JP2012023964A

JP2012023964A - 核酸分析用デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析用デバイスの製造方法

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Publication number: JP2012023964A
Application number: JP2010162403A
Authority: JP
Inventors: Toshiro Saito; 俊郎斎藤; Kazunari Imai; 一成今井
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2012-02-09
Anticipated expiration: 2030-07-20
Also published as: JP5309092B2

Abstract

【課題】本発明の目的は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブを固定した微粒子を基板上に規則正しく並べ、核酸分析のスループットを向上させることに関する。
【解決手段】本発明は、核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを微粒子に予め固定しておき、当該微粒子の直径よりも小さな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。また、微粒子が表面電荷を有する場合には、微粒子の直径と同等あるいは微粒子の直径よりも大きな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、核酸分析用デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析用デバイスの製造方法に関する。

核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。

現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。

これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。

非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。

また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。

さらに、非特許文献３では、平滑基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。

以上のように、平滑基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。

一方、平滑基板上に核酸断片試料を数多く固定する方法が提案されている。例えば、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定した微粒子の液滴を固相基板上の任意の反応領域に吐出することで粒子アレイを作る方法が特許文献１に開示されている。また、官能基を表面に導入した金属コロイド粒子を基板上に最密充填的に並べたことを特徴とする光学的分析装置用測定チップが特許文献２に開示されている。これらの方法を組合わせることで、平滑基板上に核酸試料断片をある程度数多く固定することが可能である。すなわち、平滑基板全面に微粒子固定用接着層を設け、その上に、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定した微粒子を含む液滴を吐出することで基板上にプローブを分散固定することが実現できる。

特開２００５−７７２８４号公報特開平１０−１６０７３７号公報

Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380. Genome Research 2008, Vol. 18, pp 1051-1063. Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109. Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021. P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640.

本願発明者がパラレル解析法のスループット向上について鋭意検討した結果、次のような知見を得るに至った。

上記のようなパラレル解析法のスループットをより一層高めるためには、できるだけ高密度、且つ規則正しく、平滑な基板上に核酸試料を整列させて固定することが望まれる。あらかじめ微粒子に核酸試料を担持させておく方法は、解析するＤＮＡ断片数が莫大であることから、試料のハンドリング上非常に有利である。核酸試料を担持させた微粒子を平滑基板上にばらまいて固定させる方法は容易ではあるが、蛍光測定で配列を読み取る段になると、ＣＣＤカメラで検出したランダムに存在する微粒子画像から数値データを取得する際、膨大なデータ処理時間がかかってしまう。

一方、多数の穴を形成したプレートをあらかじめ用意しておき、その上に核酸試料を担持した微粒子を並べる方法では、一度のアッセイで読むことのできるＤＮＡ断片数はプレートの穴径で決まってしまい、高々１０⁴断片／スライドガラスであり、スループットの向上には限界がある。

また、インクジェットなどの吐出技術でプローブ付きの微粒子を基板上に固定する方法では、制御できる位置分解能から固定できる微粒子間隔は数十ミクロンにならざるを得ず、固定密度は１０⁴個／mm²程度が限界である。また、一箇所に微粒子を一個ずつ固定することはできず、個々の固定サイトに固定されるプローブ数を制御することはできない。

本発明の目的は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブを固定した微粒子を基板上に規則正しく固定密度を１０⁴個／mm²以上に高く並べ、核酸分析のスループットを向上させることに関する。

本発明は、核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを微粒子に予め固定しておき、当該微粒子の直径よりも小さな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。

本発明は、核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを微粒子に予め固定しておき、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。プローブを高密度に固定するため及び個々の固定サイトの固定プローブ数を制御するためには、プローブを予め固定した微粒子と、リソグラフィなどの微細加工技術で作製した微小で高密度に配置した接着用パッドの組み合わせが不可欠である。

本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、１ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、１０⁶核酸断片／mm²という高密度が容易に達成できる。

核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための図。核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するための図。核酸分析デバイスのプローブ分子として核酸を用いた場合のプローブ分子の微粒子への固定方法の一例を説明するための図。核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための図。

実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しているデバイスを開示する。

また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、微粒子と接着用パッドとが化学結合を介して結合している装置を開示する。

また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスの製造方法において、予め前記プローブ分子を固定しておいた前記微粒子を、接着用パッドを備えた基板上に供給することで、前記基板上の所定の位置に前記微粒子を固定することで製造することを特徴とする、核酸分析用デバイスの製造方法を開示する。

また、実施例では、微粒子１個に対して、プローブ分子が一分子固定されていることを開示する。

また、実施例では、プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを開示する。

また、実施例では、微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを開示する。

また、実施例では、接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを開示する。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。

本実施例のデバイスの構成を、図１を用いて説明する。平滑基板１０１の上に接着パッド１０２が規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成されている。接着パッド１０２と微粒子１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着パッド１０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑基板１０１との相互作用が弱く、接着パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド１０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基１０６には、平滑基板１０１と接着パッド１０２との組合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子１０５は、微粒子１０３と接着パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子１０５の末端の官能基１０７は、微粒子１０３との接着性をもたらす。また、線状分子１０５として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基１０６を有する側鎖と官能基１０７を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。

微粒子１０３としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基１０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基１０７としてビオチンを用いることができる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基１０７と同様に予め修飾しておき、微粒子１０３と反応させておく。また、核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いることもできる。発現タンパク質にアビジンタグを導入する試薬が市販されており、このような試薬を用いてＤＮＡポリメラーゼを合成することにより、例えば、市販のストレプトアビジンで表面が修飾された半導体微粒子表面に容易に核酸合成酵素を固定できる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸分子の一本鎖を用いた場合には、特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。

また、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、非特定の核酸試料分子を捕捉できる。この場合も、ヌクレオチドを供給することにより基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。

一つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４は、一分子であることが好ましい。一つの微粒子１０３に一分子のプローブ分子１０４を固定するためには、微粒子１０３の粒径が小さいほど好ましい。一つの核酸捕捉プローブ分子が微粒子表面に固定されると、微粒子上の電荷の状態が変化して、他の未固定の核酸捕捉プローブ分子の固定反応を阻害する効果が生じる。微粒子サイズが小さくなると、この効果が大きくなるからである。発明者らが鋭意検討した結果、微粒子サイズとして約２０ｎｍ以下が好ましいことが判明している。また、微粒子１０３とプローブ分子１０４との結合反応を液相で行い、かつ、微粒子１０３に対してプローブ分子１０４の濃度を約１／１０以下に下げて反応させることで、微粒子１０３の直径が１μｍ程度であっても、一つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４を一分子とすることができる。一方、微粒子１０３のサイズが大きくなるに従い、プローブ分子１０４の固定密度が低下してしまう。簡便な蛍光検出でプローブを識別する場合回折限界を考慮するとプローブ間が１μｍ程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子１０３のサイズは１μｍ以下であることが適している。

接着パッド１０２を平滑基板１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。

接着パッド１０２を平滑基板１０１上に形成した後、微粒子１０３と接着パッド１０２を結ぶ線状分子１０５を供給し、接着パッド１０２上に線状分子１０５を固定する。この際、平滑基板１０１上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子１０５を供給する前に、平滑基板１０１との接着力の強い材料を平滑基板１０１上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。

次に、予めプローブ分子１０４を表面に固定させた微粒子１０３を基板上に供給して、微粒子１０３を接着パッド１０２上に固定させることにより、核酸分析用デバイスを作製する。

接着パッド１０２上に微粒子１０３を固定させる際、一つの接着パッド１０２に複数個の微粒子１０３が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド１０２には、１個の微粒子１０３を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド１０２に１個の微粒子１０３を固定できることを見出した。接着パッド１０２に比べて同等以上の大きさの微粒子１０３が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。

１個の微粒子１０３にプローブ分子１０４を一分子固定するには、微粒子１０３の直径Ｄが２０ｎｍ以下であることが好ましいことから、接着パッド１０２の直径ｄは２０ｎｍ以下であることが好ましい。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子１０３がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が１個になることが判明した。したがって、微粒子１０３の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて小さいことが好ましく、微粒子１０３の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド１０２の直径ｄは必ずしも微粒子１０３の直径Ｄよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。

本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、プローブ分子１０４に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、プローブ分子１０４がＤＮＡプローブである場合には、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。

微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Nanotechnology，２００７，vol.１８，pp ０４４０１７−０４４０２１.（非特許文献４）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。

微粒子として、半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。

微粒子として、高分子材料からなる微粒子を用いた場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十ｎｍから数μｍまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定するプローブ分子１０４の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、プローブ分子１０４を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。

核酸分析デバイスの製造方法の一例を、図２を用いて説明する。平滑な支持基体２０１上に電子線用ポジ型レジスト２０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径１５ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ，歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。

例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着用パッド２０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着用パッド２０３に線状分子２０４を反応させる。接着用パッド２０３が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基２０５としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基２０６には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着用パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着用パッドを形成した以外の平滑基板表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子２０７でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（ｐＨ５〜ｐＨ６程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させＯＨ基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。

微粒子２０８表面には、予めアビジン２０９を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が１５〜２０ｎｍである製品名「Ｑｄｏｔ(Ｒ)ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。核酸捕捉プローブ２１０としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子上に固定できる。核酸捕捉プローブ２１０として核酸合成酵素を用いる場合には、予め、RTS AviTag E. coliビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。

核酸捕捉プローブを固定した微粒子を接着用パッドと反応させることにより、本実施例の核酸分析デバイスを製造することができる。

本実施例では、プローブ分子を一分子だけ固定した核酸分析デバイスの製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子のプローブ分子を固定する方法を図３を用いて説明する。本実施例ではプローブ分子として核酸を用いた場合について記載するが、核酸合成酵素などの他のプローブ分子の場合にも同様に行うことができる。微粒子３０１の表面に核酸試料分子３０４を捕捉するための結合サイト３０２を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子（インビトロジェン社製）を微粒子として用いることができる。核酸試料分子３０４には予め、結合サイト３０３を修飾しておく。結合サイト３０３には微粒子３０１表面の結合サイト３０２と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト３０２として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト３０３としてビオチンを用いる。結合サイト３０３を末端修飾したプライマーを用い、核酸試料をテンプレートとしたＰＣＲ反応産物を合成することで核酸試料分子３０４の末端に結合サイト３０３を結合することは容易にできる。次に、微粒子３０１と核酸試料分子３０４を反応させることで、核酸試料分子３０４を微粒子３０１に捕捉する。微粒子３０１一個につき一分子の核酸試料分子３０４を固定するには、単位体積中の核酸試料分子３０４の分子数を微粒子３０１の個数よりも小さくすることが好ましい。微粒子３０１よりも核酸試料分子３０４が過剰にあると微粒子３０１一個当たりの捕捉核酸試料分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子３０１の数を核酸試料分子３０４の数よりも１０倍多くして反応させると、凡そ９０％の微粒子３０１には核酸試料分子３０４は捕捉されず、約９％の微粒子３０１には核酸試料分子３０４が一分子捕捉されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、核酸試料分子３０４を捕捉した微粒子３０１のみを捕集すれば、捕集した微粒子３０１のうち９０％以上は核酸試料分子３０４を一分子のみ捕捉した微粒子３０１となる。捕集方法として、例えば、磁気微粒子３０７に核酸試料分子３０４を結合させて磁石で捕集することができる。核酸試料分子３０４の末端配列と相補な配列を持ち末端に結合サイト３０６が修飾されたオリゴヌクレオチド３０５を用意し、結合サイト３０６と結合する結合サイト３０８を予め、磁気微粒子３０７の表面にコートしておく。核酸試料分子３０４をＰＣＲで増幅する際に用いたプライマー配列を利用してオリゴヌクレオチド３０５の配列を決めることができる。こうして作製した磁気微粒子３０７を用いることで核酸試料分子３０４を一分子を捕捉した微粒子３０１を９０％以上と高い割合で分離、収集することができる。磁気微粒子３０７から核酸捕捉微粒子３０１を単離するには、例えば、核酸試料分子３０４とオリゴヌクレオチド３０５の二本鎖を分離するディネイチャー処理（高温処理）を用いることができる。単離した核酸捕捉微粒子３０１は実施例１に記載した方法を用いることで、平滑基板上の所定の配置に固定することができ、本実施例の核酸試料分子３０４を一分子だけ固定した核酸分析デバイスを製造することができる。

さらに、核酸試料分子を一分子だけ捕捉した微粒子の割合を高めるには、電気泳動法を用いることが有効である。すなわち、微粒子に捕捉された核酸の分子数により、微粒子上の電荷量が異なることを利用し、核酸を捕捉したままの状態で微粒子をゲル、例えばアガロース中を泳動させることで、電荷量すなわち捕捉された核酸分子数の違いにより泳動パターンを分離させる。核酸が捕捉されない微粒子は移動距離がもっとも短く、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子が次に移動距離の短いところにバンドを形成する。したがって、このバンドを切り出すことで、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子を純度高く、得ることができる。

本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図４を参照しながら説明する。

本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート４０１と検出窓４０２と溶液交換用口である注入口４０３と排出口４０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス４０５を設置する。なお、カバープレート４０１と検出窓４０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓４０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０８から発振するレーザ光４０９および４１０を、レーザ光４０９のみをλ／４板４１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー４１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ４１３によって集光し、その後、プリズム４１４を介してデバイス４０５へ臨界角以上で照射する。

以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。この場合、レーザ照射により、デバイス４０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓４０２を介して出射される。また、検出窓４０２より出射される蛍光は、対物レンズ４１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ４１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ４１７により２次元ＣＣＤカメラ４１８上に結像される。

逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献５）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射（例えば波長３５５ｎｍ）あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射（例えば波長３５５ｎｍ）で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。

微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏｔ(Ｒ)５６５ conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。

上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。

１０１平滑基板
１０２接着パッド
１０３，２０８，３０１微粒子
１０４プローブ分子
１０５，２０４線状分子
１０６，１０７，２０５，２０６線状分子末端の官能基
２０１平滑な支持基体
２０２電子線用ポジ型レジスト
２０３接着用パッド
２０７非特異吸着防止用分子
２０９アビジン
２１０核酸捕捉プローブ
３０２，３０３，３０６，３０８結合サイト
３０４核酸試料分子
３０５オリゴヌクレオチド
３０７磁気微粒子
４０１カバープレート
４０２検出窓
４０３注入口
４０４排出口
４０５デバイス
４０６流路
４０７，４０８ＹＡＧレーザ光源
４０９，４１０レーザ光
４１１ λ／４板
４１２ダイクロイックミラー
４１３レンズ
４１４プリズム
４１５対物レンズ
４１６光学フィルタ
４１７結像レンズ
４１８２次元ＣＣＤカメラ

Claims

検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しているデバイス。
検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径と同等あるいは前記微粒子の直径以上の大きさであるデバイス。
請求項１あるいは請求項２記載の核酸分析用デバイスにおいて、
前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とするデバイス。
請求項１あるいは請求項２記載の核酸分析用デバイスにおいて、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とするデバイス。
請求項１あるいは請求項２記載の核酸分析用デバイスにおいて、
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。
請求項１あるいは請求項２記載の核酸分析用デバイスにおいて、
前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とするデバイス。
請求項１あるいは請求項２記載の核酸分析用デバイスにおいて、
前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。
検出対象の核酸を捕捉できる核酸分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合している核酸分析装置。
検出対象の核酸を捕捉できる核酸分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径以上の大きさである核酸分析装置。
請求項８あるいは請求項９記載の核酸分析装置において、
前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析装置。
請求項８あるいは請求項９記載の核酸分析装置において、
前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする核酸分析装置。
請求項８あるいは請求項９記載の核酸分析装置において、
前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
請求項８あるいは請求項９記載の核酸分析装置において、
前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
請求項８あるいは請求項９記載の核酸分析装置において、
前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする核酸分析装置。
検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスの製造方法において、予め前記プローブ分子を固定しておいた前記微粒子を、接着用パッドを備えた基板上に供給することで、前記基板上の所定の位置に前記微粒子を固定することで製造することを特徴とする、核酸分析用デバイスの製造方法。
請求項１５記載の核酸分析用デバイスの製造方法において、
前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析用デバイスの製造方法。