CN103728451B - 一种检测赭曲霉素a的胶体金免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒包括检测试纸；所述检测试纸包括底板，粘合在底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上靠近结合垫的一侧设有检测线，硝酸纤维膜上靠近吸水垫的一侧设有质控线；所述结合垫上涂有被赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线上涂有BSA-OTA；所述质控线上涂有羊抗鼠IgG；所述单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。该试剂盒的特点在于在标记抗体的同时，将一段单链核酸协同标记在胶体金表明，有效减低了非特异性吸附，减少标记抗体的用量，制成的免疫层析试剂盒，灵敏度达到5ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗检测产品及其制作方法，尤其涉及一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体颗粒的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端接触到样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，从而实现特异性的免疫诊断。
常用的免疫层析法所用的特异识别检测物的生物大分子都是抗体，通过抗原抗体特异识别反应，标记在抗原或抗体上的免疫胶体颗粒使检测线和质控线显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。但是该方法检测不够快速和灵敏，而且用抗体检测还需要用到相应的仪器设备，操作不简便。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种制作胶体金免疫层析检测试剂盒，通过在检测线和质控线上显示红色，来实现在样品中直接检测赭曲霉素A。
为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案为：
所述检测黄曲霉素B1的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板，粘合在底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上靠近结合垫的一侧设有检测线，硝酸纤维膜上靠近吸水垫的一侧设有质控线；所述结合垫上涂有被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线上涂有BSA-OTA；所述质控线上涂有羊抗鼠IgG；所述单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。
优选地，所述底板为PVC板；样品垫和结合垫的材料为聚醋纤维；所述吸水垫为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
本发明还提供了上述试剂盒的方法，包括如下步骤：
（1）用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金，得包被后的胶体金溶液；
（2）将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用；
（3）在硝酸纤维膜上检测线位置喷点BSA-OTA溶液；在质控线位置喷点羊抗鼠IgG溶液，烘干备用；
（4）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。
优选地，步骤（1）胶体金直径为13-40nm。
优选地，步骤（1）所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体加入胶体金溶液，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L，鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为3-5μg/mL，于2000rpm/min条件下离心去除沉淀，然后再上清中加入如SEQ ID NO.1所示的单链核酸，此时，胶体金溶液中单链核酸浓度为18-28μg/mL，于1500rpm/min条件下离心后将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
优选地，步骤（1）所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体与如SEQ ID NO.1所示的单链核酸混合，得到抗体核酸混合物，然后将抗体核酸混合物加入胶体金溶液中，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L，鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为5-8μg/mL，单链核酸浓度为20-25μg/mL；再将加入了抗体核酸混合物的胶体金溶液离心，将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
优选地，步骤（3）所述BSA-OTA溶液配制方法是将浓度为1-1.5mg/mLBSA-OTA溶于PBS缓冲液中得到BSA-OTA浓度为0.5-1mg/mL BSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的浓度为1-2mg/mL。
使用本试剂盒时，将待测标本加入到点样孔，待测标本在毛细作用下沿着样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜向吸水滤纸端方向层析；检测时，如果待测标本中的含有检测物赭曲霉素A，且浓度高于5ng/mL，赭曲霉素A先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，不再和检测线上的BSA-OTA结合，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线；检测时，如果待测标本中的不含有检测物赭曲霉素A，结合垫上的金标抗体复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，和检测线上的BSA-OTA结合，这样检测线位置出现标记胶体金的红色，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线；检测时，如果待测物中赭曲霉素A浓度低于5ng/mL，赭曲霉素A先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，再和检测线上的BSA-OTA结合，这样检测线位置也会出现标记胶体金的红色，由于免疫竞争反应，赭曲霉素A浓度比5ng/mL越低，检测线的红色越红，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线。
该试剂盒的特点在于在标记抗体的同时，将一段单链核酸协同标记在胶体金表面，有效减低了非特异性吸附，减少标记抗体的用量，制成的免疫层析试剂盒，灵敏度达到5ng/mL。
附图说明
图1为本发明试剂盒中检测试纸结构示意图；
图2为本发明的原理示意图；
图3为本发明检测过程示意图；有检测物：表示检测物浓度高于最低检测浓度，检测线为红色（图中为深色）；无检测物：表示检测物浓度高于最低检测浓度，检测线位置无色（图中为空白）；
图4为本发明免疫层析法检测结果判定图，其中，T表示检测线，C表示质控线。
图中：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7吸水垫。
具体实施方式
实施例1
参见图1，所述检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板1，粘合在底板1上且依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫7；所述硝酸纤维膜4上靠近结合垫3的一侧设有检测线5，硝酸纤维膜4上靠近吸水垫7的一侧设有质控线6；所述结合垫3上涂有被赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线5上涂有BSA-OTA；所述质控线6上涂有羊抗鼠IgG；所述单链核酸序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’（SEQ ID NO.1），所述单链核酸3’端标记有巯基，即（5’-TTTTTTTTTTTTTTT-SH3’）。所述底板1为PVC板；样品垫2和结合垫3的材料为聚醋纤维；所述吸水垫7为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
试剂盒的实际使用
下面介绍本发明的使用方法，不能做为本发明的限制。
1.试剂与样品：赭曲霉素A购自SIGMA公司，葡萄酒购自超市。
2.阳性样品制备：用含50%甲醇（体积比）的0.0l M pH7.4 PBS缓冲液将赭曲霉素A配制成1μg/mL的标准液。取葡萄酒样品1mL，加入4mL乙酸乙酯，颠倒混匀后静置5min；取200μL上层液体，电吹风吹干或凉干；向吹干的样品管中加入0.0l M pH7.4 PBS缓冲液l000μL，充分涡动或反复吹打管壁约2min，这样就获得了葡萄酒提取液。分别向8管葡萄酒提取液中加入不同体积的赭曲霉素A标准液，制成终浓度为0ng/mL、2.5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的阳性样品。
3.阴样品制备：取8管葡萄酒提取液，不添加赭曲霉素A标准液，但添加与各管阳性样品所加标准液体积相同的PBS缓冲液。
4.分别从16管待检样品中吸取100μL液体，滴加到检测卡的样品孔中，10min后观察检测结果。
5.检测结果：重复以上实验三次，阴性样品检测结果全部为阴性。阳性样品检测结果如表1所示：
表1：赭曲霉素A检测试剂盒灵敏度
4.从上述梯度实验结果可以得出本发明的赭曲霉素A检测试剂盒的灵敏度为5ng/mL。按照国家关于葡萄酒中含赭曲霉素A不得超过5μg/kg的标准，即约5ng/mL，本试剂盒可以做为快速鉴定葡萄酒中含赭曲霉素A的定性检测试剂。
实施例2
制备实施例1所述试剂盒的方法，包括如下步骤：
（1）直径为13-40nm的胶体金颗粒11000rpm/min离心15min，吸出上清，加入无菌水，再滴加重量体积比浓度为2%的0.1M K2CO3溶液，得到胶体金溶液；将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体逐滴缓慢加入到胶体金中，以1000rpm/min搅拌45min后，以2000转/分离心20min，去沉淀，在上层红色胶体金中缓慢加入终浓度为20μg/mL的3’标记有巯基的单链核酸5’-TTTTTTTTTTTTTTT-SH3’，再以800rpm/min，继续搅拌120min；接着以10000rpm/min离心40min，小心吸去上清，在沉淀中加入含0.5%（质量百分比含量）BSA的0.02M pH8.0的Tris-HCL缓冲液，即得被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和单链核酸包被后的胶体金溶液，4℃保存备用；
（2）将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，喷涂量为8μL/厘米，37℃烘干2h，4℃保存备用；
（3）在硝酸纤维膜上检测线位置喷点BSA-OTA溶液；在质控线位置喷点羊抗鼠IgG溶液，37℃烘干2h，密封好并置于室温备用；所述BSA-OTA溶液配制方法是将浓度为1.5mg/mLBSA-OTA溶于0.0l M pH7.4 PBS缓冲液中得到BSA-OTA浓度为1mg/mLBSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的浓度为1mg/mL；检测线和质控线相隔3mm；
（4）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成3-4㎜宽度的检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装，即得检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒。
将持测样品用乙酸乙酯抽提后，复溶在0.0l M pH7.4 PBS缓冲液中作为待测样本，吸取待测样本0.1mL滴入加样孔，若质控线不显色为无效，若检测线显红色而质控线不显色也视为无效，若质控线和检测线均出现红色，表示在检测样品中有高于最低检测浓度5ng/mL。
实施例3
制备实施例1所述试剂盒的方法，包括如下步骤：
（1）将鼠抗赭曲霉素A（OTA）单克隆抗体与3’端标记有巯基的单链核酸5’TTTTTTTTTTTTTTT-SH3’混合，得到抗体核酸混合物，然后将抗体核酸混合物加入胶体颗粒直径为40nm的胶体金溶液中，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为4nmol/L，鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为5μg/mL，单链核酸浓度为20μg/mL；室温搅拌90分钟后，以1000rpm/min4℃离心20分钟，去沉淀，在上层红色胶体金中逐滴缓慢加入0.25%BSA溶液，以1200rpm/min 4℃搅拌30分钟；接着以10000rpm/min离心15分钟，小心吸去上清，在沉淀中加入含1%BSA的0.015M pH8.0的Tris-HCL缓冲液,4℃保存备用；
（2）将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，喷涂量为8μL/厘米，37℃烘干2h，4℃保存备用；
（3）硝酸纤维素膜上划线：将BSA-OTA溶解在0.0l M pH7.4 PBS缓冲液中，得到BSA-OTA浓度为1mg/mLBSA-OTA溶液，按照0.5μL/cm的量在硝酸纤维素膜上的检测线（检测线位于整条检测试纸的中线位置）上进行划线。用点膜机将羊抗鼠Ig G（1mg/mL）在硝酸纤维素膜上的质控线位置划线，检测线和质控线相隔3毫米，然后将此硝酸纤维素膜置37℃烘干2小时，密封好并置于室温备用；
（4）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成3-4㎜宽度的检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装，即得检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒。
将持测样品用乙酸乙酯抽提后，复溶在0.0l M pH7.4 PBS缓冲液中作为待测样品，吸取待测样品0.1mL滴入加样孔，若质控线不显色为无效，若检测线显红色而质控线不显色也视为无效，若质控线和检测线均出现红色，表示在检测样品中有高于最低检测浓度5ng/mL。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南大学
<120> 一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
tttttttttt ttttt 15
Claims (8)
1.一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板(1)，粘合在底板(1)上且依次搭接的样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(7)；所述硝酸纤维膜(4)上靠近结合垫(3)的一侧设有检测线(5)，硝酸纤维膜(4)上靠近吸水垫(7)的一侧设有质控线(6)；其特征在于，所述结合垫(3)上涂有被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线(5)上涂有BSA-OTA；所述质控线(6)上涂有羊抗鼠IgG；所述单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底板(1)为PVC板；样品垫(2)和结合垫(3)的材料为聚酯纤维；所述吸水垫(7)为吸水滤纸。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
4.制备权利要求1至3任一项所述试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金，得包被后的胶体金溶液；
(2)将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用；
(3)在硝酸纤维膜上检测线位置喷点BSA-OTA溶液；在质控线位置喷点羊抗鼠IgG溶液，烘干备用；
(4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)胶体金直径为13—40nm。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体加入胶体金溶液，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5—4.5nmol/L，鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为3—5μg/mL，于2000rpm条件下离心去除沉淀，然后在上清中加入如SEQ ID NO.1所示的单链核酸，此时，胶体金溶液中单链核酸浓度为18—28μg/mL，接着以10000rpm离心40min，小心吸去上清，在沉淀中加入含质量百分比含量0.5％BSA的0.02M pH8.0的Tris-HCL缓冲液，即得被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和单链核酸包被后的胶体金溶液，备用。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID NO.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体与如SEQ ID NO.1所示的单链核酸混合，得到抗体核酸混合物，然后将抗体核酸混合物加入胶体金溶液中，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5—4.5nmol/L，鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为5—8μg/mL，单链核酸浓度为20—25μg/mL；再将加入了抗体核酸混合物的胶体金溶液离心，将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述BSA-OTA溶液配制方法是将浓度为1—1.5mg/mLBSA-OTA溶于PBS缓冲液中得到BSA-OTA浓度为0.5—1mg/mLBSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的浓度为1—2mg/mL。
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