CN202149903U - C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条。该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区；硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线（T线）和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线（C线）。本实用新型的C反应蛋白试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，对C反应蛋白（CRP）进行快速定量检测，极具实用价值。

Description

C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种用于C反应蛋白(CRP)定量检测的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析试纸条。

背景技术

目前的免疫层析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微粒或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微粒虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响。

时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。

本实用新型将时间分辨荧光乳胶微球标记和免疫层析两大技术结合，得到时间分辨荧光免疫层析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay，TRF-LFIA)，开发出能够精确定量的快速免疫层析检测试纸条。

同时，本实用新型对于传统的免疫层析膜组合方式进行了改进，将原有的四层甚至五层膜系统改变成三层膜系统。

传统的免疫层析膜组合方式包括样品垫、滤血膜、结合垫、分离膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫等四到五层(四层则没有滤血功能或者将滤血功能与样品垫功能组合)。

GE公司旗下Whatman开发了具有五合一功能的膜Fusion5，集合了上述五种膜的功能，但Fusion5由于孔径较大，抗体难以固定，需要制备特殊的Stone用于固定抗体，生产工艺较为复杂，仪器设备要求较高，开发的免疫层析试剂只能用于定性检测。

本实用新型利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，并有效的降低了产品的批内差和批间差，极具实用价值。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种新型的、能快速定量检测C反应蛋白(CRP)的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析检测试纸条。

本实用新型的技术方案为：一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线(T线)和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线(C线)。

该试纸条Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区。所述微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有C反应蛋白抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。

进一步的，所述C反应蛋白抗体为C反应蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100～1000nm。

所述荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物；最优的，该铕螯合物可为Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen。

所述生物素标记蛋白可以是任何一种不影响生物素/链霉生物素与亲和素的结合，并可被生物素标记的蛋白。

较优的，所述蛋白可以是牛血清γ-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。

硝酸纤维素膜上，T线和C线相互平行，T线靠近加样孔端，C线远离加样孔端。

优选的，所述时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。

本实用新型的C反应蛋白试纸条通过双抗体夹心法原理测定C反应蛋白(CRP)。实验证实，本实用新型的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素对本实用新型的试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

附图说明

图1：本实用新型C反应蛋白试纸条结构示意图(1.塑料底板2.Fusion5膜3.硝酸纤维素膜4.吸水纸5.加样区6.微球区7.T线区8.C线区)

图2：C反应蛋白试纸条检测标准曲线

具体实施方式

如图1所示的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusion5膜2、硝酸纤维素膜3以及吸水纸4三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板1上。

Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区5，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区6，微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，所述检测微球为表面包被有C反应蛋白单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白(小牛血清白蛋白(BSA))的荧光微球；硝酸纤维素膜上设有T线7和C线8，两条线相互平行，T线靠近加样孔端，其上包被C反应蛋白单克隆抗体；C线远离加样孔端，其上包被亲和素。

进一步的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100～1000nm。

上述C反应蛋白时间分辨荧光免疫试纸条的制备及使用如下：

1.试纸条各成分的准备

1.1质控微球的制备

生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)包被的质控微球的制备：

(1)生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)的制备

用0.1M NaCNBH₃将小牛血清白蛋白(购自EQUITECH-BIO INC)配制成10mg/ml溶液，采用DMSO(二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商：SIGMA，产品号：B3295)溶液至16.172mg/ml，按照1mg蛋白加入13.5ulBiotin-X-X-NHS的量将Biotin-X-X-NHS液加入到小牛血清白蛋白溶液中，混合均匀并在4℃下放置过夜。采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记蛋白透析缓冲液(0.1M Tris，0.3M NaCl，0.005M EDTA-Na-2H₂O，pH 8.0)。透析完毕，BCA法测定蛋白浓度。

(2)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球

向10mg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6.4μl 20％的Tween-20溶液、2mg上述(1)中透析得到的生物素标记蛋白以及16μl的NaCNBH₃(25mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0.1M pH6.0MES至总体积为400μl，37°避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液(75mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250μl N，O-双三甲硅基乙酰胺(200mg/ml，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4℃13000g离心30分钟。弃上清，用1ml pH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1ml 0.05M pH8.0的HEPES缓冲液(50mMHEPES，300mM NaCl，25mM EDTA-Na-2H₂O，1.6％N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.1％Dextran，0.1％Tween-20，0.3745％TritonX-405，0.01％庆大霉素，0.05％Proclin)悬浮(其终浓度为10mg/ml)。

(3)质控微球工作液配制

根据工作需要，采用0.05M pH8.0的HEPES缓冲液将(2)中悬液稀释到相应浓度，分装保存。

1.2检测微球的制备

向10mg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6.4μl 20％的Tween-20溶液、2mg C反应蛋白(CRP)单克隆抗体以及16μl的NaCNBH₃(25mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0.1M pH6.0MES至总体积为400μl，37°避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液(75mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250μl N，O-双三甲硅基乙酰胺(200mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4℃13000g离心30分钟。弃上清，用1ml pH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1ml 0.05M pH8.0的HEPES缓冲液(50mM HEPES，300mM NaCl，25mMEDTA-Na-2H₂O，1.6％N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.1％Dextran，0.1％Tween-20，0.3745％TritonX-405，0.01％庆大霉素，0.05％Proclin)悬浮(其终浓度为10mg/ml)。

1.3微球溶液的配置

用释放缓冲液(含有20％蔗糖、5％海藻糖、0.5％N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、0.2％庆大霉素)将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0.2mg/ml，检测微球终浓度为1mg/ml。

1.4检测线(T线)溶液的配制

用10mM PB溶液将CRP单克隆抗体稀释成1mg/ml。

1.5质控线(C线)溶液的配制

用10mM PB溶液将亲和素稀释成0.5mg/ml。

2.试纸条的制备

2.1空白大卡粘贴

按照附图1的膜组合方式，硝酸纤维素膜3位于中间，Fusion5膜2与吸水纸4分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。

2.2喷膜

分别在图1中T线7、C线8位置喷上T、C线溶液，C、T线喷膜液量为1μl/cm；在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为4μl/cm。

2.3烘干

将步骤(2)中喷好试剂的C反应蛋白大卡在恒温烘箱中37℃烘干24小时。

2.4切条

将烘干的C反应蛋白大卡切割成4mm宽度的纸条，即得到C反应蛋白试纸条。

3.试纸条的定量检测

3.1绘制标准曲线

在制备好的C反应蛋白试纸条(批号：20090323)加样区中加入不同浓度的C反应蛋白(CRP)抗原标准品(取六个不同的浓度，分别为0、1、10、20、100、200mg/L，每个浓度设5个重复)，滴加上样缓冲液(PBS，含有1.6％N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.1％Tween20，防腐剂)，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号，实验结果及分析见表1：

表1CRP标准品检测结果

以抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，标准曲线数据见表2，标准曲线如图2所示。

表2CRP定量检测标准曲线数据

由图2的标准曲线我们可以看到，该标线的R²为0.9996，线性较好，可以通过该标线对样品中所含C反应蛋白(CRP)浓度进行定量分析。

3.2样品检测

在C反应蛋白试纸条(批号：20090323)的加样区依次加入待测样品，滴加上样缓冲液，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号。根据步骤(1)中的标准曲线计算待测样品中CRP抗原浓度。

4.试纸条性能测试

测定2个浓度样本的10次批内差CV，实验结果见表3，实验结果表明，试纸条的批内精密度均小于10％。

表3试纸条批内差

采用此方法制备的C反应蛋白定量检测试纸条检测范围可达到0～200mg/L，灵敏度在0.5mg/L以下，批内精密度可达10％左右，批间精密度可达15％，可同时检测全血、血清、血浆样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素对本检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

Claims (6)

1.一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线。

2.如权利要求1所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的一端设有微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球。

3.如权利要求2所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有C反应蛋白抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。

4.如权利要求3所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。

5.如权利要求1所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，检测线和质控线相互平行，其中检测线靠近加样孔端，质控线远离加样孔端。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，试纸条底部设有塑料底板。 

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