N,N-Dimethyolformamide)、DMSO(DimethylSulfoxide)、エタノール、ピリジン等を用いることができる。
反応温度は、通常、25℃〜85℃の範囲である。
図2(2)に、こうして固定化された第二層目の活性基の部分をBとして、担体表面の様子を示す。また、図3(2)は、活性基を有する化合物としてPDCを用いた場合である。
(4)プローブDNAの固定化
担体表面に形成された活性基に、この活性基と反応することができる基を末端に持つプローブDNAを反応させ、担体表面にプローブDNAを固定する。このとき、反応効率の向上のために、反応溶液に界面活性剤を添加する。
担体表面に形成された活性基に、この活性基と反応することができる基を末端に持つプローブDNAを反応させ、担体表面にプローブDNAを固定する。このとき、反応効率の向上のために、反応溶液に界面活性剤を添加する。
添加する界面活性剤(相関移動触媒)について説明する。界面活性剤は、水性の相と油性の相の2相系において、水性相に溶解したイオンと、油性相に溶解したイオンの2相間の移動を加速させるものである。つまり、各相に溶解していた分子同士の衝突回数を増加させ反応効率を上げるものである。
界面活性剤には、非イオン性とイオン性があるが、イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。また、陽イオン性の界面活性剤を用いることがさらに好ましい。
このような界面活性剤としては、相関移動触媒でもあるCTAB(Cetyltrimethylammonium bromide);アンモニウム塩であるCnH2n+1NH3(Cl-)またはCnH2n+1NH3(Br-)(nは8以上);CnH2n+1N(CH3)3(Cl-)またはCnH2n+1N(CH3)3(Br-)(nは8以上);CnH2n+1N(C3H7)3(Br-)(nは14以上)、C18H37N(CH3)3(NO3 -)、C18H37N(CH3)3(FO3 -)、C18H37N(C2H5)3(BrO3 -)、C18H37N(C3H7)3(BrO3 -)、C18H37N(C4H9)3(BrO3 -);またこれ以外のテトラアルキルアンモニウム塩、トリアルキルフェニルアンモニウム塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジウムハライド等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独で用いてもよいし、2種以上を混合して用いてもよい。
界面活性剤の添加量は、臨界ミセル濃度(「CMC」と表す。)付近であるのが好ましい。ここで「臨界ミセル濃度」について説明する。臨界ミセル濃度とは、溶液に界面活性剤を添加した時に、界面活性剤の濃度と溶液の表面張力の関係が不連続になる濃度のことである。臨界ミセル濃度以下では、界面活性剤分子は、溶液中あるいは担体(基板)表面上でモノマーとして存在する。一方、臨界ミセル濃度領域では、界面活性剤分子が集合体となり塊(ミセル)を形成する。また担体(基板)上では、界面活性剤分子がモノレイヤー層を形成する。このように、臨界ミセル濃度の前後で、界面活性剤分子の挙動が大きく変化する。
図4(1)に、陽イオン性界面活性剤を臨界ミセル濃度付近で添加した場合に、プローブDNAの固定量が増加するメカニズムを示す。臨界ミセル濃度付近では陽イオン性の界面活性剤402が表面の活性基403に単層吸着し、マイナスチャージを持つプローブDNA401をクーロン力で取り込む。また、界面活性剤402は相関移動触媒であり、疎水部と親水部の親和性を向上させる。すなわち、担体表面近傍のプローブDNAの濃度を上げ、更にプローブDNA(親水部)の反応活性基と基板上の活性基(疎水部)の衝突回数を増やすことができる。一方、臨界ミセル濃度以上では、図4(2)に示すように、基板表面に対する界面活性剤の多層吸着やミセルの生成が起こる。この多層吸着層はプローブDNAの表面への拡散を阻害し、ミセルは液中のプローブDNAをトラップする。したがって、多層吸着やミセルは、プローブDNAと基板上の活性基との反応を阻害する方向に働く。しかし、多層吸着やミセルは、剛直な構造ではなく、会合・解離が共存するダイナミックな構造を持つため、相関移動触媒作用を保っている。よって、臨界ミセル濃度付近と比較すれば反応効率は低くなるが、界面活性剤無添加と比較すれば、反応効率は向上する。更に、臨界ミセル濃度以上の濃度領域では、界面活性剤の濃度変化に対して、プローブDNAの基板表面への反応量が安定して変化しにくいという特徴がある。この特徴は、安定プロセス構築の観点から有利である。
具体的な界面活性剤の濃度として、界面活性剤の濃度を0.1CMC(CTABの場合、0.08mM)以上の範囲で添加することが望ましい。0.1CMC以上であれば、非特異的に吸着するプローブDNAの割合を減少させることもできる。一方、濃度を100CMC(CTABの場合、80mM)以上と高くすると、上述したように反応効率が下がり、また基板表面と反応溶液の濡れ性が非常に良くなるために、スポット形状が対称形の円ではなく、ゆがんだ形となり易い。よって濃度は100CMC以下が望ましい。
なお、プローブDNAを固定化するためにスポットされる溶液の量は、少ない場合1スポット当たり数pL程度である。湿度が高い環境下であっても溶液中の水分が蒸発し、スポットによって界面活性剤の濃度に変化が見られる場合がある。この場合、濃度の変化に対してプローブDNA固定量があまり変化しないことが望ましい。プローブDNA固定量があまり変化しない界面活性剤の濃度の領域は、1CMC(CTABの場合、0.8mM)以上で、好ましくは10CMC(CTABの場合、8mM)以上である。すなわち、界面活性剤の濃度に対して変動の少ない領域でプローブDNAを固定でき、かつ反応効率を向上させ、非特異的に吸着するプローブDNAを低減させる場合には、この濃度範囲で界面活性剤を添加することが望ましい。
プローブDNAを溶解させる溶液としては、炭酸バッファ、リン酸バッファなどの弱アルカリの水溶液を用いることができる。この溶液にプローブDNAを溶解させ、さらに界面活性剤を添加して、反応液とする。
担体がガラス基板の場合、基板全面に、プローブDNAを溶解した反応液をスポッティングすればよい。
担体がビーズ状の場合、ビーズを、プローブDNAを溶解した反応液に浸漬させればよい。
反応温度は、通常、25℃から40℃の範囲である。また、反応時間は、通常、2時間から12時間の範囲である。反応させる時に溶液が乾燥しないよう、充分湿度を保った環境で反応させる。
こうして、活性基がイソチオシアナート基やスクシンイミド基である場合には、アミノ基を5’末端に持つプローブDNAを固定できる。また、活性基がマレイミド基である場合には、チオール基を5’末端に持つプローブDNAを固定できる。
図2(3)に、これらのプローブDNAをPとして、担体表面の様子を示す。図3(3)は、活性基がイソチオシアナート基であった場合で、アミノ基を5’末端に持つプローブDNAが固定された場合である。
以上、本発明の一実施形態が適用されたバイオセンサの製造方法について説明した。
上記実施形態では、プローブDNAを固定化するプロセスに焦点を当てて説明したが、上記製造工程において、プローブDNAを効率良く均一に固定するために、プローブDNAの下層(図2のA及びBに相当する層)の固定の効率や均一性を上げるための処理を行ってもよい。
例えば、アミノ基の導入工程において、基板表面に第1層目(図2のA部)をコーティングする際、反応溶液の水含有量と反応時間を適切に調整する。
具体的には、シランカップリング剤を含む反応溶液の水含有量を10%以上にするのが好ましい。反応溶液の水含有量が10%未満と少ないと、均一性が悪くなり、プローブDNA固定量が低減する。水含有量が10%以上と多い領域では、プローブDNA固定均一性が良くなり、かつDNA固定量も多くなる。この原因は、以下のように説明できる。シランカップリング剤が表面と反応する時には、シランカップリング剤のメトキシ基あるいはエトキシ基等の加水分解により生成したシラノール基が基板表面と反応し、例えば基板にガラスを用いた場合には、シロキサン結合(Si-O-Si)を形成する。水含有量が少ない場合、シラノール基が生成し難いために、プラス電荷を帯びたシランカップリング剤のアミノ基が基板表面に吸着し易くなり、これが反応を妨害する。一方、水含有量が多いと、シランカップリング剤のメトキシ基またはエトキシ基の部分が加水分解反応を経てシラノール基となり易く、このシラノール基と基板がシロキサン結合を作る反応が速やかに進行する。また、シラノール重合反応は水を生成する反応であるため、反応溶液中の水含有量が多いと、シラノール重合反応が抑制される。よって、水含有量が多い場合には、これらの相乗効果のため、均一性良くアミノ化される。
一方、担体とシランカップリング剤との反応時間は、1時間未満であるのが好ましい。反応時間が1時間以上では、均一性が悪くなり、固定量も低減する。これは、反応時間が長いとシランカップリング剤同士の重合反応が進み、重合反応生成物の凝集体が基板表面に付着するためと考えられる。
以上から、アミノ基の導入工程においては、反応時間1時間未満かつ反応溶液の水含有量10%以上で行うのが望ましい。実際の操作性の観点からは、反応時間を1分〜1時間とし、反応液の水含有量を10%〜50%にするのが好ましい。
また、上記実施形態では、生体分子としてDNAを用いたが、RNA、たんぱく質、PNA、糖鎖、これらの複合物となった生体分子を用いてもよい。
たんぱく質を用いる場合、たんぱく質が水溶液中で負に帯電する場合には、固定化溶液に添加する界面活性剤として、陽イオン性界面活性剤を用いるのが望ましい。一方、たんぱく質が水溶液中で正に帯電する場合には、界面活性剤として陰イオン性界面活性剤を用いるのが望ましい。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、カルボン酸塩などが挙げられる。これらの陰イオン性界面活性剤を用いると、プローブ固定効率・均一性が向上する。
また、上記実施形態では、まずシランカップリング剤を用いて担体表面にアミノ基を導入したが、カルボキシル基、エポキシ基等を持つ分子を固定する場合でも、あるいはアビジンをコーティングして活性基を固定する場合でも、前述した界面活性剤の添加によって同様の効果が得られる。
以上の固定方法を用いることで、例えば、プローブ生体分子の密度が2×1012分子/cm2以上であり、非特異的に吸着し、共有結合を形成して結合していないプローブ生体分子の割合が10%以下であるチップ表面を形成することができる。
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
下記、実施例では、本発明の製造方法を平板型DNAマイクロアレイ及びビーズアレイに用いた例を示す。
<実施例1> 基板へのリンカー分子(活性基を有する分子)の固定
担体として、ホウ珪酸ガラスからなるスライドガラスを用意した。図1で示したプロセスに従って、基板をNaOH水溶液で洗浄し、HCl水溶液で洗浄し、純水ですすいだ後に減圧乾燥した。洗浄した基板表面に、シランカップリング剤である3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimthoxysilane)を反応させ基板表面をアミノ化した(図3(1)の参照)。なお、溶媒は、メタノールを用い、シランカップリング剤の濃度は、3%(Volume/Volume)である。また、反応温度は室温であり、反応時間は5分である。
担体として、ホウ珪酸ガラスからなるスライドガラスを用意した。図1で示したプロセスに従って、基板をNaOH水溶液で洗浄し、HCl水溶液で洗浄し、純水ですすいだ後に減圧乾燥した。洗浄した基板表面に、シランカップリング剤である3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimthoxysilane)を反応させ基板表面をアミノ化した(図3(1)の参照)。なお、溶媒は、メタノールを用い、シランカップリング剤の濃度は、3%(Volume/Volume)である。また、反応温度は室温であり、反応時間は5分である。
次に、アミノ化した基板に、末端にイソチオシアナート基を有するPDC(Phenylene diisothiocyanate)を作用させた。なお、溶媒は、DMFを用い、PDCの濃度は、0.6%(Weight/Volume)である。また、反応温度は室温(15℃〜30℃程度)であり、そのときの反応時間は12時間である。尚、反応温度は基本的には反応が起こる温度であればよく、4℃〜40℃の範囲であれば良い。こうして、活性基(リンカー分子)を固定化した基板を得た(図3(2)参照)。
<実施例2> プローブDNAを含む反応液の調製
弱アルカリの炭酸バッファ(1M Na2CO3と1M NaHCO3を混合しpH9.0に調整)に、50個の塩基配列を持つ50merプローブDNAを100μM溶解させた。この溶液を分取し、陽イオン性界面活性剤であるCTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)を、0mMから50mMの間の濃度でそれぞれ添加した溶液を得た。
弱アルカリの炭酸バッファ(1M Na2CO3と1M NaHCO3を混合しpH9.0に調整)に、50個の塩基配列を持つ50merプローブDNAを100μM溶解させた。この溶液を分取し、陽イオン性界面活性剤であるCTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)を、0mMから50mMの間の濃度でそれぞれ添加した溶液を得た。
なお、CTABの臨界ミセル濃度(CMC)は0.8mMと報告されており(Langumuir Vol. 1 No.3, p.352, 1985)、臨界ミセル濃度前後付近の濃度を添加した溶液を得たことになる。
<実施例3> 基板へのプローブDNAの固定化
実施例1で得た複数の基板に、実施例2で調製した濃度の異なる反応液をそれぞれスポッティングし、プローブDNAが固定された基板を得た。なお、反応温度は25℃で、反応時間は4時間である。また、反応させる時に溶液が乾燥しないよう、充分湿度を保った環境で反応させた。
実施例1で得た複数の基板に、実施例2で調製した濃度の異なる反応液をそれぞれスポッティングし、プローブDNAが固定された基板を得た。なお、反応温度は25℃で、反応時間は4時間である。また、反応させる時に溶液が乾燥しないよう、充分湿度を保った環境で反応させた。
<実施例4> 評価
実施例3で得られた基板のプローブDNAの固定量を測定するために、固定化されたプローブDNAの3’末端にTerminal deoxynucleotidyl transferase を用いて蛍光色素の付いた核酸塩基(ddTTP-Cy5)を修飾し、蛍光スキャナを用いて蛍光色素cy5を励起させて得られた蛍光強度を測定した。
実施例3で得られた基板のプローブDNAの固定量を測定するために、固定化されたプローブDNAの3’末端にTerminal deoxynucleotidyl transferase を用いて蛍光色素の付いた核酸塩基(ddTTP-Cy5)を修飾し、蛍光スキャナを用いて蛍光色素cy5を励起させて得られた蛍光強度を測定した。
図5に、その結果を示す。図5から、CTABの添加量に従って、プローブDNAの平均固定量が増加し、臨界ミセル濃度(CMC)である0.8mM付近では、CTABを添加しない場合の約4倍に増加し、その後低下することがわかる。
図6に、プローブDNA固定化均一性とCTAB添加濃度の関係を示す。均一性は複数のスポット間の蛍光強度のCv(Coefficient of Variation)値で表している。CTAB添加濃度がCMC付近の場合、均一性が向上することがわかる。よって、CTABを適正な濃度で添加することによりプローブDNAの均一性にも効果があることが分かる。
また、実施例3で得た基板を用いて、CTABを添加した時の非特異的に吸着するプローブDNAの量について調べた。アミノ基を末端に持つプローブDNAは、基板表面の活性基と反応して共有結合を作り固定されるが、アミノ基を末端に持たないプローブDNAは共有結合を作らない。よって、アミノ基を持たないプローブDNAが付着した量は、非特異的に吸着した量に相当する。ここでは、非特異吸着量の割合を算出した。非特異吸着量の割合は、アミノ基を5’末端に持つプローブDNAの固定量に対する、アミノ基を末端に持たないプローブDNAの固定量の比を、前述した蛍光色素を用いて測定した。実験に用いたプローブDNAは、50merの同じ塩基配列を持つものである。
図7は、CTAB濃度と非特異吸着量割合の関係を示す。CTABを添加することにより非特異的に吸着するプローブDNAの割合を10%以下に低減できることが分かる。
以上より、プローブDNAの基板表面への固定化反応効率を約2倍以上に上げるためには、CTABの濃度を0.1CMC(0.08mM)以上の範囲で添加することが望ましいことがわかる。0.1CMC以上であれば、図7に示すように、非特異的に吸着するプローブDNA割合を減少させることもできる。
一方、CTAB濃度を100CMC(80mM)以上と高くすると、基板表面と反応溶液の濡れ性が非常に良くなるために、スポット形状が対称形の円ではなく、図8(2)に示すようにゆがんだ形となり易い。よってCTAB濃度は100CMC以下が望ましいことが分かる。
プローブDNAを固定化するためにスポットされる溶液の量は、少ない場合一スポット当たり数pL程度である。湿度が高い環境下であっても溶液中の水分が蒸発し、スポットによってCTAB濃度に変化が見られる場合がある。この場合、CTAB濃度の変化に対してプローブDNA固定量があまり変化しないことが望ましい。プローブDNA固定量があまり変化しないCTAB濃度の領域は、図5から1CMC(0.8mM)以上、好ましくは10CMC(8mM)以上である。CTAB濃度に対して変動の少ない領域でプローブDNAを固定でき、かつ反応効率を向上させ、非特異的に吸着するプローブDNAを低減させる場合には、この濃度範囲でCTABを添加することが望ましいことが分かる。
<実施例5> ハイブリダイゼーション
固定化したプローブDNAに対するハイブリダイゼーション量の評価を行った。実施例1〜3により、0.1CMC≦C≦100CMCの間の濃度でCTABを添加した溶液を用いてプローブDNAを固定した基板に、プローブDNAと完全相補的なターゲットDNAをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液として5xSSC(Standard Saline Citrate)、0.5%SDS溶液(Sodium Dodecylsulphate)を用い、42℃でハイブリダイゼーションさせた後に、2xSSC、0.1%SDS溶液、1xSSC、0.1%SDS溶液で洗浄を行った。完全相補的なターゲットDNAの末端には、蛍光分子であるCy5が付加されている。
固定化したプローブDNAに対するハイブリダイゼーション量の評価を行った。実施例1〜3により、0.1CMC≦C≦100CMCの間の濃度でCTABを添加した溶液を用いてプローブDNAを固定した基板に、プローブDNAと完全相補的なターゲットDNAをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液として5xSSC(Standard Saline Citrate)、0.5%SDS溶液(Sodium Dodecylsulphate)を用い、42℃でハイブリダイゼーションさせた後に、2xSSC、0.1%SDS溶液、1xSSC、0.1%SDS溶液で洗浄を行った。完全相補的なターゲットDNAの末端には、蛍光分子であるCy5が付加されている。
図9は、ハイブリダイゼーション後、蛍光スキャナを用いて蛍光強度を測定した結果を示す。CTABを添加した溶液でプローブDNAを固定することで、ハイブリダイゼーション後の蛍光強度が増加することがわかった。
<実施例6> プローブDNAの密度の測定
実施例3により固定されたプローブDNAの密度を詳細に調べた結果を示す。プローブDNAの付着量を、X線反射率法を用いて測定した結果、CTABを0.1CMC以上添加した場合、プローブDNA密度は2×1012分子/cm2以上であった。
実施例3により固定されたプローブDNAの密度を詳細に調べた結果を示す。プローブDNAの付着量を、X線反射率法を用いて測定した結果、CTABを0.1CMC以上添加した場合、プローブDNA密度は2×1012分子/cm2以上であった。
図10は、プローブDNA901の密度が2×1012分子/cm2の時の基板表面の模式図である。CTABを0.1CMC以上添加することで、プローブDNAの密度を2×1012分子/cm2以上とし、すなわち、プローブDNA同士の間隔を7nm以内にすることができることがわかった。
<実施例7> アミノ基導入工程における反応溶液の水含有量と反応時間の影響
実施例1におけるアミノ基導入の際の、反応溶液の水含有量と反応時間との影響を調べた。表1に、反応溶液の水含有量と、反応時間、プローブDNA均一性及び固定量の関係を調べた結果を示す。
実施例1におけるアミノ基導入の際の、反応溶液の水含有量と反応時間との影響を調べた。表1に、反応溶液の水含有量と、反応時間、プローブDNA均一性及び固定量の関係を調べた結果を示す。
プローブDNA均一性はアレイ内スポット間の蛍光強度のCv値で表している。反応溶液の水含有量が10%未満と少ないと、均一性が悪くなり、固定量も低減するが、水含有量が10%以上と多い領域では、プローブDNA固定均一性が良く、かつDNA固定量も多いことがわかった。一方、反応時間については、反応時間1時間以上では、均一性が悪くなり、固定量も低減することがわかった。
以上から、反応時間1時間未満かつ反応溶液の水含有量10%以上でアミノ化するのが望ましいことがわかる。
<実施例8>
遺伝子解析用ビーズアレイを製造するために、基板の代わりにビーズを用いて、実施例1〜3の方法で、プローブDNAを固定したビーズを得た。また、1つのビーズに1つの塩基配列を持つプローブDNAを固定することにより、複数種類のビーズを得た。プローブDNAの固定は、反応溶液にビーズを浸漬することで行った。ここで用いたビーズの材質はホウ珪酸ガラスであり、ビーズ径は約100umである。
遺伝子解析用ビーズアレイを製造するために、基板の代わりにビーズを用いて、実施例1〜3の方法で、プローブDNAを固定したビーズを得た。また、1つのビーズに1つの塩基配列を持つプローブDNAを固定することにより、複数種類のビーズを得た。プローブDNAの固定は、反応溶液にビーズを浸漬することで行った。ここで用いたビーズの材質はホウ珪酸ガラスであり、ビーズ径は約100umである。
図11は、こうして製造した互いに異なるプローブDNAが固定化された10種類のビーズ1002をマイクロ流路1001に収め1アレイとした場合の、遺伝子解析用ビーズアレイを示す。
このビーズについても、プローブDNA固定反応溶液に相関移動触媒である陽イオン性界面活性剤を添加することで、図5、図6、図7で示した結果と同様に、プローブDNA固定効率の向上と均一性向上を図ることができた。
また、プローブDNAの非特異吸着量を減少させることができた。更には、アミノ化反応を反応時間1時間以内、反応溶液水含有量10%以上とすると表1に示した結果と同様にプローブDNA固定効率と均一性が向上した。
これらの条件でビーズにプローブDNAを固定し、プローブDNAと完全相補的なDNAであり、蛍光分子であるCy5の付いたターゲットDNAをハイブリダイゼーションさせた時の蛍光強度と均一性を調べた。蛍光強度は蛍光スキャナーを用いて測定した。比較として、アミノ化条件として反応時間5時間、水含有量2%を用いてアミノ化し、界面活性剤を添加しない条件でプローブDNAを固定化したビーズも用いた。その結果、本発明の条件でプローブDNAを固定化したビーズを用いた場合の方が、ハイブリダイゼーション後の蛍光強度が高くなった。これは、ビーズ表面にターゲットDNAを効率よく捕獲することができることを意味する。また、同じプローブDNAを固定したビーズ間の蛍光強度のバラツキも低減できることがわかった。
301…プローブDNA、401…プローブDNA、402…界面活性剤、403…活性基、801…プローブDNAスポット、1001…プローブDNA、1101…マイクロ流路、
1102…ビーズ
1102…ビーズ
Claims (14)
- 基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサの製造方法において、
基板表面にプローブ用生体分子を固定する際に、反応溶液に界面活性剤を添加して固定する
ことを特徴とするバイオセンサの製造方法。 - 前記プローブ用生体分子が核酸であり、
前記界面活性剤が陽イオン性界面活性剤である
ことを特徴とする請求項1のバイオセンサの製造方法。 - 前記プローブ用生体分子がたんぱく質であり、
たんぱく質分子の実効電荷がマイナスの場合、前記界面活性剤として陽イオン性界面活性剤を用い、
実効電荷がプラスの場合、前記界面活性剤として陰イオン性界面活性剤を用いる
ことを特徴とする請求項1のバイオセンサの製造方法。 - 前記界面活性剤の濃度Cが、
0.1CMC≦C≦100CMC(CMC:前記界面活性剤の臨界ミセル濃度)
であることを特徴とする請求項1のバイオセンサの製造方法。 - 前記界面活性剤の濃度Cが、
1CMC以上(CMC:前記界面活性剤の臨界ミセル濃度)である
ことを特徴とする請求項1のバイオセンサの製造方法。 - 前記プローブ用生体分子を固定する際に、シランカップリング剤分子を介して前記生体分子を固定する場合、シランカップリング剤分子を基板表面に反応させるときの反応溶液水含有量が10%以上、反応時間が1時間以下であることを特徴とする請求項1のバイオセンサの製造方法。
- 基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサにおいて、基板表面にプローブ用生体分子を固定する際に、反応溶液に界面活性剤を添加して固定させたことを特徴とするバイオセンサ。
- 前記バイオセンサにおいて、プローブ生体分子の密度が2×1012分子/cm2以上である請求項7のバイオセンサ。
- 前記バイオセンサにおいて、非特異的に吸着したプローブ生体分子の割合が10%以下である請求項7のバイオセンサ。
- 前記プローブ用生体分子が核酸であり、前記界面活性剤が陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項7のバイオセンサ。
- 前記プローブ用生体分子がたんぱく質であり、たんぱく質分子の実効電荷がマイナスの場合、前記界面活性剤として陽イオン性界面活性剤を用い、
実効電荷がプラスの場合、前記界面活性剤として陰イオン性界面活性剤を用いることを特徴とする請求項7のバイオセンサ。 - 前記界面活性剤の濃度Cが、
0.1CMC≦C≦100CMC(CMC:前記界面活性剤の臨界ミセル濃度)
であることを特徴とする請求項7のバイオセンサ。 - 前記界面活性剤の濃度Cが、1CMC以上(CMC:前記界面活性剤の臨界ミセル濃度)であることを特徴とする請求項7のバイオセンサ。
- 前記バイオセンサにおいて、プローブ用生体分子を固定する際に、シランカップリング剤分子を介して前記生体分子を固定する場合、シランカップリング剤分子を基板表面に反応させるときの反応溶液中の水含有量が10%以上、反応時間が1時間以下であることを特徴とする請求項7のバイオセンサ。
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