JP2003329677A - 生化学検体の検出方法と検出チップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な検出標識を用いて、検出工程を再現性
よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することが
なく、検出精度の向上が可能でかつ簡単な工程からなる
生化学検体の検出方法と検出チップの提供。 【解決手段】 表面に金薄膜を成膜したガラス基板の該
薄膜上にプローブＤＮＡを配列させるに際し、各プロー
ブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が薄膜側にあ
るように構成することで、目的遺伝子がある場合には、
ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消さ
れることにより、このハイブリダイゼーションしたＤＮ
Ａプローブにのみ選択的にセラミックス微粒子の修飾が
可能になり、これに対して光散乱法を適用し、該微粒子
の散乱光強度を観察してハイブリダイゼーションの検出
が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、プローブＤＮＡ
に修飾したセラミックス微粒子標識からの光散乱強度を
検出して目的の生化学検体を検出する方法に係り、基板
に配列されたプローブＤＮＡがループ構造を形成して解
放末端側が基板側に向くように構成することで、目的Ｄ
ＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、ル
ープ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションし
た後に特定粒径のセラミックス微粒子を標識処理すると
ハイブリダイゼーションしたＤＮＡにのみ当該微粒子標
識を修飾できることから、バックグランドノイズが少な
く、検出精度を高精度化できる生化学検体の検出方法と
検出チップに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相
補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものであ
る。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）と
Ｇ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴ
ＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プロ
ーブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成
し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在する
と、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブ
ＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺
旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを
容易に選別できることになる。

【０００３】二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法とし
て、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標
識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡ
ハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈
したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出す
る、蛍光法が知られている。

【０００４】蛍光標識としては、蛍光色素そのものの
他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖
脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物
質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色
素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発す
る標識が提案されている。

【０００５】そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行
わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈
折率の変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案
されている。詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成
してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これ
とサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作さ
せることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板
裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハ
イブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋
構造のＤＮＡを有する場合の屈折率の変化を測定する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】かかる蛍光法を用いた
ＤＮＡハイブリダイゼーション検出には、蛍光標識の修
飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって
前記修飾効果が異なること、種々条件で蛍光色素の光消
失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウン
ドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指
摘されている。

【０００７】前記ＳＰＲ分光法において、前述したハイ
ブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測
定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反
射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであ
るため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、Ｓ
ＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。

【０００８】この発明は、ＳＰＲ分光法を用いた生化学
検体、すなわち二重螺旋構造のＤＮＡの検出方法におい
て、ＳＰＲ分光法の本来の利点を損なうことなくＳＰＲ
応答を増幅可能として、検出精度を高精度化すること、
さらにＳＰＲ分光法以外の光散乱法、顕微鏡観察法など
の方法でも当該生化学検体の検出工程を再現性よく簡素
化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡
単な工程からなる生化学検体の検出方法と検出チップの
提供を目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】発明者らは、前記蛍光法
を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出に問題を有
することから、光退色の懸念がある蛍光法に換えてＳＰ
Ｒ（ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃ
ｅ）分光法を用いた方法を検討しており、このＳＰＲ応
答の増幅を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有
効性を検討中に、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの
吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定
であること、金微粒子修飾量はＤＮＡ塩基数に依存する
ことを知見し、これよりプローブＤＮＡ塩基数の違いに
よってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していること
を知見した。

【００１０】そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長
の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳ
ＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮ
Ａに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳ
ＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したと
ころ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数
３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増
大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾がで
きないこと、すなわち塩基数６０のプローブＤＮＡで
は、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が
行なわれないことを知見した。

【００１１】また、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の
検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけ
るＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述の
ごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に
金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハ
イブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上で
ループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて
金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後
に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡに
も修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本
鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾するこ
とが可能であることを知見した。

【００１２】さらに、発明者らは、先の金微粒子修飾に
換えてハイブリダイゼーション後のプローブＤＮＡに蛍
光標識の修飾を行ったところ、金微粒子修飾同様にハイ
ブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮ
Ａにのみ蛍光標識を設けることが可能であり、蛍光標識
の修飾工程が著しく簡素化されるとともに、目的ＤＮＡ
にのみ蛍光を発するように構成できることから高精度な
検出が可能であることを知見した。

【００１３】そこでさらに発明者らは、蛍光標識に換え
て粒径が６００ｎｍのコロイダルシリカを用いてハイブ
リダイゼーション後のプローブＤＮＡにシリカ微粒子標
識の修飾を行ったところ、２本鎖を形成したプローブＤ
ＮＡにのみ標識を設けることが可能であり、例えばこれ
に全反射条件下でＨｅ−Ｎｅレーザーの光を当てるとシ
リカ微粒子によって光が散乱されるため、この散乱光の
検出が可能でイメージング処理も可能となり、蛍光標識
より高精度の検出が実現できること知見し、この発明を
完成した。

【００１４】すなわち、この発明は、基板表面にプロー
ブＤＮＡを配列する工程、標識修飾が可能な部位が基板
側に位置するようループ構造を形成しているプローブＤ
ＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブ
ＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方にセラミックス
微粒子標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ
ＤＮＡ又は検体ＤＮＡあるいはその両方のセラミックス
微粒子標識を検出する工程を有することを特徴とする生
化学検体の検出方法である。また、この発明は、予めセ
ラミックス微粒子修飾を行った検体ＤＮＡを用いて実施
することができる。

【００１５】また、この発明は、基板の貴金属薄膜上に
配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブＤＮ
Ａがループ構造を形成してセラミックス微粒子が修飾可
能な部位が基板側にあることを特徴とする生化学検体の
検出チップである。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下にこの発明の特徴である各プ
ローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が基板表
面側にあるように構成した検出チップ並びにループ構造
について説明する。

【００１７】まず、検出チップの作製について説明する
と、ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超
音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチ
ングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水
中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その
後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にま
ず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚み
のＡｕ層を設けた。

【００１８】前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超
純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオー
ル）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮ
Ａ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ
７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間
放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着
させて検出チップとなした。なお、プローブＤＮＡには
日清紡製を使用した。

【００１９】金コロイド修飾方法は、上記の検出チップ
をＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、
表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎ
ｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中
で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を
利用して修飾させた。

【００２０】ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶
液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮ
ＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約
１６時間放置して実施した。

【００２１】ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶
液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行
なった。

【００２２】上記方法で、１０〜６０の塩基数のプロー
ブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。こ
の時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定
により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなる
につれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、Ｓ
ＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例す
るため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効
率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな
変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化
は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩
基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認
した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成し
た。

【００２３】また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮ
Ａをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上
記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による
金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で
観察し、修飾された金コロイド粒子数を計測したとこ
ろ、塩基長１０では、約４００個／μｍ²、塩基長３０
では、約７００個／μｍ²の金コロイドの修飾が観察さ
れたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察
されなかった。

【００２４】これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ
−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾
の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上
に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、
これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での
反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾
が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強
度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反
射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイド
の修飾が行なわれないことを確認した。

【００２５】検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸
着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ
一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤ
ＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡ
の鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプ
ローブＤＮＡでは、まったく金コロイド修飾が起こらな
いことを確認した。

【００２６】前述の合成によるプローブＤＮＡに換え
て、実際のＯ−１９ ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５
６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）と
し、これと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩
基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、前述
と同様の方法で検出チップを作製した。

【００２７】上記の３種のプローブＤＮＡに対して前述
した金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮ
Ａ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、Ｓ
ＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施し
た。

【００２８】表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ
角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基
のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダ
イゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０
のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、
実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件
では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は
困難であることを確認した。

【００２９】

【表１】

【００３０】表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ
角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的
遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が
約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブ
ＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハ
イブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修
飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプ
ローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度
のシフトにバラツキがみられると推測される。

【００３１】そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾
方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施しす
る工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チッ
プに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コ
ロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイ
ブリダイゼーションの検出を実施した。

【００３２】すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡで
は、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が
行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長
い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのル
ープ構造が解消された後に金コロイド修飾を行なえば、
金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０
塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば
金コロイド修飾が可能であると考えた。図１Ａ，Ｂ参
照。

【００３３】換言すれば、目的遺伝子がない場合には、
ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾
が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合
には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が
解消されることにより、ハイブリダイゼーションしたＤ
ＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、
ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金
コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度
シフトの差が得られると考えた。

【００３４】そこで、実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子
とした検出チップを用い、前述の各工程で、プローブＤ
ＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロ
イド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並び
に空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。

【００３５】プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイ
ド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、
プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場
合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾
が行われていることが明らかになった。

【００３６】すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの
測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮ
Ａでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅
作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きか
った。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用い
て、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場
合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４
〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さか
った。

【００３７】要するに、ハイブリダイゼーション後に金
コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中とも
に、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能と
なった。すなわち、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造
（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼ
ーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド
修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ
角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さく
することが可能であることを確認した。

【００３８】

【表２】

【００３９】この発明は、以上の知見に基づきなされた
もので、前記の金コロイド修飾に換えて、散乱光の検出
が可能な所要粒径のセラミックス微粒子標識の修飾を施
すことで、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡ
のみに選択的にセラミックス微粒子標識の修飾が可能で
あり、セラミックス微粒子からの散乱光強度を、スキャ
ニング、顕微鏡画像解析装置などの公知の散乱光の検出
方法で検知あるいは画像化することで、バックグランド
ノイズを大幅に低減して定量的に目的ＤＮＡを検出した
り、あるいはイメージング処理が可能となるのである。

【００４０】また、検体ＤＮＡにセラミックス微粒子標
識の修飾を行うことも可能であり、予め検体ＤＮＡにセ
ラミックス微粒子標識を設けておき、プローブＤＮＡに
この検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションすることがで
きる。また、ハイブリダイゼーション工程の実行中又は
実行後に検体ＤＮＡにセラミックス微粒子標識を修飾す
ることができ、この際同時にプローブＤＮＡにも修飾す
ることもでき、これらによって修飾されたセラミックス
微粒子標識を検出することで目的遺伝子に検知できる。

【００４１】この発明において、基板には、ガラス基
板、樹脂基板、シリコン基板等のプローブＤＮＡの配列
が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。
また、基板に貴金属薄膜を成膜する場合は、その表面粗
度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法
としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種
デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗
浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロ
ー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を
適宜選択、組合せて採用できる。ガラス基板としては、
公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほう
が取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用でき
る。

【００４２】この発明において、プローブＤＮＡの配列
を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属
薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを
一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーテ
ィング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好まし
い。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下
地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基
板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によっ
て表面改質するなどの手段を採用できる。

【００４３】この発明において、基板上、あるいはさら
に貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、
特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用
でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮ
Ａと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させるこ
とができる。

【００４４】また、緩衝液としては、例えばＫＨ₂ＰＯ₄
とＫ₂ＨＰＯ₄を配合して所要ｐＨにした溶液が採用でき
る。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、
所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も
採用できる。

【００４５】この発明において、プローブＤＮＡは、そ
の末端を一方は基板表面あるいは基板上の貴金属薄膜に
固定し、他方端あるいはその近傍にはセラミックス微粒
子標識を修飾するために、各々の前記末端を前記基板表
面あるいはセラミックス微粒子標識と接合可能な物質で
修飾しておくことが望ましい。

【００４６】この発明において、基板表面に配列したプ
ローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションす
る工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの
方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩
衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることがで
きる。緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−
ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用でき
る。また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイ
ブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持する
ことが好ましい。

【００４７】この発明において、セラミックス微粒子標
識には、標識としての微粒子が反射する光で特定波長光
を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能する
ことができれば、いずれの形態も採用できるが、検出方
法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一で
かつ工業安定的に得られるＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、Ｚｒ
Ｏ ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好
ましい。

【００４８】この発明において、セラミックス微粒子標
識をプローブＤＮＡに修飾する方法としては、例えば微
粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾す
る方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾する
など、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性の
コロイダルシリカのごとく、微粒子を均一分散させた溶
液の形態を利用することで修飾が容易になる。

【００４９】また、プローブＤＮＡの末端にビオチンを
修飾しておき、ストレプトアビジンをコートしたセラミ
ックス微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利
用して標識にすることができる。さらに、プローブＤＮ
Ａの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加すること
で、タンパクをコートしたセラミックス微粒子を抗原−
抗体反応を利用して修飾させることが可能である。

【００５０】さらに、検体ＤＮＡにセラミックス微粒子
標識を修飾することも可能で修飾方法は、検体ＤＮＡの
所要箇所を適宜標識化できればよく、公知のいずれの方
法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法など
いずれの方法も採用できる。

【００５１】この発明において、ハイブリダイゼーショ
ン後のプローブＤＮＡ又は目的ＤＮＡに設けられたセラ
ミックス微粒子標識を検出する方法としては、公知の蛍
光や散乱光の検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメ
ラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微
鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置
を併用した検出方法が提案されているが、これらをその
まま利用することが可能である。また、この発明では、
前述のＳＰＲ分光法を用い、ＳＰＲ応答の増幅を図るこ
とが可能である。

【００５２】散乱光の検出として、一般的な構成例を説
明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チ
ップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光
をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの
他方側へこれを全反射させるように条件設定すること
で、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側
に散乱光を検出することができる。

【００５３】また、セラミックス微粒子自体が有する可
視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミック
ス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光
させこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の種
類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法や
装置を適宜選定するとよい。

【００５４】セラミックス微粒子の粒径は、特に限定し
ないが、散乱光強度が十分に観察可能なこと、ＤＮＡの
所要部位に修飾可能とすること、当該微粒子表面に成膜
可能なことなどから、１μｍ以下が好ましく、例えばシ
リカで公知の数ｎｍ〜数百ｎｍの粒径が好ましい。

【００５５】この発明において、プローブＤＮＡの塩基
数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、
目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標
識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡ
はハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解
放末端側あるいは修飾可能な部位が薄膜側にある必要が
ある。

【００５６】この発明において、プローブＤＮＡは、そ
の製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基
板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形
成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように
構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。例え
ば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を
形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、
ループ構造を形成し得るように構成することが可能であ
り、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有
するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上であ
る。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の
場合であってもこの発明を適用できる。

【００５７】この発明による生化学検体の検出チップの
好ましい構成は、表面に金などの貴金属薄膜を成膜した
ガラスなどの基板からなり、該薄膜上に配列された塩基
数が６０以上のプローブＤＮＡを有し、かつ各プローブ
ＤＮＡがループ構造を形成してセラミックス微粒子標識
を修飾可能にした部位が薄膜側にある構成である。

【００５８】

【実施例】実施例１ ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波
洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチング
を行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で
超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その後、ス
パッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１
ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ
層を設けた。

【００５９】前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超
純水で洗浄した後、３０塩基、６０塩基のプローブＤＮ
Ａの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオ
チンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ
₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０）を基板上に滴下し、
飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガ
ラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。
プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。

【００６０】プローブＤＮＡと完全に相補的な６０塩基
の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦ
Ｒ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で洗浄後乾燥せずに、検
体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下
し、約１６時間放置して実施した。

【００６１】プローブＤＮＡの修飾には、前述のごとく
ビオチンで修飾した５’端側とシリカ粒子とをビオチン
−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシ
リカ粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダルシリカと
なして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１０
０ｎｍ〜８００ｎｍの種々粒径のものを用いた。

【００６２】ハイブリダイゼーションの検出は、検出チ
ップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプ
リズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方
側へこれを全反射させて、検出チップ上面から観察する
ＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。

【００６３】また、比較のために同様の検出チップを作
製した後、前記ハイブリダイゼーションを実施すること
なく、アビジンをコートしたシリカ微粒子標識の修飾処
理を行った。

【００６４】塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、
目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前後でいずれも
散乱光が観測されたことから、ハイブリダイゼーション
の有無にかかわらずシリカ微粒子標識の修飾が可能であ
り、プローブＤＮＡはループ構造を有していないと考え
られる。

【００６５】一方、塩基数６０のプローブＤＮＡにおい
ては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシ
リカ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイ
ゼーション後では目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーショ
ンが行われたプローブＤＮＡからのみ強い散乱光を観測
することができた。また、いずれの粒径のシリカ粒子の
場合も同様にハイブリダイゼーションの検出が可能であ
った。

【００６６】実施例２ 実施例１の合成による目的ＤＮＡに換えて、実際のＯ−
１９ ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長
い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相
補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０
塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の
方法で検出チップを作製した。

【００６７】上記の３種のプローブＤＮＡに対して実際
の長いＤＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイ
ゼーションを実施した後、コロイダルシリカ修飾方法を
行い、その後実施例１と同方法で散乱光強度の検出を実
施した。

【００６８】実施例１と同様にプローブＤＮＡが３０塩
基のものはハイブリダイゼーション前後ともに散乱光が
観測された。それに対してプローブＤＮＡが６０塩基の
実施例チップにおいては、プローブＤＮＡのうち目的Ｄ
ＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが可能であ
り、ハイブリダイゼーションにてループ構造が解消され
て２本鎖を形成し、コロイダルシリカ修飾されたものだ
けが散乱光を発することができたことを確認した。

【００６９】

【発明の効果】この発明は、セラミックス微粒子標識を
用いてハイブリダイゼーションを検出する方法であり、
プローブＤＮＡの解放末端側が基板側に向くようにルー
プ構造を取る構成を採用することで、目的検体がある場
合にはハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が
解消されるため、ハイブリダイゼーションしたプローブ
ＤＮＡにのみセラミックス微粒子の標識が可能になり、
この２本鎖を形成したプローブＤＮＡのセラミックス微
粒子が散乱光を発することになり、バックグランドノイ
ズが少なく、検出精度を高精度化できる利点がある。ま
た、工程全体の簡素化を図ることが可能である。

【００７０】さらに、この発明による検出チップにおい
て、ループ構造を取っているプローブＤＮＡに検体ＤＮ
Ａが結合するには強い結合力を必要とするため、プロー
ブＤＮＡと検体ＤＮＡとの非特異的結合が少なくなり、
よって目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーシ
ョンが起こり、この場合もバックグランドノイズを低減
できる利点がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】ハイブリダイゼーションによるループ構造の解
消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目
的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示
す。

【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのル
ープ構造の概念を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 薮林 忠顕 兵庫県尼崎市扶桑町１番10号 住友精密工 業株式会社内 (72)発明者 三澤 弘明 徳島県徳島市大谷町大開40−39 (72)発明者 田中 正純 兵庫県尼崎市扶桑町１番10号 住友精密工 業株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 FA14 FA16 FA19 FB02 FB07 GC11 JA01 4B024 AA19 AA20 CA09 HA19 4B029 AA07 FA12 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR55 QS34 QX02

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 基板表面にプローブＤＮＡを配列する工
   程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体Ｄ
   ＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイ
   ゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡ又は検
   体ＤＮＡあるいは両方にセラミックス微粒子標識を修飾
   する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は検体Ｄ
   ＮＡあるいは両方のセラミックス微粒子標識を検出する
   工程を有する生化学検体の検出方法。
2. 【請求項２】 検体ＤＮＡにセラミックス微粒子標識を
   修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工
   程、ループ構造を形成している基板表面のプローブＤＮ
   Ａに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２
   本鎖を形成した検体ＤＮＡのセラミックス微粒子標識を
   検出する工程を有する生化学検体の検出方法。
3. 【請求項３】 セラミックス微粒子がＳｉＯ₂、Ｔｉ
   Ｏ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ２Ｏ₃、ＭｇＯのいずれかである請
   求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
4. 【請求項４】 プローブＤＮＡの塩基数が６０以上であ
   る請求項１又は請求項２に記載の生化学検体の検出方
   法。
5. 【請求項５】 基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１
   又は請求項２に記載の生化学検体の検出方法。
6. 【請求項６】 セラミックス微粒子を検出する方法が、
   光散乱法である請求項１又は請求項２に記載の生化学検
   体の検出方法。
7. 【請求項７】 セラミックス微粒子を検出する方法が、
   カメラ又は顕微鏡画像をスキャニングして画像処理する
   イメージング処理法である請求項１又は請求項２に記載
   の生化学検体の検出方法。
8. 【請求項８】 基板に貴金属薄膜を成膜した基板からな
   り、薄膜上に配列されたプローブＤＮＡを有し、かつ各
   プローブＤＮＡがループ構造を形成してセラミックス微
   粒子が修飾可能な部位が基板側にある生化学検体の検出
   チップ。
9. 【請求項９】 プローブＤＮＡの塩基数が６０以上であ
   る請求項８に記載の生化学検体の検出チップ。
10. 【請求項１０】 基板がガラスまたは半導体シリコンか
    らなり、表面に金薄膜を有する請求項８に記載の生化学
    検体の検出チップ。