KR20030040520A - 생물학적 물질의 식별을 위한 바이오칩, 광 발광성 방법,및 상기와 같은 방법과 바이오칩에 사용하기 위한 장치 - Google Patents

생물학적 물질의 식별을 위한 바이오칩, 광 발광성 방법,및 상기와 같은 방법과 바이오칩에 사용하기 위한 장치 Download PDF

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새래프래비에프
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버지니아 테크 인터렉추얼 프라퍼티스, 인크.
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Abstract

본 발명의 방법은, 유리하게는 샘플 중의 분자를 표지하지 않고, 분자들의 결합을 탐지한다. 각 층에 단일 가닥 핵산 서열 및 광 발광성 물질을 포함하는 센서를 사용한다. 상기 센서를 그의 단일 가닥 핵산 서열이 관심의 물질에 결합하기에 충분한 시간 동안 생물학적 샘플에 노출시킨 후에, 상기 센서로부터의 광 발광을 측정할 수 있다. 분자들의 결합을 표지화 없이 탐지하는 장치를 또한 제공한다. 표지화 없는 센서의 제조 방법을 제공한다. 또한, 항원들의 결합을 표지화 없이 탐지하는 방법 및 관련 장치를 개시한다.

Description

생물학적 물질의 식별을 위한 바이오칩, 광 발광성 방법, 및 상기와 같은 방법과 바이오칩에 사용하기 위한 장치{BIO-CHIP, PHOTOLUMINESCENT METHODS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL MATERIAL, AND APPARATUSES FOR USE WITH SUCH METHODS AND BIO-CHIPS}
데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 단백질 핵산(PNA)과 같은 핵산은 살아있는 유기체 물질의 기본적인 성분들이다. 핵산은 일반적으로 말하자면 특정한 구성성분 부분들, 또는 염기 쌍들로 이루어진다. 이들 염기 쌍들이 배열될 수 있는 순열은 방대하다. 핵산 서열 분석은 핵산 샘플의 염기 쌍들의 정체와 서열을 측정하는 중요한 기술이다. 핵산 서열의 해독은 질병 진단, 약물 디자인 및 다양한 생물학적 기전의 이해에 중요하다. 1996년 이전의 전통적인 방법은 수고스럽게 한번에 하나의 염기 쌍에 대한 유전자 서열화를 "판독"한다.
1996년 즈음에, 아피메트릭스(Affymetrix)는 다수개의 염기 쌍들을 동시에판독할 수 있는 DNA 칩을 사용하여, 서열화를 대량으로 병행하여 수행할 수 있는 접근방법을 개발하였다. 단일 층의 특정한 단일 가닥 DNA(ssDNA) 단편을 화소들의 배열(∼1 내지 100 ㎛2) 상에 모아 정리한다. ssDNA의 유형을 화소마다 변화시킬 수 있다. 이러한 ssDNA 단편들은 "화학적 족집게"로 작용하여 샘플로부터 특정의 상보적으로 붙어 다니는 ssDNA를 집어내어 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 형성한다, 즉 하이브리드화 과정이 일어난다. 상기 하이브리드화된 부분은 ssDNA 탐침 단편에 노출되기 전에 샘플 중의 DNA에 적용된 형광 표지에 의해 관찰된다. 상기 과정은 단일 염기 쌍 방법보다 더 신속하고, 특이적이며, 다수개의 뉴클레오티드 서열들을 분석할 수 있고, 동시에 수백 개의 유전자 서열 및 이들의 변경을 처리할 수 있으며, 유리하게는 작은 칩들을 사용한다. 상기 병행 서열화 기술의 실제적인 적용으로는 암(특히 유방 암)의 원인인 p53 유전자 기능 부전(즉 돌연변이)에 대한 아피메트릭스의 연구; 세포가 급속히 증식함에 따른 DNA 서열화의 변화(종양 형성을 이해하기 위해서)에 대한 머크(Merck)의 연구; 약물 디자인을 위한 인사이트 파마슈티칼(Incyte Pharmaceutical)의 질병 특이적인 칩이 있다. 또한, 대량의 병행된, 신속하고, 예민하며 정확한 바이오칩 방법은 인간 게놈 프로젝트를 부양시킬 수 있다.
그러나, 아피메트릭스의 접근법은 미지의 서열화하려는 DNA에 형광 염료를 붙여 샘플을 변경시키며, 따라서 이를 다른 시험에는 재 사용할 수 없다. 또한, 아피메트릭스 칩은 각 화소에서 5% 이상의 오차 한계를 가지므로, 상기 칩은 상기오차 한계를 처리해야 할 다수의 반복된 화소들을 포함한다. 석판인쇄 기법을 요하는 아피메트릭스 칩의 제작 방법은 비용이 많이 든다.
DNA 서열화 및 다른 단백질 식별 기법, 특히 신속한 병행 접근법은 중요한 실용적 용도, 예를 들어 질병 진단, 약물 디자인, 유전학적 및 암 스크리닝, 유전자 코드의 해독 및 기능 연구(예를 들어, 돌연변이, 유전자 발현), 다양한 생물학적 기전의 이해, 범죄 탐지 등의 용도를 갖는다. DNA 서열화 및 다른 단백질 서열화 기술의 진보가 최근 수년 동안 이루어졌지만, 이러한 과정들은 여전히 제한적이며 서열화 결과를 기다리게 당해 분야의 연구가들을 지체시킨다. DNA 서열화 및 다른 단백질 서열화에 의존하는 연구가들을 진척된 서열화의 신속성, 단순화된 서열화 및/또는 향상된 정확성과 정밀성으로 도울 수 있다. 또한, 예를 들어 환자가 결국 암으로 진행될 수 있을지 혹은 신체가 얼마나 빨리 특정한 항암 약물을 압도할 것 같은 지를 검사하기 위해 진료실에서 사용할 수 있는 작은 휴대용 장치가 관심에 따라 일반적으로 이론화되었다. 모든 이러한 용도에 대해서, 작은 크기의 다수의 특정한 유전자 샘플(저 농도에서)에 대한 핵산 분석을 수행할 수 있는 도구가 매우 바람직하지만, 통상 제공되지 않고 있다. 오히려, 상기 통상적인 바이오칩 방법은 바람직하지 못하게 샘플의 표지화에다 다른 단점들(예를 들어 값비싼 제조 방법, 화소 당 단편 수의 불확실성 등)을 요구한다.
발명의 요약
따라서 본 발명의 목적은 샘플을 표지할 필요 없이 핵산 분자의 하이브리드화 상태를 탐지하기 위한 방법 및 제품을 제공하는 것이다. 본 발명을 사용하여 미지의 핵산, 예를 들어 DNA 서열에 대한 서열 분석을 수행할 수 있다. 여러 유전자들을 동시에 탐침 검사할 수 있다. 본 발명에 따른 서열화는 비교적 간단하고 신속하며, 동시에 정확하고 정밀한 서열화 정보를 제공한다. 본 발명은 용액 중의 하나 이상의 특정한 핵산 단편들(예를 들어 유전자)을 동시에 분석하기 위한 바이오칩 및 다른 제품들을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적들을 수행하기 위해서, 본 발명은 바람직한 실시태양에서 (A) 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 제 1 층 및 광 발광성(photoluminescent) 물질을 포함하는 제 2 층으로 이루어진 센서를 제공하는 단계; (B) 상기 센서를 상기 단일 가닥 핵산 서열이 생물학적 샘플 중의 관심의 물질에 결합하기에 충분한 시간 동안 상기 생물학적 샘플에 노출시키는 단계; (C) 상기 센서를 빛에 노출시키고 상기 센서로부터의 광 발광을 측정하는 단계를 포함하는, 분자들의 결합을 표지화 없이(tagging-free) 탐지하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 신규의 표지화 없는 방법에서, 상기 측정 단계는 200 내지 700 ㎚ 범위 파장의 자외선 광을 제 1 층에 적용하는 경우 제 2 층으로부터의 광 발광성 빛을 감지함을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 적용된 자외선 광의 파장은 260 내지 265 ㎚의 범위이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 제 1 층을 상기 제 2 층의 제 1 면에 배치시키며, 상기 측정 단계는 상기 제 2 층의 제 2 면으로부터의 광 발광을 측정한다. 추가의 실시태양에서, 상기 제 2 면은 상기 제 2 층의 상기 제 1 면에 대향된다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 제 1층을 상기 제 2 층의 제 1 면 위에 배치시키고, 상기 측정 단계는 상기 제 2 층의 상기 제 1 면으로부터 반사된 광 발광을 측정한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층을 포함하는 표지화 없는 센서를 제공한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 광원; 핵산 층 및 광 발광성 층을 갖는 센서; 및 광 발광 탐지기를 포함하는, 분자들의 결합을 표지화 없이 탐지하는 장치를 제공한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 광원은 자외선 광원, 적외선 광원 또는 가시광선 광원이다. 또 다른 특히 바람직한 실시태양에서, 탐지기는 적외선 내지 자외선 범위의 광 탐지기이다. 자외선 광원을 사용하는 경우, 특히 바람직한 실시태양에서 상기 자외선 광원은 약 260 내지 265 ㎚ 범위의 자외선 광을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 단일 가닥 핵산 서열을 광 발광성 물질과 접촉시킴을 포함하는, 표지화 없는 센서의 제조 방법을 제공한다. 상기와 같은 신규 방법의 특히 바람직한 실시태양은 광 발광성 물질을 기재 상에 침착시켜 표면을 형성시키고, 그 후에 상기 표면을 금속 염으로 이온 교환 처리하여 개질시킨 다음, 이온-매몰시키고, 이어서 상기 이온-매몰된 물질을 반응성 매질에 노출시켜 광 발광성 입자들을 형성시킴을 포함한다.
상기 언급한 방법, 제품 및 장치에서, 본 발명의 특히 바람직한 실시태양은 단일 가닥 핵산으로서 DNA, RNA 및/또는 PNA를 사용한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 제 1 층은 ssDNA 단일 층을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 센서는 상기 제 1 층으로서 제 2 층에 그래프트된 ssDNA를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 핵산 서열은 5 내지 200 염기 쌍이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 서열은 약 25 염기 쌍이다. 또 다른 특히 바람직한 실시태양은 제 1 층의 상이한 부분들에 상이한 핵산 서열들을 포함하는 불연속적인 제 1 층을 제공한다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 (A) 항체를 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층으로 이루어진 센서를 제공하는 단계; (B) 상기 센서를 상기 항체가 생물학적 샘플 중의 관심의 항원에 결합하기에 충분한 시간 동안 상기 생물학적 샘플에 노출시키는 단계; (C) 상기 센서로부터의 광 발광을 측정하는 단계를 포함하는, 항원들의 결합을 표지화 없이 탐지하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 제 1 층은 불연속적이고 상이한 항체들을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 광원; 항체를 포함하는 제 1 층 및 제 2 광 발광성 층을 갖는 센서; 및 광 탐지기를 포함하는, 항체 결합을 표지화 없이 탐지하는 장치를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 항체를 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층을 포함하는 표지화 없는 센서를 제공한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 제 1 층은 불연속성이고 상이한 항체들을 포함한다. 또 다른 특히 바람직한 실시태양에서, 상이한 공지된 항체들을 포함한다.
상기 언급한 신규의 방법에 대한 추가의 상세한 실시태양들은 하기와 같다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시태양은 제 2 층에 방향족 중합체, 도핑되거나 도핑되지 않은 금속 산화물, 설파이드, 셀레나이드, 아르세나이드, 텔루라이드 및/또는 니트라이드 및 포스파이드 나노복합체를 사용한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 매트릭스 물질을 포함하며, 이때 광 발광성 물질이 상기 물질과 회합되어 있다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 광 발광성 물질은 상기 매트릭스 물질에 매몰되어 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 폴리스티렌이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 중합체 매트릭스 중에 광 발광성 입자를 포함한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 광 발광성 입자는 II 족 및 VI 족으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 도핑되거나 도핑되지 않은 화합물일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 화합물로서 도핑되거나 도핑되지 않은 황화 아연을 사용한다. 또 다른 특히 바람직한 실시태양은 상기 제 2 층이 나노복합체를 포함하는 것이다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 박막 또는 지지체를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 중합체를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 층은 200 내지 700 ㎚ 범위의 파장을 갖는 빛에 의해 여기될 때 형광성을 갖는다.
본 발명은 일반적으로 핵산, 보다 특히 단일 가닥 핵산을 샘플 중에 관심 있는 생물학적 물질과 결합시켜 상기 물질을 식별하는 것에 관한 것이다.
상기 및 다른 목적들, 태양들 및 이점들은 도면을 참고로 본 발명의 바람직한 실시태양에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이며, 도면에서:
도 1은 본 발명에 따른 방법을 나타내는 순서도이다.
도 2(a)는 본 발명에 따른 장치의 단면도이다. 도 2(b) 및 2(c)는 도 2(a)의 일부에 대한 확대도이고, 이때 도 2(b)는 본 발명에 따른 결합되지 않은 단일 가닥 핵산 물질을 나타내며, 도 2(c)는 본 발명에 따른 결합된 핵산 물질을 나타낸다.
도 3(a), (b) 및 (c)는 함께 본 발명에 따른 탐침 검사를 나타내는 일련의 단면도이다.
도 4(a), (b), (c) 및 (d)는 본 발명에 따른 동일 반응 계 나노복합체 형성에 따른 장치 제작을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 나노 복합체 구조의 원자력 현미경사진을 나타낸다.
도 6(a) 및 (b)는 본 발명에 따른 선택적으로 개질된 폴리스티렌 표면의 광학 현미경사진을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 광 발광성 중합체 함유 실시태양에 사용되는 폴리스티렌의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 전형적인 규소 표면 상의 폴리스티렌/폴리부타디엔 블록 공중합체 구의 단일층을 나타낸다.
도 9는 노출 시간의 함수로서, 본 발명에 따른 전형적인 블록 공중합체에 대한 폴리부타디엔의 식각 양상을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 전형적인 물질에 대한, 물의 접촉 각에 대한 표면 처리의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 블록 공중합체 기재의 전형적인 물질에 대한 ZnS 나노입자의 전계 방출 현미경사진이다.
도 12는 본 발명에 따른 ZnS 함유 물질의 광 발광 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 본 발명에 따른 바이오칩의 상면도를 나타낸다.
도 14(a), (b) 및 (c)는 본 발명의 중합체 방울/나노입자 실시태양의 제작을 나타내는 일련의 단면도들이다.
도 15(a) 내지 (g)는 본 발명에 따른 나노입자 배열을 제조하기 위한 전형적인 공정 흐름도를 나타낸다.
도 16(a)는 사용 전의 본 발명에 따른 나노입자/중합체 방울 바이오 칩의 전형적인 구조를 나타낸다. 도 16(b)는 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열과 하이브리드화되어 이중 가닥 핵산을 형성한 후의 도 16(a)의 구조를 나타낸다.
도 17(a) 내지 (c)는 도 16(a) 내지 (b)의 장치에 대한 본 발명에 따른 판독 방법을 나타내며, 이때 UV 광이 샘플 상에 비스듬히 입사하고 나노입자로부터의 발광성 가시 방사선이 기록된다.
도 1을 예로서 나타내는 첫 번째 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 표지화(예를 들어 형광 염료 표지화) 없이 핵산(예를 들어 DNA, RNA 또는 PNA) 또는 단백질 서열 분석을 수행하고 상기와 같은 표지화 없는 서열화에 사용할 수 있는 제품 및 장치를 제공한다. 단일 가닥 핵산 서열에 대한 분자의 결합을 통상적인 표지화 없이 탐지할 수 있다. 본 발명은 광 발광성인 물질을 사용하며, 상기는 임의의 파장에서 빛을 내거나 광자로 인해 발광하는 물질을 두루 포함한다. 본 발명은 빛의 적용을 이용하며, 투입되는 빛은 비 제한적으로 자외선, 가시광선, 적외선 또는 다른 빛일 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 표지화 없는 방법의 전형적인 실시태양에서, 서열을 알고 있는 단일 가닥 핵산 물질이 제공된다. 상기 단일 가닥 핵산 물질의 예로는 DNA, RNA 및 PNA가 있다. 상기 단일 가닥 핵산 서열은 임의의 길이, 바람직한 예로는 약 25 bp를 가질 수 있지만; 상기 단일 가닥 핵산은 5 내지 200 bp의 범위일 수 있다.
본 발명에 따른 전형적인 탐지 시스템인 도 1을 참고로 나타내는 바와 같이, 측정 또는 관찰(100)을 임의로 공지된 단일 가닥 핵산 단독으로 수행할 수 있다. 수치적 측정이 반드시 필요하지는 않으며, 눈금화 측정 또는 관찰과 비슷한 기준선 측정이 본 발명 내에 있다. 본 발명은 차별적인(절대적이라기 보다는) 측정 또는 관찰을 근거로 한다. 일부 실시태양들에서, 측정 또는 관찰(100)을 배제시킬 수도 있다.
측정/관찰(100) 후에, 상기 공지된 단일 가닥 핵산 서열을 생물학적 샘플, 예를 들어 상기 서열에 상보적인 물질을 함유하고 있는 지를 알고 싶은 생물학적 물질을 함유하는 샘플에 노출시킨다. 예를 들어, 상기 샘플은 정체를 알 수 없는변성된 DNA, RNA 또는 PNA를 포함할 수 있다.
상기 샘플을 단일 가닥 핵산과 접촉시키기 위해서, 공지된 방법, 예를 들어 상기 단일 가닥 핵산을 바이오칩 상에 제공하고 소량의 샘플 용액을 상기 바이오칩 중의 웰에 피펫팅하는 방법을 이용할 수 있다. 상기 생물학적 샘플을 상기 공지된 단일 가닥 핵산 물질과 접촉시키는 조건은 상기 공지된 단일 가닥 핵산 물질이 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 단백질 또는 뉴클레오티드와 결합하여 복합체를 형성할 수 있게 하는 조건, 예를 들어 하이브리드화 조건이다. 하이브리드화 조건은 당해 분야의 연구가들에게 공지되어 있다. 상기 공지된 단일 가닥 핵산 서열을 생물학적 샘플에 상기와 같이 노출시키는 경우, 상보적인 물질이 상기 생물학적 샘플 중에 함유되어 있다면 결합, 하이브리드화 및 복합체의 형성이 일어난다. 온도, 염, 농도 등을 변화시킴으로써 하이브리드화 조건을 최적화하는 소프트웨어가 공지되어 있다.
상기 노출 과정 후에, 광 발광의 변화(존재한다면)를 관찰 또는 측정하기 위해서 관찰 또는 측정(200)을 수행한다. 예를 들어, 단일 가닥 핵산을 바이오칩 상에 제공하는 경우, 상기 바이오칩에 상기 단일 가닥 핵산과 이중 가닥 핵산을 차별적으로 흡수하는 파장의 빛을 조사할 수 있다. 상기 노출 과정에서 무엇이 발생했느냐에 따라, 변화 없음(210)이 측정/관찰되거나, 또는 변화(220)가 측정/관찰될 수 있다. 변화 없음(210)이 발견되는 경우, 상기 샘플은 공지된 단일 가닥 핵산 서열에 결합하기에 충분히 상보적인 물질이 없는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
변화(220)가 발견되는 경우, 샘플 중의 충분히 상보적인 물질이 공지된 단일가닥 핵산 서열에 결합된 것으로 결론지을 수 있다. 상기 공지된 단일 가닥 핵산 서열의 정체로부터, 상기 상보적으로 결합된 물질의 있음직한 정체를 추정할 수 있다. 변화(22)의 크기는 단일 가닥 DNA와 생물학적 물질 사이의 상보성 정도에 따라 변할 것이다. 변화(220)는 단일 가닥 DNA 밑에 있는 지지체로부터 측정할 수 있는 광 발광성의 변화의 함수 있다. 샘플로부터 점점 더 많은 생물학적 물질이 단일 가닥 DNA에 결합됨에 따라, 그의 단일 가닥 상태와 결합된 상태 사이의 핵산의 물리적 특징의 변화로 인해 점점 더 큰 탐지 가능한 발광의 차이가 생성될 것이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 공지된 단일 가닥 핵산 서열을 기재, 탐침, 바이오칩 또는 다른 고형 제품 상에 제공하며, 생물학적 샘플을 상기 고형 제품과 액체의 형태로 접촉시킨다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 미지의 또는 서열화시키려는 생물학적 물질을 기재, 탐침, 바이오칩 또는 다른 고형 제품 상에 제공하고, 각각의 센서 입자가 광 발광성 물질에 부착된 공지된 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는, 상기 입자들을 포함하는 액체 탐침과 접촉시킬 수 있다.
본 발명의 방법 및 제품을 사용하여 핵산 분자(예를 들어 DNA, RNA 또는 PNA) 또는 다른 단백질을 서열화시킬 수 있다. 예를 들어, 정체 및 서열을 모르는 하나 이상의 특정한 DNA 단편(즉 유전자)을 분석할 수 있다. 시험하고자 하는 생물학적 샘플의 소스 물질은 특별히 제한되지 않으며, 임의의 핵산 또는 단백질 함유 생물학적 물질(예를 들어 혈액, 조직, 손톱 클리핑 등)일 수 있다. 생물학적 원료 물질, 예를 들어 혈액을 일반적으로는 분석할 수 있는 단편들로 가공하고당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 용액에 넣을 수 있다.
본 발명에 사용되는 단일 가닥 핵산 서열은 사용되는 형태가 특별히 제한되지 않으며, 단일 층과 같은 형태를 사용할 수 있다. 단일 층이 특히 바람직하다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 단일 가닥 핵산을 광 발광성 물질에 부착시킨다. 상기 부착의 바람직한 예는 그래프트팅에 의한 것이다. "그래프팅"은 상기 단일 가닥 핵산의 일부를 상기 광 발광성 물질에 공유 결합(예를 들어 리신 또는 히스티딘으로부터의 아민 결합에 의해)시킴을 포함하거나, 또는 상기 광 발광성 물질에 대한 물리적 흡착, 또는 상기 단일 가닥 핵산과 광 발광성 물질을 상기 핵산의 일부가 관심의 다른 생물학적 물질에 결합되지 않고 남는 방식으로 회합시키는 다른 결합 기전을 포함할 수도 있다. 상기 광 발광성 물질의 예로는 비 제한적으로 광학 활성 박막, 방향족 중합체, 금속 산화물 또는 황화물, 예를 들어 Mn으로 도핑된 ZnS를 포함하는 매트릭스 물질 등이 있다.
비 제한적인 예로서, 단일 가닥 핵산 단일 층을 광학 활성 박막에 그래프팅시키는 실시태양에서, 상기 단일 가닥 핵산 단일 층을 빛에 노출시키는 경우, 상기 부착된 광학 활성 박막으로부터 방출되는 빛의 양은 상기 단일 가닥 핵산 층에 의한 흡수에 따라 변한다. 상기 단일 가닥 핵산 층이 상보적인 분자와 접촉하게되는 경우, 상기 단일 가닥 핵산 층은 상기 상보적인 분자에 결합된다. 특히 ssDNA는 dsDNA로 전환된다. 상기 단일 가닥 핵산의 결합으로 상기 부착된 광 발광성 물질로부터의 형광 방출 강도가 변하게 된다. ssDNA를 단일 가닥 핵산 서열로서 사용하는 경우, ssDNA 대 dsDNA의 관찰 가능한 형광 강도는 (ssDNA의 흡수가 dsDNA보다 더 크기 때문에) 260 ㎚의 범위에서 상이하다. 형광 강도는 결합된 형태(예를 들어 전환된 dsDNA 형태)가 보다 크며, 이러한 형광 강도는 시험하려는 샘플 중의 상보적인 서열의 존재를 확인하기 위해 관찰될 수 있다.
본 발명의 바람직한 물질, 예를 들어 ssDNA에 부착된 광 발광성 층으로서 폴리스티렌의 경우, ssDNA가 dsDNA로 전환되면 상기 광 발광의 강도 변화는 단지 약 2 내지 4%로 상이하며, 따라서 상기 강도를 연구하는 것이 특별히 극적이지 않을 것이다. 그러나, 본 발명자들은 260 내지 265 ㎚에서 흡수가 변할 뿐만 아니라 굴절률도 변하며, 이로 인해 반사(반사력)도 변한다는 것을 중요하게 인식하였다. 상기 DNA에 부착된 폴리스티렌에 도달하는 빛의 양은 하기의 이유들로 인해 200% 정도까지 많이 변할 수 있다.
DNA는 일반적으로 260 내지 265 ㎚ 범위(자외선)에서 흡수하며, (결합되지 않은) 단일 가닥 핵산 표면 층에 상기와 같은 방사선을 비추면 상기 방사선의 흡수, 반사 및 산란이 일어난다. 나머지 투과된 방사선은 광 발광성 물질(예를 들어 폴리스티렌)로 이동하여 상이한 파장에서 방사선을 발산하게 된다. 예를 들어, 폴리스티렌의 광 발광은 약 325 ㎚에서 일어난다. 그러나, 단일 가닥 핵산이 결합되어 이중 가닥으로 되는 경우, 상기 핵산은 이제 상이한 양의 여기 파장을 흡수, 산란 및 반사하며, 따라서 광 발광성 하부 층이 경험하는 방사선의 양은 결합이 일어나기 전의 경우와 다르다. 상응하게 상기 광 발광성 물질은 상이한 광 발광 강도를 발산한다. 굴절률이 변하며, 이로 인해 반사(반사력)가 변한다. 하부의 광 발광성 물질에 도달하는 빛의 양은 200% 이상까지 변할 수 있다. 이는주로 굴절률의 변화에 기인하며, 이로 인해 반사(반사력)가 변하여 상기 광 발광성 층으로의 여기 광과 관련하여 상당한 변화가 일어난다. 따라서, 핵산 서열에 부착된 광 발광성 물질로부터의 빛의 양에 대한 연구는 결합되지 않은 핵산 서열 대 결합된 핵산 서열에 대해 극적으로 상이한 결과를 제공한다.
본 발명의 전형적인 형태인 바이오칩 장치의 일부를 도 2(a)에 나타낸다. 도 2(a)의 장치는 나노복합체 또는 광 발광성 중합체와 같은 광 발광성 물질을 포함하는 광학 활성 층(2)을 포함하며, 하기와 같이 사용될 수 있다. 광 발광성 물질인 나노복합체가 매트릭스 물질 중에 제공될 수 있으며, 이때 상기 매트릭스 물질은 여기 파장에서 임의로 광 발광성이다. 도 2(b)는 도 2(a)의 일부에 대한 확대도로, 층(3)에 포함된 각각의 단일 가닥 핵산 서열(3a)을 나타낸다. 본 발명에 따른 장치를 사용하는 하나의 실시예에서, 도 2(c)를 참고로, 상기 장치를 단일 가닥 핵산 층(3)에 상보적인 생물학적 샘플 물질에 노출시켜 단일 가닥 핵산 서열(3a)이 상기 샘플 중의 상보적인 서열(3b)과의 결합에 의해 이중 가닥 핵산 형태(33)로 전환되고, 이로 인해 상기 광 발광성 층 내로 투입된(즉 여기된) 입사 광이 변하게 된다. 상기 광 발광성 층으로의 입사 광의 변화는 단일 가닥이 이중 가닥으로 전환함에 따라 DNA 층 중의 반사력, 흡수 및 산란이 변하기 때문에 일어난다. 따라서, 단일 가닥이 이중 가닥으로 전환하는 결합의 결과로서 방출된 광 발광성 빛의 강도가 변한다. 이러한 방출된 광 발광성 빛의 강도 변화는 예를 들어 CCD 카메라를 통한 공 초점 현미경 또는 광학 섬유에 의해 기록될 수 있다. 통합된 광학적 접근법이 사용되는 경우, 용액 중에서 하이브리드화 공정을 수행하는 동안 온 라인 측정이 수행될 수 있다. 본 발명의 온 라인 실시태양들을 사용하여 여러 유전자의 탐침 검사를 동시에 수행할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 도 2(a)에 따른 장치를 사용하는 예는 단일 가닥 핵산으로서 공지된 서열의 ssDNA를 상기 장치 상에 제공하고 이어서 상기 장치를 다양한 미지의 핵산 단편 용액 중에 침지시키는 것이다. 상기 장치 상에서 상기 용액 중에 상기 ssDNA에 상보적인 쌍이 존재하는 경우, 하이브리드화가 일어날 것이며, 상기 장치 상의 ssDNA 층은 ssDNA에서 dsDNA로 전환될 것이다. 본 발명은 상기와 같은 ssDNA에서 dsDNA로의 전환이 일어나는 지의 여부를 탐침 검사할 수 있게 하여, 특정 유전자(상기 장치 상의 공지된 ssDNA에 대해 상보적인 것)가 생물학적 샘플 용액 중에 존재하는 지를 측정한다. 상기 샘플과 접촉된 장치에 대해 광 발광을 판독한 후에, 상기 샘플로부터 임의의 결합된 물질을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여 방면시키고, 다른 시험 또는 용도에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 탐침 검사는 도 3에 일반적으로 나타낸 바와 같이 광 발광성 빛의 변화를 측정하는 것으로, 이는 도 1에 따른 본 발명의 방법 또는 도 2(a)에 따른 본 발명의 장치에 대한 흡수에 관한 것이다. 도 3을 참고로, I0는 265 ㎚ 파장(통상적으로 DNA가 최대로 흡수된다)에서 입사된 UV 광의 강도이다. 상기 UV 방사선이 광 발광성 물질 층(2)에 의해 흡수됨에 따라 광 발광성 입자들은 강도 I1, I2또는 I3(DNA 그래프트, 즉 하나 이상의 공유 결합에 의해 표면 상에 고정화된 DNA가 없는 출력 강도를 나타낸다)의 가시광선을 방출한다. ΔI=I2-I3를 측정할수 있는 경우, 임의의 하이브리드화 반응의 발생을 측정할 수 있다. ΔI의 측정은 동일 반응 계에서 용액 중에서 수행할 수 있는데, 그 이유는 상기 용액에 의한 흡수로 인해 I0의 감쇠가 일정하고 가시광선 범위에서 DNA 및 용액에 의한 흡수는 무시할만하기 때문이다.
탐침 검사를 도 2(a)에 나타낸 장치에 대해서 광학 섬유 모드로 도 3(a), (b) 및 (c)에 나타낸다. 도 3(a)에서 I1은 광학 활성 층(2)으로부터의 광 발광성 강도이며, 이 경우 상기 층은 입사된 UV 방사선 I0에 대한 나노복합체이다. 출력 강도는 ssDNA(3)의 침착 시 I2로 감소되며(도 3(b)), 이는 나노복합체인 광학 활성 층(2) 위에 입사되는 UV 방사선 강도를 더욱 감소시킨다. 상기 강도는 상기 ssDNA(3)가 하이브리드화되어 dsDNA(33)를 형성하는 경우 더욱 감소된다(도 3(c)). 도 3(c)에 따른 장치에 대해 생성된 광 발광성 강도는 I3이다. 적절한 신호는 ΔI=I2-I3이다.
도 2(a)의 장치는 최종 용도에 따라 반사를 향상시키기 위한 반사 층, 예를 들어 금 층(4)을 임의로 함유한다. 임의의 반사 층은 바람직하게는 비 산화성 물질(금이 바람직한 예이다)로 구성된다. 예를 들어, 도 2(a)에 나타낸 바와 같이, 반사 모드에서, 금 반사 층(4)은 상기 장치 표면 위의 광 발광성 물질에 의해 생성된 가시 광을 편향시킨다. 투과 모드에서(주로 장치 특성화의 경우), 도 2(a)의 금 층(4)은 생략될 수 있으며 가시적인 광 발광성 빛은 상기 샘플의 다른 면 위에서 탐지될 수 있다. 광학 섬유 모드의 경우에 금 층(4)은 필요하지 않다.
본 발명에 따른 서열화를 시험하려는 DNA에 어떠한 표지도 없이 수행할 수 있다. 이러한 비 표지화 특징은 자극 시 DNA 구조의 "전"과 "후"를 탐침 조사할 수 있게 한다. 예를 들어, UV 방사선으로 인한 유전자의 돌연변이를 개시된 DNA 칩으로 분석할 수 있다. 본 발명에 따른 탐침은 돌연변이 과정의 동력학, 돌연변이의 위치를 탐침 조사할 수 있으며, 중요하게는(약물의 존재 하에서) 몇몇 돌연변이 과정의 억제 또는 촉진에 대한 약물 작용에 대한 역할을 평가할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 온 라인 통합된 광학을 본 발명에 따른 DNA 서열화에 이용할 수 있다. 상기와 같은 구성에서, 상기 장치를 용액에 침지시켜 특정한 유전사 서열의 정체와 그의 하이브리드화 동력학 모두를 측정할 수 있다.
본 발명을 또한 추가의 실시태양에서 물리적 또는 화학적 처리 "전"과 "후"의 DNA의 탐침 조사에 이용할 수 있으며, 이는 약물 디자인 용도로 특히 유용할 수 있다.
DNA 유전자 서열화 용도 및 상기 언급한 다른 용도들 이외에, 본 발명의 광 발광성 실시태양의 다른 용도들로는 표지화 방법을 사용하는 장치로는 가능하지 않은 용도들이 있다. 또한, 본 발명에 따른 탐침은 큰 영역의 장치일 수 있기 때문에, 상기를 단일 가닥 핵산 단편들의 혼합믈로부터 공지된 서열을 매우 정확하게 고 감도로 분리시키는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 센서는 온라인으로 제조될 수 있기 때문에, 상기 본 발명에 따른 센서는 PCR용 온라인 센서로서의 용도를 갖는다.
본 발명의 실시에 사용하기 위한 공지된 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 장치를 예를 들어 도 4(a) 내지 (d)에 나타낸 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 장치의 예는 탐침, 바이오칩, 및 표지화 없는 서열화에 사용할 수 있는 기타의 제품들이다.
본 발명에 사용하기 위해서, 공지된 단일 가닥 핵산 서열의 길이, 바람직하게는 약 5 내지 약 200 bp 길이의 서열 및 가장 바람직하게는 약 25 pb 길이의 서열을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 전형적인 장치를 제조하기 위해서, 단일 가닥 핵산 서열(바람직하게는 공지된 서열)을 광 발광성 물질에 부착시킬 수 있다. 핵산에 대한 부착 기법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 여기에는 비 제한적으로 그래프트화, 고정화, 이온 결합 부착, 공유 부착, 흡착, 반 데르 발스 부착 등이 있다. 바람직한 부착 기전은 핵산 서열을 광 발광성 물질에 공유 부착시키는 것이다. 상기 부착은 핵산을 광 발광성 물질에 직접 부착시키거나 또는 핵산을 예를 들어 링커 혹은 부착 촉진제를 삽입시킴으로써 광 발광성 물질에 간접적으로 부착시킬 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 실시예에서 단일 가닥 핵산을 기재(1)(도 2(a)) 상에 직접 또는 간접적으로 제공하며, 이때 상기 기재는 특별히 제한되지 않는다. 반사 또는 비 반사 기재를 사용할 수 있으며, 비 반사 기재가 바람직하다. 기재(1)는 특별히 제한되지 않으며 최종 용도의 탐침 방법을 근거로 선택될 수 있다. 본 발명에서 기재의 사용이 요구되지는 않는다.
본 발명에 사용되는 광 발광성 물질은 DNA 층이 단일 가닥에서 상기 층에 부착된 이중 가닥 핵산 서열로 변하는 경우 차별적인 광학 활성이 관찰되는 것이다. 본 발명에 사용하기 위한 광 발광성 물질은 부착된 단일 가닥 핵산 서열이 결합되거나 결합되지 않은 경우 상이한 광학적 양상을 갖는 임의의 물질이다. 상기와 같은 광 발광성 물질의 예는 방향족 분자, 예를 들어 폴리스티렌 또는 다른 중합체(모든 방향족 중합체가 광 발광을 나타낼 것이다)이다. 본 발명에 따른 장치에 사용되는 광 발광성 물질은 생물학적 샘플 물질의 광 발광성 표지화의 필요성을 제거한다. 본 발명에 사용되는 광 발광성 물질(예를 들어 중합체)을, 단일 가닥 핵산과 그의 이중 가닥 핵산이 커플링될 때 상이한 광 발광이 관찰되도록 선택한다. 바람직한 광 발광성 물질은 핵산에 부착된 광 발광성 물질로부터의 형광 방출 강도를 기준으로 단일 가닥에서 이중 가닥으로 변함에 따라 DNA의 광학적 성질(즉 복합 굴절률) 변화의 측정을 허용하는 것들이다. 본 발명에 사용하기 위한 광 발광성 물질의 바람직한 예는 폴리스티렌이다. dsDNA 또는 ssDNA와 커플링된 폴리스티렌의 경우에, ssDNA의 흡수는, 형광 방출의 강도로부터 관찰될 수 있는 바와 같이 260 ㎚ 범위에서 dsDNA보다 더 높다.
상기 광 발광성 물질은 나노복합체, 나노 규모 광 발광성 입자에 서브 미크론으로 적재된 박막, 중합체 매트릭스 중에 존재하는 광 발광성 입자, 또는 임의의 다른 형태의 광 발광성 물질일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 나노복합체는 바람직하게는 광 발광성 입자를 캡슐로 싸고 있는 중합체 매트릭스를 포함한다. 상기 광 발광성 입자를 캡슐로 싸고 있는 중합체 매트릭스는 바람직하게는 목적하는 핵산 부착 이외의 핵산 흡착은 일어나지 않도록 비 습윤성이다.
그러나, 상기 표면을 단위 면적 당 분자의 밀도를 조절할 수 있는 경우 조절된 핵산 그래프트팅이 허용되도록 선택적으로 개질시킬 수 있다. 부착 밀도는 바람직하게는 인접한 쇄들의 얽힘을 피하고 용액 중에서 빠른 하이브리드화 동력학에 충분한 쇄 이동성을 허용할 정도로 충분히 작다. 바람직하게는 상기 밀도는 핵산 층이 단일 가닥에서 이중 가닥으로 변함에 따라 상기 층의 복합 굴절률의 큰 변화에 충분하게 높아야 한다. 폴리스티렌이 이러한 기준을 만족시키는 예이다.
본 발명에 따른 장치의 바람직한 제조 방법으로는 나노복합체 생성 과정, 자가정렬 생성 과정, 나노 입자 나노 배열 조립 및 중합체 방울/나노입자 제작이 있다.
나노복합체 생성 방법의 예는 하기와 같다. 도 4(a)에 나타낸 바와 같이, 나노복합체 필름을 강성 기재(예를 들어 석영 또는 유리) 상에 부착시킨다. 도 4(b)에 나타낸 평탄한 나노복합체 필름을 부착시키기 위해서, 동일 반응계의 3 단계 과정을 사용하며, 이때 적합한 금속 염과의 이온 교환에 의해 표면 개질을 수행한다. 이어서, 상기 이온들을 후속적으로 매몰시키고 이어서 반응성 매질에 노출시켜 광 발광성 입자들을 형성시킨다. 상기 입자 매몰 중에, 중합체 표면이 재생된다. 생성된 구조를 도 4(b)에 나타내며, 이때 도 5는 도 4(b) 및 본 발명에 따른 나노복합체 구조의 원자력 현미경 사진(AFM)을 나타낸다. 상기 연구된 표면은 지세(즉 콘트라스트가 높이이다) 및 감폭(즉 콘트라스트가 국소적인 경도이다) 모두의 지도가 작성되는 탭핑 모드로 1 x 1 ㎛이다. 상기 3 가지 유형의 샘플들의비교는 입자들이 형성되며, 매몰된 입자들은 이온들의 임의의 확산 없이 설폰화가 벌크로 일어나는 경우보다 더 작음을 분명히 나타낸다. 상기 콘트라스트가 감폭-지도에서 상기 매몰된 샘플이 더 약하다는 사실은 상기 입자들이 내부에서 확산되고 표면은 명목상 모두 폴리스티렌임을 가리킨다.
도 4의 실시로 돌아가서, 도 4(b)에 나타낸 재생된 표면(예를 들어 폴리스티렌 표면)을 선택적으로 개질시킨다. 상기 개질 공정은 바람직하게는 (i) 선택적이고; (ii) 표면 상의 작용기들의 밀도에 대한 조절을 허용하며; (iii) DNA의 3' 또는 5' 단부가 그래프팅될 수 있도록 하는 작용성을 제공하는 것이다. 간단한 플라스마 표면 개질 및 표준적인 습윤 표면 개질이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 상기 중 어느 한 개질 과정을 본 발명의 표면 처리로서 사용할 수 있다.
도 4(c) 및 4(d)에 대해서, DNA 그래프팅을 작용화된 영역 상에 ssDNA 용액을 단순히 분배시킴으로써 달성할 수 있다. 도 6을 참고로 나타내는 바와 같이, 상이한 ssDNA 용액들의 소적 배치는 극성 작용성 영역이 비 극성 영역으로 둘러싸이기 때문에 자가 정렬될 것이다. 도 6(a) 및 (b)는 본 발명에 따른 선택적으로 개질된 폴리스티렌 표면의 광학 현미경 사진이다. 처리 시간은 충분한 개질을 보장하도록 90 초였다. 샘플을 물에 침지시키고 과잉의 물을 공기 취입시킴으로써 소적들을 형성시켰다. 축적 척도는 1 ㎜이다.
상기 자가 정렬 성질은 장치 제조 비용을 낮추는데 중요하다. 예를 들어, 1 ㎜ 주기로 100 x 100 ㎛의 특징부가 25 x 25 ㎜ 기재 상에 제조되는 경우, 600이상의 조합이 동시에 수행될 수 있다. 상기와 같은 침착 기하는 마이크로 전자 공학 제작에 통상적인 기존의 분배 시스템에 의해 또는 미세 피펫팅에 의해 수행될 수 있다. 전자의 방법은 상기 공정이 100 초안에 600 개 정도를 신뢰도 있게 침착하도록 촉진시킬 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 도 4(d)는 2 개의 상이한 유형의 ssDNA 표지된 ssDNA-1 및 ssDNA-2의 부분을 갖는 생성된 표면을 나타낸다.
따라서 도 4는 기재 상에 침착된 매우 평탄한 폴리스티렌 필름으로 출발하는, 본 발명에 따른 동일 반응계 나노복합체의 형성을 나타낸다. 이어서 상기 필름을 3 개의 단계로 처리하여 광 발광성 입자들을 생성시키며, 이때 ZnS:Mn 입자들이 생성된다. 표면상에 폴리스티렌이 생성되도록 상기 표면을 재생시킨다. 상기 필름을, 각각 5' 또는 3' 단부에 부착되도록 표면을 산성 또는 염기성 잔기로 작용화시키기 위해 유사한 표면 개질에 노출시킨다.
도 2(a)에 도시된 바와 같이, 기재(1) 위에 임의로 금 전극(4)을 제공한다. 상기 전극(4)의 형성 후에, 중합체 및 광 발광성 입자들을 포함하는 나노복합체가 기재(1)와 전극(4) 위에 형성된다. 중합체 및 광 발광성 입자들의 용액을 사용할 수 있다. 상기 광 발광성 입자의 예로서 UV 광선(약 265 ㎚의 파장)에 노출 시 가시 광선(예를 들어 녹색)을 방출시키는 입자, 예를 들어 Mn으로 도핑된 ZnS(즉 ZnS:Mn)를 언급할 수 있다.
나노복합체가 광학 활성 층(2)으로서 사용되는 실시태양에서, 나노복합체가 기재 상에 형성된다. 도 1을 참고로, ssDNA(3)가 상기 나노복합체 상으로 그래프트팅된다. 바람직하게는 상기 나노복합체 표면을 상기 표면에 대한 ssDNA의 선택적인 그래프트팅이 허용되도록 개질시켰다. 상기 선택적인 개질은 단순한 미세 피펫 분배에 의해 사용될 수 있는 ssDNA의 큰 조합을 갖는 칩의 제작을 가능하게 한다.
임의의 선택적인 사전 그래프트팅 표면 개질 후에, ssDNA(3) 층을 예를 들어 적합한 커플링 결합, 예를 들어 한쪽 단부는 (표면 개질된) 폴리스티렌 표면과 반응하고 다른쪽 단부는 ssDNA의 3' 또는 5' 단부에 부착되는 이 작용화된 유기 화합물에 의해 그래프팅시킨다. 상기와 같은 유기 화합물의 예들을 시그마 케미칼 캄파니(St. Louis, Missouri) 및 몰레큘라 프로브스 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
바람직하게는 상기 작용기는 선택성이 성취되도록 매우 극성이다. 상기 중합체 표면의 별도의 영역들을 작용화시킴으로써, ssDNA를 이들 영역에 "국소적으로" 한정되게 그래프팅시킬 수 있다. 바람직하게는 이들 영역은 상이한 표면 개질된 영역들에 상이한 ssDNA 서열을 미세 피펫팅하는데 편리하도록 약 100 x 100 ㎛이다. 따라서 다양한 서열들을 갖는 공지된 ssDNA의 배열을 기재(1) 상에 침착시킬 수 있다. 상기 작용화된 표면은 매우 극성이고 상기 중합체(예를 들어 폴리스티렌)는 비 극성이므로, 상기 DNA용액은 표면 장력으로 인해 상기 작용화된 영역들 위에서 자가 정렬될 것이다.
광학적으로 활성인 중합체 지지체에 그래프팅된 ssDNA(3)는 공지되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 ssDNA(3)는 ssDNA의 단일층으로 필수적으로 이루어진다. 상기 공지된, 그래프팅된 ssDNA(3) 층을 샘플 중의 분자들과의 결합에, 예를들어 샘플의 미지의 ssDNA와의 하이브리드화에 이용할 수 있다. 방출된 가시광선의 양은 DNA 층이 단일 가닥에서 이중 가닥으로 변함에 따라 상기 층의 반사력의 차이에 따라 단조롭게 증가한다. 상기 반사력의 차이는 ssDNA로부터 dsDNA로 복합 굴절률이 변함에 따라 단조롭게 증가한다.
도 1을 참고로, 완성된 구조는 2 개의 활성 층, 즉 광 발광성 입자들로 구성된 광학 활성 층(2)인 나노복합체 위에 그래프팅된 ssDNA(3)의 상부 층으로 구성된다. 기재(1) 및 다른 구조물의 특성은 최종 사용 탐침 조사 방법, 예를 들어 반사 모드 또는 투과 모드에 따라 변한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 도 1 장치의 광학 활성 층(2)은 나노복합체 대신에 광 발광성 중합체이다. 상기와 같은 장치는 중합체 박막 상에 그래프팅된 ssDNA 단일 층의 2 층 구조를 포함할 수 있다. 상기 중합체 박막은 상기가 UV 영역, 바람직하게는 265 ㎚ 파장 부근의 방사선에 의해 여기될 때 형광성을 갖도록 광할 활성인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 막은 폴리스티렌을 포함할 수 있다. 상기 막을 탐침 조사를 적용하는 목적하는 최종 용도에 따라 적합한 기재 상에 침착시킬 수 있다. 상기 장치를 UV 광선(∼265 ㎚ 파장)에 노출시키는 경우, 상기 광 활성 중합체 필름은 빛을 방출할 것이고 상기 장치를 상기 열거한 바와 같이 광학 활성 층(2)이 나노복합체인 장치에 사용할 수 있다.
도 7은 본 발명에 따른 장치에 사용될 때 다양한 조건 하의 폴리스티렌으로부터의 전형적인 형광 스펙트럼을 나타낸다. 보다 낮은 강도를 갖는 짙은 색 곡선은 ssDNA의 단층으로 코팅된 폴리스티렌의 발광 스펙트럼이다. 신호는 ssDNA가dsDNA로 전환됨에 따라 강화된다. 피크 강도가 증가하고 피크 위치는 적색으로 이동한다. ssDNA가 dsDNA로 전환되기 전후의 형광 빛의 강도 차이를 콘트라스트로서 정의한다. 도 7에 나타낸 전형적인 콘트라스트는 ssDNA의 dsDNA으로의 변환에 중요하다. 이러한 방출된 빛의 강도 변화(즉 콘트라스트)를 여러 가지 방법, 예를 들어 (i) CCD 카메라를 통한 공 초점 현미경; 및/또는 (ii) 광학 섬유 방법에 의해 기록할 수 있다. 광학 섬유 통합된 광학적 접근법은 용액 중의 하이브리드화 공정 중에 온라인 측정을 허용할 것이다.
광 발광성 중합체 함유 장치의 제조는 하기와 같을 수 있다. 중합체 표면에 ssDNA를 선택적으로 그래프팅시키기 위해서 표면 개질 방법을 사용할 수 있다. 특히 상기 선택적인 개질은 단순한 미세 피펫 분배를 사용하여 큰 ssDNA 조합을 갖는 칩을 제작할 수 있게 한다. 도 2(a)를 참고로, 상기 구조는 2 개의 활성 층, 즉 본 실시태양에서 형광 중합체 층인 광학 활성 물질 층 위에 그래프팅된 ssDNA의 상부 층으로 구성된다. 상기 기재 및 다른 구조의 특성은 탐침 방법에 따라 변한다. 2 개의 전형적인, 그러나 비 제한적인 탐침 방법은 (i) 반사 모드로, 상기 장치의 위쪽에서 광 발광성 물질에 의해 생성된 가시 광을 반사시키는 반사성 Au의 제 3 층이 존재하고; (ii) 투과 모드(예를 들어 주로 장치 특성화를 위한 것)로, 상기 Au 층을 포함하지 않으며 가시적인 광 발광성 빛이 상기 샘플의 다른 쪽에서 반사된다.
상기 광 발광성 중합체는 형광 중합체 또는 중합체와 광 발광성 염료와의 블렌드로 구성될 수 있다. 상부 층 중의 ssDNA는 적합한 커플링 결합, 예를 들어한쪽 단부는 (표면 개질된) 폴리스티렌 표면과 반응하고 다른쪽 단부는 상기 ssDNA의 3' 또는 5' 단부에 부착하는 이 작용화된 유기 화합물에 의해 공지된 서열을 갖는다.
상기 작용기들은 선택성이 성취되도록 매우 극성인 것이 바람직하다. 상기 폴리스티렌 중합체의 별도의 영역들을 작용화시킴으로써, ssDNA를 이들 영역에 국소적으로 한정되게 그래프팅시킬 수 있다. 이들 영역은 상이한 영역들에 상이한 ssDNA 서열을 미세 피펫팅하는데 편리하도록 약 100 x 100 ㎛인 것이 바람직하다. 따라서 다양한 서열들을 갖는 ssDNA의 배열을 상기 폴리스티렌 기재 상에 침착시킬 수 있다. 상기 작용화된 표면은 매우 극성이고 상기 폴리스티렌은 비 극성이므로, 상기 DNA용액의 소적들은 표면 장력으로 인해 상기 작용화된 영역들 위에서 자가 정렬될 것이다. 도 6(a) 및 6(b)는 본 발명에 따른 상기와 같은 표면 개질된 폴리스티렌 필름을 나타낸다. 상기 필름을 물에 침지시킨 후에는 단지 개질된 영역만이 습윤 특성을 갖는다.
바람직하게는, 층(2)의 중합체를 DNA 흡착이 가능하지 않도록 비 습윤성인 것으로 선택한다. 그러나, 단위 당 분자 밀도를 조절할 수 있는 조절된 ssDNA 그래프팅이 허용되도록 상기 표면의 선택적인 개질을 사용할 수도 있다. 따라서, 방울이 너무 큰 경우라 할지라도, 상기 방울 자체는 상기 선택적으로 개질된 영역으로 한정될 것이다. 그래프트 밀도는 바람직하게는 인접한 쇄들의 얽힘을 피하고 용액 중에서 빠른 하이브리드화 동력학에 충분한 쇄 이동성을 허용할 정도로 충분히 작다. 또한, 상기 밀도는 상기 DNA 층에 의해 큰 흡수가 일어날 정도로 충분히 큰 것이 바람직하다. 폴리스티렌이 이러한 기준을 만족시키는 하나의 전형적인 예이다. 도 6(a) 및 6(b)는 폴리스티렌의 선택적인 개질을 나타내며, 이때 오직 노출된 영역만이 습윤되고 단일 가닥 핵산을 그래프팅시키기에 적합하다.
따라서, 본 발명에 따른 DNA 칩을, DNA 칩의 전통적인 제조 방법에 사용되는 석판 인쇄술보다 저렴한 자가 조립 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 자가 조립은 전통적인 석판인쇄-기재 DNA 칩 제조 방법보다 훨씬 더 저렴하다. ssDNA의 자가 정렬 성질은 특히 비 극성 영역으로 둘러싸인 작용성 극성 영역을 이용한다. 분 당 다수의 침착이 가능한, 신뢰성 있고 비교적 빠른 제조 방법이 성취될 수 있다.
본 발명에 따른 장치의 또 다른 제조 방법은 블록 공중합체 주형 위에 나노입자를 장식하는 것이다. 2 가지 이상의 쇄 유형을 포함하는 블록 공중합체를 기재 위에 침착시킨다. 상기 침착은 용액 공정 또는 고체 형성 공정에 의해 수행된다. 상기 블록 공중합체 필름을 열적으로 처리하여 나노상을 별도의 소수 중합체 상들로 분리시킨다. 상기 분리된 상의 구조는 상기 블록 공중합체의 구성성분에 따라 나노규모의 직경 또는 다른 (보다) 복잡한 기하를 갖는 나노 구 또는 실린더일 수 있다. 상기 필름의 중요한 성질은 특징적인 치수가 5 내지 500 ㎚ 규모인 상 분리된 영역을 갖는 구조이다.
이어서, 상기 블록 공중합체에 표면을 식각시키는 표면 처리를 가하여 상기 분리된 상을 노출시키고 동일한 공정에서 상기 분리된 상의 표면을 활성화시킨다. 그러나, 상기 식각된 "매트릭스" 중합체는 활성화되지 않는다. 후속적으로, 상기구조를 상기 블록 공중합체를 공격하지 않는 용매 시스템 중의 무기 및/또는 유기 금속 염의 전구체 용액에 노출시킨다. 상기 염(들)은 활성화된 표면과 반응하여 상기 분리된 상의 노출된 표면 상에 선택적인 침착을 형성한다.
이어서, 상기 침착된 염을 반응성 기체 또는 활성 용액과 반응시켜 상기 분리된 상 영역으로 특정하게 한정되는 나노입자를 형성시킨다. 상기 샘플을 상기 나노입자 합성 단계 전 또는 후에 임의로 어닐링시킬 수도 있다. 어닐링은 생성된 나노입자를 분리된 상 중에 매몰시킨다. 생성된 구조를 나노입자를 갖는 중합체 방울로서 정의한다.
도 14는 본 발명에 따른 칩을 제조하기 위한 전형적인 공정 흐름도를 개략적으로 나타낸다. 약 10 내지 1000 ㎚ 크기 범위의 중합체성 "방울"(6)을 기재(1) 위에 생성시킨다. 상기 방울은 랜덤하거나 또는 주기적인 배열일 수 있다(도 14(a)를 참조하시오). 후속적으로 단일 가닥 핵산 분자(3a)가 각각의 방울(6)에 부착된다(예를 들어 그래프팅에 의해) 상기 방울 크기 및 핵산 서열(3a) 중의 염기의 수에 따라, 방울(6) 당 핵산 서열(3a)의 수는 약 1 내지 10의 범위일 수 있다. 50 ㎚ 이하의 방울 직경 및 80 염기 쌍 이상을 갖는 핵산 분자에 대해서, 상기 핵산 분자의 수는 방울 당 하나일 듯 하다.
도 15(a) 내지 (g)는 본 발명에 따른 핵산 칩의 전형적인 제조 방법을 나타낸다. 도 15(a)가 나타내는 바와 같이, 기재(1) 상에 출발 물질로서 블록 공중합체(8)를 제공하며, 이때 상기 공중합체에서 블록들 중 하나(8B)는 오존 또는 산소 플라스마와 같은 산화 공정에 의해 식각될 수 있는 디엔 중합체이다. 다른 중합체 단편(8A)은 내오존 중합체이다. 중합체 단편(8B)가 큰상이고 중합체 단편(8A)(구로서 나타냄)는 작은 상이다. 조성은 작은 상(8A)이 분리되어 구 또는 구형 입자를 형성하도록 되어 있다. 블록 공중합체(8)는 명목 상 규칙적인 격자로 자가 조립되는 구를 갖도록 적절히 단 분산되는 것이 바람직하다. 예로서, 작은 상인 중합체 단편(8A)는 폴리스티렌(PS) 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)일 수 있고 큰 상(8B)는 폴리이소프렌 또는 폴리부타디엔일 수 있다.
도 15(b)에서, 블록 공중합체 박막(8)을 회전 주조하고 어닐링시켜 미세 상의 분리된 구의 단일 층을 형성시킨다. 이어서 매트릭스를 오존 또는 플라스마에 의해 식각시켜 단리된 A-구(8a)를 형성시킨다. 후속적으로 상기 구(8a)를 상기 중합체의 유리 전이 온도 이상에서 어닐링시켜 중합체 "방울"(88)을 형성시킨다(도 15(c) 참조). 다음 단계에서, 기재(1)의 표면(1a)을 음이온 그룹(도 15(d) 참조)에 의해 개질시켜 개질된 방울(88a)을 제공한다. 상기와 같은 개질에 사용되는 그룹은 Zn, Cd, Pb 또는 Hg 염의 수용액에 노출 시 염을 형성하는 강한 음이온일 수 있다. 어닐링시켜 어닐링된 방울(88b)을 형성시키고 H2S에 노출시킬 때(도 15(e) 참조), II-VI 칼코게니드 나노입자(9)가 상기 방울(88c) 중에 형성될 것이다(도 15(f) 참조). 최고의 광 발광을 제공하기 위해서, 전형적인 나노입자를 예를 들어 ZnS:Mn 또는 ZnS:Ag와 같이 도핑시킬 수 있다. 전자는 UV 범위에서 핵산의 최대 흡수에 가까운 265 ㎚ 부근에서 최고의 광 발광 강도를 갖는다.
다음 단계에서, 상기 방울 표면을 습윤 화학, 플라스마 또는 코로나에 의해 다시 개질시켜 핵산 쇄의 3' 또는 5' 단부와 반응할 수 있는 잔기를 형성시킨다. 예를 들어, 하이드록실 그룹이 수 플라스마에 의해 형성되는 경우, 포스페이트 단부가 반응하여 공유 결합을 형성할 것이다. 따라서 상기 핵산 쇄가 중합체 방울 표면 상에 그래프팅될 것이다. 상기 핵산의 크기에 따라 방울 당 하나 이상의 쇄가 그래프팅될 수 있다. 50 염기 쌍 이상의 장쇄의 경우, 상기 쇄의 측부 길이에 기인하여 방울 당 단지 하나의 쇄 만이 그래프팅될 수 있다(도 15(g)의 확대도인 도 16(a)를 참조하시오). 도 15(g) 및 도 16(a)는 방울(88d) 중의 나노입자(9) 및 단일 가닥 핵산(3a) 그래프트를 갖는 최종 구조를 나타낸다. 상기와 같은 표면이 단일 가닥 핵산 단편들의 혼합물에 노출되면, 상기 기재 상에 그래프팅된 탐침 단일 가닥 핵산은 화학적 족집게와 같이 작용하여 하이브리드화를 위해 상보적인 단일 가닥 핵산을 집어낼 것이다. 상기 표면 상에 생성된 이중 가닥 핵산(33)을 도 16(b)에 나타낸다. 나노입자(9)는 일반적으로 2 내지 30 ㎚ 범위의 직경을 갖는다. 방울(88d)은 일반적으로 약 10 내지 100 ㎚의 직경 및 약 10 내지 100 ㎚의 높이를 갖는다.
도 16(a) 내지 (b)의 장치와 유사한 장치에 대해서, 판독 방법을 하기와 같이 제공할 수 있다. 짝을 가리키는 하이브리드화된 부위들에 대한 판독을 도 17(a) 내지 (c)에서 설명한다. 핵산이 없는 칩을 UV 광선(여기 광선 또는 탐침 광선)에 노출시키면, 광 발광성 나노입자는 가시 범위에서 I0를 방출한다(도 17(a)참조). 상기 가시 광선은 모든 방향으로 동일하다. 탐침(즉 UV) 광선으로부터 임의의 간섭을 피하기 위해서 발광 강도 I0를 수직 방향으로 기록한다. 단일 가닥 핵산(3a)을 갖는 핵산 칩을 노출시키는 경우에는 상기 나노입자 상에 입사된 빛이 단일 가닥 핵산의 부착으로 인한 상부 표면의 광학 성질(즉 흡수, 반사력 또는 산란)의 변화로 인해 변하기 때문에 강도가 I0에서 Ii로 변한다(도 17(b) 참조). 상기 강도는 상기 단일 가닥 핵산이 하이브리드화되어 이중 가닥 핵산(33)을 형성하는 경우 추가로 If로 변한다(도 17(c) 참조). 도 17(b)에서 17(c)로의 변화는 단일 가닥에서 이중 가닥으로 전환함에 따른 DNA의 복합 굴절률의 변화에 기인한다. 따라서 상기 나노입자로부터의 광 발광성 빛의 양은 도 17에 나타낸 3 가지 경우에 상응하게 변할 것이다. 콘트라스트 Ii-I0는 단위 면적 당 단일 가닥 핵산 분자의 수에 비례한다. 따라서 하이브리드화에 이용할 수 있는 부위들의 등급화가 제공될 것이다. 콘트라스트 If-I0=ΔI는 이중 가닥에 하이브리드화된 단일 가닥 핵산의 수에 비례한다.
상기 논의된 제조 방법들은 예로서 제한 없이 나타낸 것이다. 예를 들어, ssDNA를 언급한 경우 상기 방법들을 다른 핵산에 적용시킬 수 있다.
상기 언급한 제조 방법들 중 임의의 방법 또는 다른 적합한 방법을 사용하여, 화소(5)들의 배열을 갖는 도 13의 것과 같은 바이오칩을 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 광 발광성 측정을 위해 104화소(부위)의 DNA 칩을제공한다. 동일한 화소를 통계학적 유의수준을 확립시키기 위해 반복된 측정을 수행할 수 있도록 상이한 위치들에서 100 배 반복할 수 있다. 예를 들어, 도 16(a)에서와 같이 나타낸 구조를 갖는 104㎛2크기의 탐침을 제조할 수 있다. 각각의 기재는 상이한 단일 가닥 핵산 탐침을 가질 수 있다. UV 광선 입력과 가시광선 출력을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 전형적인 통합된 광학 방법에 의해 기재에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 광학 섬유를 사용할 수 있다. 소음 비에 대한 신호를 개선시키기 위해서 입사 광선을 변조하고 출력 신호를 동일한 주파수로 고정시킬 수 있다. 상기와 같은 통합된 접근법은 유리하게는 각각의 섬유 또는 섬유 다발이 다른 섬유 다발과 상이한 단일 가닥 핵산의 유형을 갖는 온라인 센서를 확립시킨다. 이러한 방식으로, 여러 단일 가닥 핵산들을 혼합물 중에서 동시에, 예를 들어 다수 유전자 탐침으로 탐침 조사할 수 있다.
"디지털" 접근법을 본 발명에 따른 바이오칩의 제작에 사용할 수 있으며, 여기에서 탐침 부위들을 10 내지 50 ㎚의 주기성으로 주기적인 배열로 배열한다. 별도의 주기적인 배열은 높은 감도와 정확성으로, "아날로그" 방법에서 인접한 단편들로부터의 신호의 중복으로 인해 발생될 수도 있는 소음/에러가 적은 절대적인 핵산 카운트를 허용할 것이다. 통상적인 바이오칩 기술에 비해, 본 발명의 방법 및 제품은 크기 103내지 104이하의 샘플에 사용할 수 있다. 또한, 상기 배열 제작은 값비싼 석판인쇄 기법 대신에 비교적 저렴하고 매우 평행한 자가 조립 접근법을 기본으로 할 수 있다.
본 발명을 특히 핵산과 관련하여 상기에 논의하였다. 단백질의 복합 굴절률이 또한 다른 단백질과 반응하거나 구조의 변경에 따라 UV 범위에서 상당히 변하기 때문에, 센서 또는 분석 장치를 핵산과 관련하여 상기 논의된 바와 같이 항원 및 단백질의 탐침 조사를 위해 제작할 수 있다. 따라서, 항원-항체 센서가 제공될 수 있다. 상기와 같은 장치에서, 목적하는 항체를 단일 가닥 핵산 대신 사용한다. 표지화가 필요하지 않기 때문에, 상기와 같은 장치는 기체 또는 액체 중에 있는 작은 수준의 항원 및 단백질을 탐지하는데 매우 민감한 센서일 수 있다. 탐지 및 장치 제작의 원리는 단일 가닥 핵산의 사용에 대해서 상기에 나타낸 바와 같다.
본 발명에 따른 비 제한적인 예는 하기와 같다.
실시예 1
폴리스티렌(PS)/폴리부타디엔(PB)의 블록 공중합체 필름을 규소(Si) 표면 상에 침착시켜 매우 정렬된 PS 구의 분리된 상을 생성시켰다. 도 8을 참조하시오. 이어서 상기 구조를 수증기 함유 플라스마에 노출시켜 부타디엔을 식각시키고 폴리스티렌을 개질시켰다. 도 9는 노출 시간의 함수로서 식각 정도를 나타내는 전형적인 식각 곡선(폴리부타디엔에 대한)을 나타낸다. 표면 개질이 실제로 선택적인지를 확인하기 위해서, 순수한 중합체 PS 및 PB를 유사한 처리에 노출시켰다. 도 10에서 플라스마 노출의 함수로서 물의 습윤 각은 PS가 개질되고 매우 극성(즉 습윤)으로 되나, PB는 어떠한 현저한 방식으로도 개질되지 않음을 분명히 나타낸다. 특히 도 10은 물의 접촉 각이 PS에 대해서는 감소하지만 PB의 경우 처리 시간이 증가함에 따라 여전히 높게 유지됨을 나타낸다. 활성화된 표면을 Zn-염 용액에 침지시키고 H2S에 노출시켜 ZnS를 형성시킨다. 도 11은 PS 구가 PB 매트릭스에 비해 밝은 전형적인 전계 방출 주사 전자 현미경 사진(SEM)을 나타낸다. PB의 밝기는 매트릭스 중의 저 원자량 물질(즉, C 및 H)에 비해 고 원자번호 Zn의 존재에 기인한다. 도 11에서, 블록 공중합체 상의 ZnS 나노입자를 나타내며, 특히 PS 분리된 섬들은 구형이고 상기 매트릭스에 비해 밝으며, 이는 ZnS가 PS에만 한정된 것을 가리킨다. PS 구의 랜덤한 배열은 PB의 지나친 식각에 기인한다. ZnS 입자로부터의 광 발광을 나타내는, 도 12에 나타낸 생성된 샘플의 광 발광(PL) 스펙트럼은 ∼420 ㎚에서 전형적인 방출 피크가 100 ㎚ 이상까지 이동된 강한 청색임을 나타내며, 이는 ZnS의 나노입자의 존재를 가리킨다. 상기 강한 청색 이동은 공칭 크기가 <3 ㎚인 ZnS 입자를 가리키는 양자 제한 효과의 표시이다.
실시예 2
자가 조립된 블록 공중합체 단일 층 및 고도의 이방성 식각을 사용하여, ssDNA 단편(x)을 나노입자 코팅된 중합체 방울에 그래프팅시킴으로써 구조를 만든다. 상기 방울(폴리스티렌(PS)으로 제조됨)을 (규소) 기재 상에 주기적으로 배열시킨다. 상기 방울의 주기와 크기는 10 내지 20 ㎚의 범위이다(도 14(a) 참조).직접적인 밴드 갭 반도체 나노입자들을 명목상으로 단 분산된 크기 분포를 보장하고 상기 공정을 간단히 하기 위해서 동일 반응계에서 중합체에 매몰시킨다. 발광 여기를 최대 ∼260 ㎚(DNA의 최대 흡수에 가까움)로 맞출 것이다. ssDNA가 그래프팅됨에 따라, 가시 범위의 발광 빛은 I0에서 Ii로 감쇠될 것이다. 따라서 x 그래프트를 갖는 탐침 부위가 ssDNA 혼합물에 노출될 때 차이 ΔI=If-Ii를 측정함으로써 y 단편들의 양을 정량적으로 산출할 수 있다. ΔI와 관련된 상수 및 기재에 부착된 y의 수에 대한 눈금화는 x 부위의 수를 알고 있기 때문에 정확하게 측정된다. 측정 가능한 상수, 즉 ΔI의 ∼10%의 변화를 달성하기 위해서, 최소 ssDNA 크기는 50 염기 쌍 서열이다. 20 ㎚ 높이 배열 상의 50 염기 서열 ssDNA에 대해서 가우스 쇄의 측부 크기로 인해 방울 당 단지 하나의 쇄 만이 가능하다(도 14(a) 참조). 줄잡아 25%의 양자 효율 및 30°의 탐지기 허용 각도를 갖는 나노입자 단일 층에 대해 104㎛2의 전체 배열 크기가 I0, Ii및 If를 측정하기에 충분하다. 이러한 방식은 배열 당 2.5 x 107ssDNA(또는 ∼10 페모트그램)를 측정하는 감도가 가능하다. 상이한 ssDNA 그래프트들의 다수 배열들이 조화를 이루게 하고 각각의 배열을 100 ㎛ 직경의 광학 섬유에 접속시킴으로써, 여러 단편들의 병행 분석을 성취할 수 있다.
본 발명을 그의 바람직한 실시태양들과 관련하여 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명을 첨부된 청구의 범위의 진의 및 범위 내에서 변경하여 실시할수 있음을 인식할 것이다.

Claims (50)

  1. (A) 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 제 1 층 및 광 발광성(photoluminescent) 물질을 포함하는 제 2 층으로 이루어진 센서를 제공하는 단계;
    (B) 상기 센서를 상기 단일 가닥 핵산 서열이 생물학적 샘플 중의 관심의 물질에 결합하기에 충분한 시간 동안 상기 생물학적 샘플에 노출시키는 단계;
    (C) 상기 센서를 빛에 노출시키고 상기 센서로부터의 광 발광을 측정하는 단계
    를 포함하는, 분자들의 결합을 표지화 없이(tagging-free) 탐지하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA, RNA 및 PNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 표지화 없는 탐지 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 방향족 중합체, 도핑되거나 도핑되지 않은 금속 산화물, 설파이드, 셀레나이드, 아르세나이드, 텔루라이드, 및 니트라이드 및 포스파이드 나노복합체들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 표지화 없는 탐지 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 매트릭스 물질을 포함하고, 이때 광 발광성 물질이 상기 매트릭스 물질과 회합되어 있는 표지화 없는 탐지 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 광 발광성 물질이 매트릭스 물질 중에 매몰되어 있는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 폴리스티렌을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 중합체 매트릭스 중에 광 발광성 입자를 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 광 발광성 입자가 II 족 및 VI 족으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 도핑되거나 도핑되지 않은 화합물인 표지화 없는 탐지 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 도핑되거나 도핑되지 않은 황화 아연을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 나노복합체를 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 측정 단계가, 200 내지 700 ㎚ 범위의 파장을 갖는 자외선을 제 1 층에 적용시키는 경우, 제 2 층으로부터의 광 발광성 빛을 감지함을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 적용된 자외선 광의 파장이 260 내지 265 ㎚의 범위인 표지화 없는 탐지 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 제 1 층이 ssDNA 단일 층을 포함하는 표지화 없는 탐지방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 박막 또는 지지체를 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 중합체를 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 핵산 서열이 5 내지 200 염기 쌍인 표지화 없는 탐지 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 서열이 약 25 염기 쌍인 표지화 없는 탐지 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 제 2 층이 200 내지 700 ㎚ 범위의 파장을 갖는 빛에 의해 여기될 때 형광을 발하는 표지화 없는 탐지 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 센서가 제 1 층으로서 제 2 층에 그래프트된 ssDNA를 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 제 1 층의 상이한 부분들에 상이한 핵산 서열을 포함하는 불연속적인 제 1 층을 제공함을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 제 1 층을 제 2 층의 제 1 면 위에 배치시키고, 측정 단계가 상기 제 2 층의 제 2 면으로부터의 광 발광을 측정하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 제 2 면이 제 2 층의 제 1 면과 대향되어 있는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 제 1 층을 제 2 층의 제 1 면 위에 배치시키고, 측정 단계가 상기 제 2 층의 상기 제 1 면으로부터 반사된 광 발광을 측정하는 방법.
  24. 광원;
    핵산 층 및 광 발광성 층을 갖는 센서; 및
    광 발광 탐지기
    를 포함하는, 분자들의 결합을 표지화 없이 탐지하기 위한 장치.
  25. 제 24 항에 있어서, 광원이 자외선 광원인 장치.
  26. 제 24 항에 있어서, 광원이 적외선 광원인 장치.
  27. 제 24 항에 있어서, 광원이 가시 광원인 장치.
  28. 제 24 항에 있어서, 탐지기가 적외선 내지 자외선 범위의 광 탐지기인 장치.
  29. 제 28 항에 있어서, 광원이 가시 광원인 장치.
  30. 제 25 항에 있어서, 자외선 광원이 약 260 내지 265 ㎚ 범위의 자외선 광을 제공하는 장치.
  31. 단일 가닥 핵산 서열을 광 발광성 물질과 접촉시킴을 포함하는, 표지화 없는 센서의 제조 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 기재 상에 광 발광성 물질을 침착시켜 표면을 형성시키고, 그 후에 상기 표면을 금속 염으로 이온 교환 처리하여 개질시킨 다음, 이온-매몰시키고, 이어서 상기 이온-매몰된 물질을 반응성 매질에 노출시켜 광 발광성 입자를 형성시킴을 포함하는 방법.
  33. 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층을 포함하는 표지화 없는 센서.
  34. 제 33 항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA, RNA 및 PNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 센서.
  35. 제 33 항에 있어서, 제 2 층이 방향족 중합체, 금속 산화물 및 황화물, 및 나노복합체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 센서.
  36. 제 33 항에 있어서, 제 2 층이 폴리스티렌을 포함하는 센서.
  37. 제 33 항에 있어서, 제 2 층이 황화 아연을 포함하는 센서.
  38. 제 33 항에 있어서, 제 2 층이 나노복합체를 포함하는 센서.
  39. 제 33 항에 있어서, 핵산 서열이 약 25 염기 쌍인 센서.
  40. 제 33 항에 있어서, 제 1 층이 ssDNA 단일 층을 포함하는 센서.
  41. 제 33 항에 있어서, 제 2 층이 UV 영역에서 방사선에 의해 여기될 때 형광을 발하는 물질로부터 제조되는 센서.
  42. (A) 항체를 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층으로 구성된 센서를 제공하는 단계;
    (B) 상기 센서를 상기 항체가 생물학적 샘플 중의 관심의 항원에 결합하기에 충분한 시간 동안 상기 생물학적 샘플에 노출시키는 단계;
    (C) 상기 센서로부터의 광 발광을 측정하는 단계
    를 포함하는, 항원들의 결합을 표지화 없이 탐지하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 200 내지 700 ㎚ 범위의 파장을 갖는 자외선 광을 제 1 층에 적용시킬 때 제 2 층으로부터 반사된 빛의 광 발광성을 측정함을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 적용된 자외선 광의 파장 범위가 260 내지 265 ㎚인 표지화 없는 탐지 방법.
  45. 제 42 항에 있어서, 제 2 층이 자외선 조사에 의해 여기될 때 형광을 발하는 표지화 없는 탐지 방법.
  46. 제 42 항에 있어서, 제 1 층이 불연속적이고 상이한 항체들을 포함하는 표지화 없는 탐지 방법.
  47. 광원;
    항체를 포함하는 제 1 층 및 제 2 광 발광성 층을 갖는 센서; 및
    광 탐지기
    를 포함하는, 항체 결합을 표지화 없이 탐지하기 위한 장치.
  48. 항체를 포함하는 제 1 층 및 광 발광성 물질을 포함하는 제 2 층을 포함하는, 표지화 없는 센서.
  49. 제 48 항에 있어서, 제 1 층이 불연속적이고 상이한 항체들을 포함하는 센서.
  50. 제 49 항에 있어서, 상이한 공지된 항체들을 포함하는 센서.
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