CN111879938A - 一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条及制备方法，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次拼接设于底板之上的样品垫、结合物释放垫、层析膜、吸水垫，结合物释放垫上包被有量子点标记的嘧霉胺抗体复合物。本发明相比与同类抗体的ELISA检测方法，极大的缩短了检测时间，提高了检测效率，并且检测灵敏度更高，对于样品中的嘧霉胺残留，可实现定量检测。

Description

一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条及制备 方法
技术领域
本发明涉及食品安全免疫学检测技术领域，具体而言，涉及一种嘧霉胺残留量子点免疫层析试纸条及制备方法。
背景技术
嘧霉胺(Pyrimethanil)，属于苯胺基嘧啶类广谱杀真菌剂，通过抑制蛋氨酸的生物合成，影响细胞分裂以及蛋白质的形成，从而阻止病菌的侵染，具有根部内吸以及叶片穿透的活性。由于其优异的广谱杀菌特性，嘧霉胺被广泛用于蔬菜、水果以及观赏类植物，用于控制灰霉病等收获后疾病。但是，由于嘧霉胺在园艺物种上的广泛应用，长期研究表明对小鼠、大鼠等水生生物具有潜在的致癌性，加拿大在2018年确定嘧霉胺在西红柿以及洋葱中的最大残留量(MRL)为0.5和0.2mg/kg；欧盟对瓜类蔬菜中嘧霉胺的最大残留限量为0.7mg/kg((EC)No 396/2005)，我国也在谷物、蔬菜、水果以及干制坚果中对其进行了限量(GB 2763—2016)。
目前，用于蔬菜、水果等样品中嘧霉胺残留检测的方法主要是仪器方法和免疫分析方法。仪器分析方法包括气相色谱法，液相色谱法以及色谱-质谱联用技术。这些仪器方法虽然具有准确度高，可重复性并且可以定量的特点，但是需要昂贵的实验仪器、需要技术人员操作并且耗时。免疫分析方法已经报道的包括酶联免疫分析法(ELISA)和胶体金免疫层析法，但是，ELISA方法灵敏度低、步骤繁琐，不适合现场快速筛查；胶体金方法检测虽快，但试纸条受基质干扰大，检出限高，因此建立食品中嘧霉胺残留的高灵敏度快速检测方法具有重要意义。
量子点是一种新型的荧光纳米离子球形半导体材料，无毒无害，并且具有比有机染料优越的荧光特性。量子点通常由元素周期表中的II-VI型(例如CdSe，CdTe，CdS和ZnSe)或III-V型(例如InP和InAs)元素合成，通常用分子覆盖，用于表面功能化，用核、壳覆盖以修饰它们物理性质。例如CN109233836A公开了一种量子点荧光微球及其制备方法，用二氧化硅/硅氧烷涂层或双功能配体修饰制成水溶性量子点，并具有生物相容性。优良的发光性质且易于修饰的特性使得量子点成为新的生物标签，且其应用和性能优于传统的荧光蛋白和有机染料。目前，量子点已被广泛用做荧光标记物，用于检测蛋白以及其他小分子，在农药残留检测中也有广泛应用，但是在嘧霉胺的残留检测中未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于量子点偶联标记物的免疫层析试纸条，该试纸条对嘧霉胺残留灵敏度高，特异性好。本发明的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法。
本发明公开的第一个技术方案是：
一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条，包括底板，以及依次拼接设于底板之上的样品垫、结合物释放垫、层析膜、吸水垫，结合物释放垫上包被有量子点标记的嘧霉胺抗体复合物。
进一步的，所述量子点为量子点荧光微球，该量子点荧微球是以NHS活化后的CdTe/ZnSe为核、二氧化硅为壳包裹的核-壳型纳米复合粒子；并且所述量子点表面连接有活性基团的核壳结构量子点，所述活性基团为-COOH。
进一步的，所述抗嘧霉胺抗体为抗嘧霉胺单克隆抗体、抗嘧霉胺多克隆抗体、人源细胞表达的抗嘧霉胺重组抗体其中之一。
进一步的，所述羧基化的核壳结构量子点与抗嘧霉胺单克隆抗体通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀亚酰胺)交联制备，抗嘧霉胺单克隆抗体：EDC：NHS的比例为18:1:18:12。
进一步的，所述层析膜上包被设置有与底板端面平行的检测线和质控线，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫；检测线包被有嘧霉胺完全抗原，该嘧霉胺完全抗原为0.9mg/mL的嘧霉胺-载体蛋白偶联物；所述质控线包被有羊抗鼠抗体，或兔抗鼠抗体。
本发明另一个目的，在于提供制备上述免疫层析试纸条的方法，包括a、样品垫的制备，将所述样本垫采用样本处理液浸泡处理，烘干；b、将所述羧基化的核壳结构量子点与抗嘧霉胺单克隆抗体通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀亚酰胺)交联制备，后经缓冲液适当稀释后以4μL/cm的密度均匀喷在预处理的结合物释放垫的玻璃纤维膜上；c、使用抗体包被缓冲液将嘧霉胺完全抗原包被到层析膜的检测线上，使用羊抗鼠多克隆抗体或兔抗鼠多克隆抗体稀释后包被到质控线上；d、在所述底板上依次相互交错地压覆样本垫、结合物释放垫、层析膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。
进一步的，所述层析膜为硝酸纤维膜，所述检测线表面包被有0.9mg/mL的嘧霉胺竞争抗原，所述质控线包被有0.4mg/mL羊抗鼠二抗IgG。
进一步的，所述嘧霉胺完全抗原通过嘧霉胺与蛋白载体偶联，并用浓度为0.9mg/mLPBS溶液调节嘧霉胺完全抗原包被物；所述蛋白载体包括牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，兔血清白蛋白(RSA)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白(TG)任意其中之一。
进一步的，样品垫压覆在结合物释放垫边缘2～3mm；结合物释放垫压覆在层析膜边缘2～3mm；吸水垫压覆在层析膜边缘2～3mm，质控线与检测线之间相距5mm，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫，切割成3-4mm宽的量子点检测试纸条，干燥保存备用。
进一步的，样品垫材质为玻璃纤维膜，使用前经含1％BSA，1％蔗糖，0.1％PEG，0.05％吐温-20的PBS缓冲液，浸泡1小时后烘干备用。
本试纸条基于竞争法原理实现检测，当待测溶液中含有嘧霉胺时，量子点标记的荧光探针会与嘧霉胺结合，从而竞争结合到检测线上的抗体，使检测线不显色，随着待测溶液中的嘧霉胺浓度降低，检测线会逐渐显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。所述量子点是一种新型的荧光纳米离子半导体材料。具有宽激发谱，窄发射谱，荧光量子效率高和光化学稳定性强的特点。通过与羧基等官能团结合，从而实现水溶性和生物相容性。
本发明提供的一种基于量子点荧光微球的嘧霉胺残留免疫层析试纸条，相比与同类抗体的ELISA检测方法，极大的缩短了检测时间，提高了检测效率，并且检测灵敏度更高，对于样品中的嘧霉胺残留，可实现定量检测。采用量子点荧光微球，易于与生物分子偶联，是一种新型的快速诊断检测标记物，荧光强度高，稳定性强，故检测具有更高的灵敏度，便于对谷物、蔬菜、水果以及干制坚果中的嘧霉胺残留快速检测，与免疫层析技术结合制备成条状结构，轻便易携，无需复杂设备，十分适用于现场筛查及床旁检测。
本发明通过大量的文献调研和实验研究，优化量子点复合物，通过均匀喷在预处理的结合物释放垫的玻璃纤维膜上，使得样本垫上量子点标记检测抗体能够充分释放，同时保护了量子点标记检测抗体的稳定性，从而提高了检测试纸的准确度和灵敏度。
附图说明
图1为快速检测嘧霉胺残留量子点荧光免疫层析试纸条结构示意图；
图2为本发明快速检测试纸条结果判定图；
图3为本发明的量子点荧光免疫层析试纸条对嘧霉胺的检测标准曲线。
具体实施方式
通过下面的实施例对本发明作进一步说明，结合附图可以进一步理解本发明的优点和特点，但不限制本发明的范围。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条，本实施例试纸条结构如图1所示，包括底板，以及依次拼接设于底板之上的样品垫6、结合物释放垫5、层析膜2、吸水垫1；结合物释放垫5上包被有量子点标记的嘧霉胺抗体复合物。所述层析膜2上包被设置有与底板端面平行的检测线4和质控线3，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫。
所述量子点为量子点荧光微球，该量子点荧微球是以NHS活化后的CdTe/ZnSe为核、二氧化硅为壳包裹的核-壳型纳米复合粒子；并且所述量子点表面连接有活性基团的核壳结构量子点，所述活性基团为-COOH。所述羧基化的核壳结构量子点与抗嘧霉胺单克隆抗体通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀亚酰胺)交联制备，抗嘧霉胺单克隆抗体：EDC：NHS的比例为18:1:18:12。
所述抗嘧霉胺抗体为抗嘧霉胺单克隆抗体、抗嘧霉胺多克隆抗体或人源细胞表达的抗嘧霉胺重组抗体任意之一。本实施例采用抗嘧霉胺单克隆抗体，通过腹水诱生方法制备。
检测线包被有嘧霉胺完全抗原，该嘧霉胺完全抗原为0.9mg/mL的嘧霉胺-载体蛋白偶联物；所述质控线包被有羊抗鼠IgG多抗，或兔抗鼠IgG多抗，本实施例质控线包被有羊抗鼠二抗，浓度为0.4mg/mL。
本试纸条(a)可根据目标检测物而针对性提供多种复合物，每种复合物都对目标分析物都具有特异性，具体为所述抗嘧霉胺抗体采用抗嘧霉胺单克隆抗体、抗嘧霉胺多克隆抗体、人源细胞表达的抗嘧霉胺重组抗体任意一种。(b)试纸条在空间上布置多个捕获区域，所述捕获区域设置在层析膜，层析膜上设有检测线、质控线，结合物释放垫上形成结合线。所述检每个捕获区域固定有对目标分析物具有特异性的捕获试剂，检测线(Test Line，T线)包被有嘧霉胺-载体蛋白偶联物(嘧霉胺完全抗原)，所述质控线(Control Line，C线)，包被有羊抗鼠IgG(或兔抗鼠抗体)，结合物释放垫的结合线上喷涂有量子点标记的嘧霉胺单克隆抗体。(c)将样品滴加到样品垫，根据层析流动依次与捕获区域的捕获试剂反应；(d)未结合的结合物会经过层析去除。
本试纸条基于竞争法原理实现检测，当待测溶液中含有嘧霉胺时，量子点标记的荧光探针会与嘧霉胺结合，从而竞争结合到检测线上的抗体，使检测线不显色，随着待测溶液中的嘧霉胺浓度降低，检测线会逐渐显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。所述量子点是一种新型的荧光纳米离子半导体材料。具有宽激发谱，窄发射谱，荧光量子效率高和光化学稳定性强的特点。通过与羧基等官能团结合，从而实现水溶性和生物相容性。
实施例2：免疫层析试纸条制备
(1)样品垫的制备，本实施例中，样品垫玻璃纤维膜预处理液为含1％BSA，1％蔗糖，0.1％PEG，0.05％吐温-20的PBS缓冲液，玻璃纤维膜浸泡1小时后烘干备用。
(2)制备结合物释放垫，即量子点标记嘧霉胺单克隆抗体荧光探针，
a、将经过表面羧基修饰的水溶性CdSe/ZnS核壳量子点以12000rpm离心5min,b用20mM Tris缓冲液复溶，加入活化试剂EDC((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)至1.4mg/mL，N-羟基琥珀亚酰胺至2mg/mL。c、加入终浓度为40mg/L的抗嘧霉胺单克隆抗体，室温下搅拌3h，反应后，12000rpm离心5min，得到沉淀，将沉淀用含0.5％BSA和EDTA-Na2的20mM Tris缓冲液中适当稀释；d、后以4μL/cm的密度均匀喷在预处理的玻璃纤维膜上，得到量子点标记嘧霉胺单克隆抗体标记垫，37℃干燥24h，密封备用。
(3)层析膜制备
层析膜上包被设置有与底板端面平行的检测线4(T)和质控线3(C)；所述层析膜为硝酸纤维膜，所述检测线表面包被有0.9mg/mL的嘧霉胺竞争抗原，所述质控线包被有0.4mg/mL羊抗鼠二抗IgG。
所述检测线包被有嘧霉胺完全抗原，该嘧霉胺完全抗原通过嘧霉胺与蛋白载体偶联，并用浓度为0.9mg/mLPBS溶液调节嘧霉胺完全抗原包被物；所述蛋白载体包括牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，兔血清白蛋白(RSA)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白(TG)任意其中之一，本实施案例优选为钥孔血蓝蛋白(KLH)。
(4)、在所述底板上依次相互交错地压覆样本垫、结合物释放垫、层析膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。样品垫压覆在结合物释放垫边缘2～3mm；结合物释放垫压覆在层析膜边缘2～3mm；吸水垫压覆在层析膜边缘2～3mm，质控线与检测线之间相距5mm，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫，切割成3-4mm宽的量子点检测试纸条，干燥保存备用。
本发明技术方案的第三方面，提供了第一方面所述复合物在定量或定性检测检测嘧霉胺中的应用。其具体检测方法如下：(a)在固体支持物上提供有一系列嘧霉胺浓度的样品；(b)将所述样品经过层析作用于量子点-嘧霉胺单克隆抗体复合物混合；(c)待样品与量子点-单克隆抗体形成的复合物进一步经过检测线和质控线(d)除去任何未结合的结合物；(e)通过监测由复合物中量子点介导的光谱发射来检测复合物是否存在，通过荧光强度来判断样品中嘧霉胺是否存在，并通过计算，建立抑制率和嘧霉胺浓度之间的对数抑制曲线。
具体实施例中，所述嘧霉胺标准品浓度为0.390625,0.78125,1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50μg/L。
本发明技术方案的第四方面，提供了基于量子点的免疫荧光试纸条，可用于检测样品中的嘧霉胺残留。
具体实施例中，所述样品选自蔬菜或水果。
具体实施例中，所述蔬菜或水果样品选自白菜、黄瓜、西红柿中的一种，视技术领域需求而选择。
实施例3：样本测试及结果判断
(1)样本处理
选择蔬菜或水果样品白菜、黄瓜、西红柿中的一种，样本的处理参照(Yi Cao,Haixing Shi,Tao Le,Ran Tang&Yong Xie(2019)Development a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for screening pyrimethanil in fruitsand vegetables,Food and Agricultural Immunology,30:1,548-563,DOI:10.1080/09540105.2019.1608160)的方法。首先，将样本切碎并均质，称取5g均质后的样本于50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL乙睛，震荡均匀。随后加入2g Nacl，4g无水硫酸镁。将混合物10000rpm离心5min,将上清用氮吹仪进行浓缩，最后用PBS缓冲液定溶至1mL。每次测试时，取50μL的样品提取液，滴加到样品垫上。
图2出示了本发明检测嘧霉胺残留量子点荧光免疫层析试纸条样本测试结果的结果判定图。
(2)结果判断
加入待测样本15min后，若检测线和质控线在紫外照射下均有荧光条带出现，则判定为嘧霉胺残留阴性；若检测线无荧光条带，而质控线有荧光条带，则判定嘧霉胺残留阳性；若质控线无荧光条带，无论检测线是否有荧光条带，判定试纸条无效。
(3)标准曲线
用含10％甲醇的PBS缓冲液梯度稀释嘧霉胺标准品，至终浓度为0.390625,0.78125,1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50μg/L，每个浓度设三个平行重复，将不同浓度样品分别滴加到本发明的量子点荧光免疫层析试纸条上，15min后，使用手持式荧光读数仪对试纸条的C、T线的荧光强度进行记录，设定标准品浓度为0的情况下T线测量值为FT，C线测量值为FC，且此时的FT/FC值为B0，其它浓度测量的荧光强度FT/FC值为B，以加标的嘧霉胺的浓度为横坐标，(1-B/B0)×100％值作为纵坐标作图，绘制量子点试纸条的对数抑制浓度曲线，得到的标准曲线如图3所示，半数抑制浓度为4.98μg/L，最低检测限为1.86μg/L。
(4)回收率测定
将嘧霉胺标准品添加到上述蔬菜或水果样品白菜、黄瓜、西红柿样品中，至终浓度分别为12.5、25、50μg/kg,样品提取步骤按照实施例3中的步骤进行，取样品提取液滴加到本发明的试纸条样本垫上，15min后，用手持式荧光读数仪测定试纸条的B/B0的值，计算变异系数及添加回收率。结果见表1。
表1添加回收实验结果
添加浓度(μg/kg) 回收率 变异系数
12.5 84％ 4.5％
25 92％ 2.3％
50 98％ 3.6％
本发明得到的检测嘧霉胺残留量子点试纸条具有较高的灵敏度，且所配套的嘧霉胺残留检测试剂盒可以用来检测蔬菜或水果样品白菜、黄瓜、西红柿中的一种，灵敏度高，线性范围广，并且具有简单快速的优点。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围以权利要求所限定的范围为准，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内做出的若干改进和润饰，也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速检测嘧霉胺残留的量子点免疫层析试纸条，包括底板，以及依次拼接设于底板之上的样品垫(6)、结合物释放垫(5)、层析膜(2)、吸水垫(1)；其特征在于，结合物释放垫(5)上包被有量子点标记的嘧霉胺抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的量子点免疫层析试纸条，其特征在于，所述量子点为量子点荧光微球，该量子点荧微球是以NHS活化后的CdTe/ZnSe为核、二氧化硅为壳包裹的核-壳型纳米复合粒子；并且所述量子点表面连接有活性基团的核壳结构量子点，所述活性基团为-COOH。
3.根据权利要求1所述的量子点免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗嘧霉胺抗体为抗嘧霉胺单克隆抗体、抗嘧霉胺多克隆抗体、人源细胞表达的抗嘧霉胺重组抗体其中之一。
4.根据权利要求2或3所述的量子点免疫层析试纸条，其特征在于，所述羧基化的核壳结构量子点与抗嘧霉胺单克隆抗体通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀亚酰胺)交联制备，抗嘧霉胺单克隆抗体：EDC：NHS的比例为18:1:18:12。
5.根据权利要求1所述的量子点免疫层析试纸条，其特征在于，所述层析膜(2)上包被设置有与底板端面平行的检测线(4)和质控线(3)，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫；检测线包被有嘧霉胺完全抗原，该嘧霉胺完全抗原为0.9mg/mL的嘧霉胺-载体蛋白偶联物；所述质控线包被有羊抗鼠抗体，或兔抗鼠抗体。
6.制备权利要求1-5任意之一所述免疫层析试纸条的方法，其特征在于，a、样品垫的制备，将所述样本垫采用样本处理液浸泡处理，烘干；
b、将所述羧基化的核壳结构量子点与抗嘧霉胺单克隆抗体通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀亚酰胺)交联制备，后经缓冲液适当稀释后以4μL/cm的密度均匀喷在预处理的结合物释放垫的玻璃纤维膜上；
c、使用抗体包被缓冲液将嘧霉胺完全抗原包被到层析膜的检测线上，使用羊抗鼠多克隆抗体或兔抗鼠多克隆抗体稀释后包被到质控线上；
d、在所述底板上依次相互交错地压覆样本垫、结合物释放垫、层析膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述层析膜为硝酸纤维膜，所述检测线表面包被有0.9mg/mL的嘧霉胺竞争抗原，所述质控线包被有0.4mg/mL羊抗鼠二抗IgG。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述嘧霉胺完全抗原通过嘧霉胺与蛋白载体偶联，并用浓度为0.9mg/mLPBS溶液调节嘧霉胺完全抗原包被物；所述蛋白载体包括牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，兔血清白蛋白(RSA)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白(TG)任意其中之一。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，样品垫压覆在结合物释放垫边缘2～3mm；结合物释放垫压覆在层析膜边缘2～3mm；吸水垫压覆在层析膜边缘2～3mm，质控线与检测线之间相距5mm，检测线靠近样品垫，质控线靠近吸水垫，切割成3-4mm宽的量子点检测试纸条，干燥保存备用。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，样品垫材质为玻璃纤维膜，使用前经含1％BSA，1％蔗糖，0.1％PEG，0.05％吐温-20的PBS缓冲液，浸泡1小时后烘干备用。
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