JP4022400B2

JP4022400B2 - 生化学検体の検出方法

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Publication number: JP4022400B2
Application number: JP2001401649A
Authority: JP
Inventors: 央山口; 忠顕薮林; 弘明三澤; 正純田中
Original assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2021-12-28
Also published as: JP2003329677A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、プローブＤＮＡに修飾したセラミックス微粒子標識からの光散乱強度を検出して目的の生化学検体を検出する方法に係り、基板に配列されたプローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端側が基板側に向くように構成することで、目的ＤＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションした後に特定粒径のセラミックス微粒子を標識処理するとハイブリダイゼーションしたＤＮＡにのみ当該微粒子標識を修飾できることから、バックグランドノイズが少なく、検出精度を高精度化できる生化学検体の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈折率の変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案されている。詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これとサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作させることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハイブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋構造のＤＮＡを有する場合の屈折率の変化を測定する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出には、蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記修飾効果が異なること、種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
前記ＳＰＲ分光法において、前述したハイブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであるため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、ＳＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。
【０００８】
この発明は、ＳＰＲ分光法を用いた生化学検体、すなわち二重螺旋構造のＤＮＡの検出方法において、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ応答を増幅可能として、検出精度を高精度化すること、さらにＳＰＲ分光法以外の光散乱法、顕微鏡観察法などの方法でも当該生化学検体の検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡単な工程からなる生化学検体の検出方法の提供を目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、前記蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出に問題を有することから、光退色の懸念がある蛍光法に換えてＳＰＲ（ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法を用いた方法を検討しており、このＳＰＲ応答の増幅を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有効性を検討中に、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定であること、金微粒子修飾量はＤＮＡ塩基数に依存することを知見し、これよりプローブＤＮＡ塩基数の違いによってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していることを知見した。
【００１０】
そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したところ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾ができないこと、すなわち塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないことを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけるＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述のごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハイブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上でループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡにも修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾することが可能であることを知見した。
【００１２】
さらに、発明者らは、先の金微粒子修飾に換えてハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡに蛍光標識の修飾を行ったところ、金微粒子修飾同様にハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ蛍光標識を設けることが可能であり、蛍光標識の修飾工程が著しく簡素化されるとともに、目的ＤＮＡにのみ蛍光を発するように構成できることから高精度な検出が可能であることを知見した。
【００１３】
そこでさらに発明者らは、蛍光標識に換えて粒径が６００ｎｍのコロイダルシリカを用いてハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡにシリカ微粒子標識の修飾を行ったところ、２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を設けることが可能であり、例えばこれに全反射条件下でＨｅ−Ｎｅレーザーの光を当てるとシリカ微粒子によって光が散乱されるため、この散乱光の検出が可能でイメージング処理も可能となり、蛍光標識より高精度の検出が実現できることを知見し、この発明を完成した。
【００１４】
すなわち、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、標識修飾が可能な部位が基板側に位置するようループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方にセラミックス微粒子標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方のセラミックス微粒子標識を検出する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下にこの発明の特徴である各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が基板表面側にあるように構成した検出チップ並びにループ構造について説明する。
【００１７】
まず、検出チップの作製について説明すると、ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００１８】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。なお、プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００１９】
金コロイド修飾方法は、上記の検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾させた。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００２１】
ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００２２】
上記方法で、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。この時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなるにつれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、ＳＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例するため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成した。
【００２３】
また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察し、修飾された金コロイド粒子数を計測したところ、塩基長１０では、約４００個／μｍ²、塩基長３０では、約７００個／μｍ²の金コロイドの修飾が観察されたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察されなかった。
【００２４】
これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイドの修飾が行なわれないことを確認した。
【００２５】
検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡの鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、まったく金コロイド修飾が起こらないことを確認した。
【００２６】
前述の合成によるプローブＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、前述と同様の方法で検出チップを作製した。
【００２７】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して前述した金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００２８】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダイゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は困難であることを確認した。
【００２９】
【表１】

【００３０】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハイブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度のシフトにバラツキがみられると推測される。
【００３１】
そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施する工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チップに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３２】
すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのループ構造が解消された後に金コロイド修飾を行なえば、金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば金コロイド修飾が可能であると考えた。図１Ａ，Ｂ参照。
【００３３】
換言すれば、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることにより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られると考えた。
【００３４】
そこで、実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子とした検出チップを用い、前述の各工程で、プローブＤＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロイド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並びに空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。
【００３５】
プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾が行われていることが明らかになった。
【００３６】
すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きかった。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さかった。
【００３７】
要するに、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中ともに、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能となった。すなわち、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さくすることが可能であることを確認した。
【００３８】
【表２】

【００３９】
この発明は、以上の知見に基づきなされたもので、前記の金コロイド修飾に換えて、散乱光の検出が可能な所要粒径のセラミックス微粒子標識の修飾を施すことで、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的にセラミックス微粒子標識の修飾が可能であり、セラミックス微粒子からの散乱光強度を、スキャニング、顕微鏡画像解析装置などの公知の散乱光の検出方法で検知あるいは画像化することで、バックグランドノイズを大幅に低減して定量的に目的ＤＮＡを検出したり、あるいはイメージング処理が可能となるのである。
【００４０】
また、ハイブリダイゼーション工程の実行中又は実行後に検体ＤＮＡにセラミックス微粒子標識を修飾することができ、この際同時にプローブＤＮＡにも修飾することもでき、これらによって修飾されたセラミックス微粒子標識を検出することで目的遺伝子に検知できる。
【００４１】
この発明において、基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等のプローブＤＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。また、基板に貴金属薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
ガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用できる。
【００４２】
この発明において、プローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４３】
この発明において、基板上、あるいはさらに貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４４】
また、緩衝液としては、例えばＫＨ₂ＰＯ₄とＫ₂ＨＰＯ₄を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４５】
この発明において、プローブＤＮＡは、その末端を一方は基板表面あるいは基板上の貴金属薄膜に固定し、他方端あるいはその近傍にはセラミックス微粒子標識を修飾するために、各々の前記末端を前記基板表面あるいはセラミックス微粒子標識と接合可能な物質で修飾しておくことが望ましい。
【００４６】
この発明において、基板表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。
緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００４７】
この発明において、セラミックス微粒子標識には、標識としての微粒子が反射する光で特定波長光を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にすることができれば、いずれの形態も採用できるが、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００４８】
この発明において、セラミックス微粒子標識をプローブＤＮＡに修飾する方法としては、例えば微粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダルシリカのごとく、微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００４９】
また、プローブＤＮＡの末端にビオチンを修飾しておき、ストレプトアビジンをコートしたセラミックス微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識にすることができる。さらに、プローブＤＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートしたセラミックス微粒子を抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。
【００５０】
さらに、検体ＤＮＡにセラミックス微粒子標識を修飾することも可能で修飾方法は、検体ＤＮＡの所要箇所を適宜標識化できればよく、公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００５１】
この発明において、ハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡ又は目的ＤＮＡに設けられたセラミックス微粒子標識を検出する方法としては、公知の蛍光や散乱光の検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。また、この発明では、前述のＳＰＲ分光法を用い、ＳＰＲ応答の増幅を図ることが可能である。
【００５２】
散乱光の検出として、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させるように条件設定することで、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができる。
【００５３】
また、セラミックス微粒子自体が有する可視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミックス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光させこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の種類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。
【００５４】
セラミックス微粒子の粒径は、特に限定しないが、散乱光強度が十分に観察可能なこと、ＤＮＡの所要部位に修飾可能とすること、当該微粒子表面に成膜可能なことなどから、１μｍ以下が好ましく、例えばシリカで公知の数ｎｍ〜数百ｎｍの粒径が好ましい。
【００５５】
この発明において、プローブＤＮＡの塩基数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡはハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解放末端側あるいは修飾可能な部位が薄膜側にある必要がある。
【００５６】
この発明において、プローブＤＮＡは、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。例えば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、ループ構造を形成し得るように構成することが可能であり、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上である。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００５７】
この発明で用いられる生化学検体の検出チップの好ましい構成は、表面に金などの貴金属薄膜を成膜したガラスなどの基板からなり、該薄膜上に配列された塩基数が６０以上のプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮＡがループ構造を形成しており、セラミックス微粒子標識で修飾可能にした部位が薄膜側にある構成である。
【００５８】
【実施例】
実施例１
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００５９】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、３０塩基、６０塩基のプローブＤＮＡの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００６０】
プローブＤＮＡと完全に相補的な６０塩基の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００６１】
プローブＤＮＡの修飾には、前述のごとくビオチンで修飾した５’端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ〜８００ｎｍの種々粒径のものを用いた。
【００６２】
ハイブリダイゼーションの検出は、検出チップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させて、検出チップ上面から観察するＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。
【００６３】
また、比較のために同様の検出チップを作製した後、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたシリカ微粒子標識の修飾処理を行った。
【００６４】
塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前後でいずれも散乱光が観測されたことから、ハイブリダイゼーションの有無にかかわらずシリカ微粒子標識の修飾が可能であり、プローブＤＮＡはループ構造を有していないと考えられる。
【００６５】
一方、塩基数６０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシリカ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼーション後では目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションが行われたプローブＤＮＡからのみ強い散乱光を観測することができた。また、いずれの粒径のシリカ粒子の場合も同様にハイブリダイゼーションの検出が可能であった。
【００６６】
実施例２
実施例１の合成による目的ＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の方法で検出チップを作製した。
【００６７】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して実際の長いＤＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、コロイダルシリカ修飾方法を行い、その後実施例１と同方法で散乱光強度の検出を実施した。
【００６８】
実施例１と同様にプローブＤＮＡが３０塩基のものはハイブリダイゼーション前後ともに散乱光が観測された。それに対してプローブＤＮＡが６０塩基の実施例チップにおいては、プローブＤＮＡのうち目的ＤＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが可能であり、ハイブリダイゼーションにてループ構造が解消されて２本鎖を形成し、コロイダルシリカ修飾されたものだけが散乱光を発することができたことを確認した。
【００６９】
【発明の効果】
この発明は、セラミックス微粒子標識を用いてハイブリダイゼーションを検出する方法であり、プローブＤＮＡの解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取る構成を採用することで、目的検体がある場合にはハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡにのみセラミックス微粒子の標識が可能になり、この２本鎖を形成したプローブＤＮＡのセラミックス微粒子が散乱光を発することになり、バックグランドノイズが少なく、検出精度を高精度化できる利点がある。また、工程全体の簡素化を図ることが可能である。
【００７０】
さらに、この発明で用いられる検出チップにおいて、ループ構造を取っているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡが結合するには強い結合力を必要とするため、プローブＤＮＡと検体ＤＮＡとの非特異的結合が少なくなり、よって目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、この場合もバックグランドノイズを低減できる利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハイブリダイゼーションによるループ構造の解消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示す。
【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのループ構造の概念を示す説明図である。

Claims

基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方にセラミックス微粒子標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方のセラミックス微粒子標識を検出する工程を有する生化学検体の検出方法。
セラミックス微粒子がＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯのいずれかである請求項１に記載の生化学検体の検出方法。
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１に記載の生化学検体の検出方法。
基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１に記載の生化学検体の検出方法。
セラミックス微粒子を検出する方法が、光散乱法である請求項１に記載の生化学検体の検出方法。
セラミックス微粒子を検出する方法が、カメラ又は顕微鏡画像をスキャニングして画像処理するイメージング処理法である請求項１に記載の生化学検体の検出方法。