CN202166649U

CN202166649U - 新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条

Info

Publication number: CN202166649U
Application number: CN2011201617636U
Authority: CN
Inventors: 石晓强; 吴茜; 王海蛟; 赵卫国
Original assignee: Boyang Biotechnology (Shanghai) Co Ltd
Current assignee: Boyang Biotechnology (Shanghai) Co Ltd
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2021-05-19

Abstract

本实用新型涉及一种新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条。该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区；硝酸纤维素膜上设有包被有新喋呤抗原的检测线（T线）和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线（C线）。本实用新型的新喋呤试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，对新喋呤进行快速定量检测，极具实用价值。

Description

新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种用于新喋呤定量检测的新喋呤时间分辨荧光免疫层析试纸条。

背景技术

目前的免疫层析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微粒或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微粒虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响。

时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。

本实用新型将时间分辨荧光乳胶微球标记和免疫层析两大技术结合，得到时间分辨荧光免疫层析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay，TRF-LFIA)，开发出能够精确定量的快速免疫层析检测试纸条。

同时，本实用新型对于传统的免疫层析膜组合方式进行了改进，将原有的四层甚至五层膜系统改变成三层膜系统。

传统的免疫层析膜组合方式包括样品垫、滤血膜、结合垫、分离膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫等四到五层(四层则没有滤血功能或者将滤血功能与样品垫功能组合)。

GE公司旗下Whatman开发了具有五合一功能的膜Fusion5，集合了上述五种膜的功能，但Fusion5由于孔径较大，抗体难以固定，需要制备特殊的Stone用于固定抗体，生产工艺较为复杂，仪器设备要求较高，开发的免疫层析试剂只能用于定性检测。

本实用新型利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，并有效的降低了产品的批内差和批间差，极具实用价值。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种新型的、能快速定量检测新喋呤的新喋呤时间分辨荧光免疫层析检测试纸条。

本实用新型的技术方案为：一种新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有新喋呤抗原的检测线(T线)和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线(C线)。

该试纸条Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区。所述微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有新喋呤抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。

进一步的，所述新喋呤抗原为新喋呤的竞争性抗原；较佳的，所述新喋呤的竞争性抗原为新喋呤抗原复合物。新喋呤抗体为新喋呤的单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100～1000nm。

所述荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物；最优的，该铕螯合物可为Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen。

所述生物素标记蛋白可以是任何一种不影响生物素/链霉生物素与亲和素的结合，并可被生物素标记的蛋白。

较优的，所述蛋白可以是牛血清γ-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。

硝酸纤维素膜上，T线和C线相互平行，T线靠近加样孔端，C线远离加样孔端。

优选的，所述时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。

本实用新型的新喋呤试纸条通过竞争法原理测定新喋呤。实验证实，本实用新型的新喋呤时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素对本实用新型的试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

附图说明

图1：本实用新型新喋呤试纸条结构示意图(1.塑料底板 2.Fusion5膜 3.硝酸纤维素膜4.吸水纸 5.加样区 6.微球区 7.T线区 8.C线区)

图2：新喋呤试纸条检测标准曲线

具体实施方式

如图1所示的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusion5膜2、硝酸纤维素膜3以及吸水纸4三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板1上。

Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区5，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区6，微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，所述检测微球为表面包被有新喋呤单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白(γ-球蛋白(BGG))的荧光微球；硝酸纤维素膜上设有T线7和C线8，两条线相互平行，T线靠近加样孔端，其上包被新喋呤抗原复合物；C线远离加样孔端，其上包被链霉亲和素。

进一步的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100～1000nm。

上述新喋呤时间分辨荧光免疫试纸条的制备及使用如下：

1.试纸条各成分的准备

11质控微球的制备

生物素标记γ-球蛋白(BGG)包被的质控微球的制备

(1)生物素标记的BGG的制备

用0.1M NaCNBH₃将BGG(购自Pel-Freez Biological)配制成10mg/ml溶液，采用DMSO(二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商：SIGMA，产品号：B3295)溶液至16.172mg/ml，按照1mgBGG蛋白加入5.4ulBiotin-X-X-NHS的量将Biotin-X-X-NHS液加入到BGG溶液中，混合均匀并在4℃下放置过夜。采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记蛋白透析缓冲液(0.1M Tris，0.3M NaCl，0.005M EDTA-Na-2H₂O，pH 8.0)。透析完毕，BCA法测定蛋白浓度。

(2)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球

向10mg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6.4μl20％的Tween-20溶液、2mg上述(1)中透析得到的生物素标记蛋白以及16μl的NaCNBH₃(25mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0.1M pH6.0MES至总体积为400μl，37°避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液(75mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250μl BSA(200mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4℃13000g离心30分钟。弃上清，用1ml pH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1ml 0.05M pH8.0的HEPES缓冲液(50mMHEPES，300mM NaCl，25mM EDTA-Na-2H₂O，1.6％BSA，0.1％Dextran，0.1％Tween-20，0.3745％TritonX-405，0.01％庆大霉素，0.05％Proclin)悬浮(其终浓度为10mg/ml)。

(3)质控微球工作液配制

根据工作需要，采用0.05M pH8.0的HEPES缓冲液将(2)中悬液稀释到相应浓度，分装保存。

1.2检测微球的制备

向10mg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6.4μl 20％的Tween-20溶液、2mg新喋呤单克隆抗体以及16μl的NaCNBH₃(25mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0.1M pH6.0MES至总体积为400μl，37°避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液(75mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250μl BSA(200mg/ml，0.05M pH6.0的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4℃13000g离心30分钟。弃上清，用1ml pH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1ml 0.05M pH8.0的HEPES缓冲液(50mM HEPES，300mM NaCl，25mM EDTA-Na-2H₂O，1.6％BSA，0.1％Dextran，0.1％Tween-20，0.3745％TritonX-405，0.01％庆大霉素，0.05％Proclin)悬浮(其终浓度为10mg/ml)。

1.3微球溶液的配置

用释放缓冲液(含有20％蔗糖、5％海藻糖、0.5％BSA、0.2％庆大霉素)将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0.2mg/ml，检测微球终浓度为1mg/ml。

1.4检测线(T线)溶液的配制

用10mM PB溶液将新喋呤抗原复合物稀释成0.5mg/ml。

1.5质控线(C线)溶液的配制

用10mM PB溶液将链霉亲和素稀释成0.5mg/ml。

2.试纸条的制备

2.1空白大卡粘贴

按照附图1的膜组合方式，硝酸纤维素膜3位于中间，Fusion5膜2与吸水纸4分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。

2.2喷膜

分别在图1中T线7、C线8位置喷上T、C线溶液，C、T线喷膜液量为1μl/cm；在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为4μl/cm。

2.3烘干

将步骤(2)中喷好试剂的新喋呤大卡在恒温烘箱中37℃烘干24小时。

2.4切条

将烘干的新喋呤大卡切割成4mm宽度的纸条，即得到新喋呤试纸条。

3.试纸条的定量检测

3.1绘制标准曲线

在制备好的新喋呤试纸条(批号：20100821)加样区中加入不同浓度的新喋呤抗原标准品(取五个不同的浓度，分别为0、1、5、10、50ng/ml，每个浓度设5个重复)，滴加上样缓冲液(PBS，含有1.6％BSA，0.1％Tween20，防腐剂)，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号，实验结果及分析见表1：

表1新喋呤标准品检测结果

以抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，采用四参数拟合方式，标准曲线数据见表2，标准曲线如图2所示。

表2新喋呤定量检测标准曲线数据

图2的标准曲线R²为0.9999，线性较好，可以通过该标线对样品中所含新喋呤蛋白浓度进行定量分析。

3.2样品检测

在新喋呤试纸条(批号：20100821)的加样区依次加入待测样品，滴加上样缓冲液，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号。根据步骤(1)中的标准曲线计算待测样品中新喋呤抗原浓度。

4.试纸条性能测试

测定2个浓度样本的10次批内差CV，实验结果见表3，实验结果表明，试纸条的批内精密度均小于12％。

表3试纸条批内差

采用此方法制备的新喋呤定量检测试纸条检测范围可达到0～100ng/mL，灵敏度在0.5ng/mL以下，批内精密度可达10％左右，批间精密度可达15％，可同时检测全血、血清、血浆样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素对本检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

Claims

1.一种新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有新喋呤抗原的检测线和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线。

2.如权利要求1所述的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的一端设有微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球。

3.如权利要求2所述的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有新喋呤抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。

4.如权利要求3所述的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。

5.如权利要求1所述的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，检测线和质控线相互平行，其中检测线靠近加样孔端，质控线远离加样孔端。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述的新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，试纸条底部设有塑料底板。