CN106771143A - 基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌抗原免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌抗原免疫层析试纸条的制备方法；鉴于Ⅱ型疏水蛋白能够定向固定外源生物分子，使喷在试纸条硝酸纤维素膜上的抗体能够定向排列，抗体的“Fab”端充分暴露，抗体活性位点利用率提高，检测灵敏度加强，抗体用量减少，检测成本降低，我们利用这种疏水蛋白修饰硝酸纤维素膜，制备一种新型的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的免疫层析试纸条，本发明的试纸条含有一个样品垫，两个结合垫，用疏水蛋白修饰检测线同时带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜，吸收垫，底板。然后将样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上进行组装，是一种适用于肿瘤标志物检测的新技术。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学检测领域，更具体的是涉及一种Ⅱ型疏水蛋白高效固定喷在试纸条检测线上的抗体，减少检测线抗体用量的新型量子点免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
随着经济的发展，社会的进步，人民生活水平的提高，行为生活方式的改变和人口老龄化等原因，人们的死因谱已经发生了很大的变化，其中，恶性肿瘤导致的年死亡人数每年都在增长，逐渐成为居民死亡的主要原因，因此，肿瘤的早期诊断和治疗已经成为近些年来的研究热点。
试纸条技术是一种操作简单，无需专业培训，方便快捷，结果直观的免疫学检测技术，在现代POCT(point of care testing)中占有重要地位。目前已有的试纸条技术已经比较成熟，在诊断领域得到迅速推广。其中，对于血清肿瘤标志物的检测，可以对恶性肿瘤的诊断、病情发展与疗效等进行判断，在医学检测领域具有很高的临床应用价值。但目前，试纸条的检测灵敏度受到越来越多的研究者的关注，通常情况下，为提高灵敏度可能改变对探针纳米粒子的选择，比如带有颜色的纳米颗粒，发光纳米颗粒，磁性纳米颗粒，以及加大抗体用量，尤其体现在试纸条的检测线上的抗体用量，这样不仅加大了检测成本，往往也达不到我们预期的检测要求。在此过程中，检测效果不理想不是因为抗体自身变性失活，而是检测线处抗体杂乱无定向的排列导致抗原决定簇所在的“Fab”端不能充分暴露，抗体的抗原决定簇表位利用率降低，导致捕获抗原能力降低，因此如何提高检测灵敏度，加强抗体固定效率，降低检测成本成为目前试纸条技术遇到的一个重大挑战。
Ⅱ型疏水蛋白(HFBI)是毕赤酵母产生的小分子量蛋白质，它的最大特点是能够在界面形成一层双亲性的蛋白膜进而来反转所覆盖界面的性质，即使亲水界面疏水能力增强，疏水界面亲水能力增强，除此之外，可以用来固定外源生物分子，并且能够使外源生物分子定向排列。所以本发明在于借助这种疏水蛋白先来修饰试纸条硝酸纤维素膜的检测线区域然后在此区域喷上抗体，使与蛋白膜接触的抗体能够定向保持“直立”，“Fab”端充分暴露，提高抗体利用率，使检测线上低浓度抗体用量同样可以达到理想的检测灵敏度，拟研制一种用量子点标记抗体作为检测探针和双抗体夹心免疫层析法检测前列腺癌抗原模式，制备一种新型的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的新技术。
发明内容
鉴于Ⅱ型疏水蛋白能够定向固定外源生物分子，使喷在试纸条硝酸纤维素膜上的抗体能够定向排列，抗体的“Fab”端充分暴露，抗体活性位点利用率提高，检测灵敏度加强，抗体用量减少，检测成本降低的这些优势，我们利用这种疏水蛋白修饰硝酸纤维素膜，制备一种新型的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的免疫层析试纸条，本发明的试纸条含有一个样品垫，两个结合垫，用疏水蛋白修饰检测线同时带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜，吸收垫，底板。然后将样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上进行组装，是一种适用于肿瘤标志物检测的新技术。
本发明的技术方法如下：
一种基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条，包含有一个样品垫，两个结合垫，用疏水蛋白修饰检测线同时带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜，吸收垫和底板；将样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上。
本发明的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法，步骤如下：
1)量子点免疫探针的制备：将水溶性量子点，前列腺癌的标记抗体，EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶解于硼酸缓冲液，室温悬培，活化量子点的羧基，离心，加入同等量抗体重复上述过程一遍，最后偶联上抗体的量子点用BSA封闭过夜；
2)借助疏水蛋白固定抗体的新型试纸条的组装：在硝酸纤维素膜上先借助疏水蛋白固定外来抗体，先用划线仪喷一层疏水蛋白，调节抗体稀释液的pH，在这层疏水蛋白上再喷包被抗体，重叠区域作为试纸条的检测线；最后将样品垫、两个结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、依次组装在一起，得到基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌抗原新型免疫层析试纸条；
3)用量子点免疫荧光分析仪读出检测信号：组装好的试纸条放在一个塑料底板里，在塑料底板的样品池里滴加系列浓度的抗原，反应后放入量子点免疫荧光分析仪中进行信号读出，其中检测线和质控线的比值作为检测信号；
4)计算不同浓度包被抗体借助蛋白和不借助蛋白固定前后检测灵敏度和检测限。
所述步骤1)中，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000-10000。
所述步骤1)中，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16-50。
所述步骤1)中，量子点偶联抗体悬培1.5～2h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次。
所述步骤1)中，BSA封闭液质量浓度为1％～3％。
所述步骤2)中，样品垫和结合垫，结合垫和结合垫之间的重叠区域的长度约为2mm，样品垫和结合垫的处理液是蔗糖、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯Tween-20的混合溶液。
所述步骤2)中，疏水蛋白的用量为20μg/ml‐50ug/ml。
所述步骤2)中，抗体稀释液的pH调节区间设置为7.4～10.25。
所述步骤3)中，抗原系列浓度选择为：0-12ng/ml；建立标准曲线。
本发明制备的新型的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的优势在于：
1.提高抗体活性，使抗体的“Fab”端充分暴露，捕获抗原能力提高。
2.检测灵敏度提高。
3.减少检测线抗体使用含量，降低检测成本。
附图说明
图1试纸条组装的示意图；
图2量子点免疫荧光分析检测仪照片；
图3本发明制备的不用疏水蛋白固定检测线抗体的硝酸纤维素膜扫描图；
图4本发明制备的用疏水蛋白固定检测线抗体的硝酸纤维素膜扫描图；
图5不同浓度包被抗体加蛋白固定和不加蛋白固定的检测灵敏度比较图；
图6本发明制备的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌抗原(PSA)免疫层析试纸条和普通不加蛋白固定的检测标准曲线。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
量子点免疫探针的制备：将水溶性量子点，前列腺癌的标记抗体，EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶解于硼酸缓冲液，室温悬培，活化量子点的羧基，离心，加入同等量抗体重复上述过程一遍，最后偶联上抗体的量子点用BSA封闭过夜。
借助疏水蛋白固定抗体的新型试纸条的组装：普通的试纸条是由样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫组成，本发明的试纸条其从左到右紧密相联的是叠放在一起的样品垫和结合垫，为了使抗原和量子点标记的抗体充分结合，如图1所示，本技术发明中样品垫的数量为两个，与传统免疫层析试纸条不同，本专利发明的新型试纸条检测技术借助了疏水蛋白可以高效固定外来抗体的优势，在硝酸纤维素膜上先用划线仪喷一层疏水蛋白，由于疏水蛋白固定外来生物分子的能力与外来分子所处环境的PH有关，调节抗体稀释液的PH，然后在这层疏水蛋白上再喷包被抗体，重叠区域作为试纸条的检测线，以此来提高抗体利用率，降低抗体用量，减少成本，为更加直观反映本发明的优势和可信度，我们对不用疏水蛋白修饰的不同浓度抗体的检测线区域和用疏水蛋白修饰的不同浓度的抗体的检测线区域做了扫描分析，当不同浓度的抗体喷在硝酸纤维素膜上，用疏水蛋白修饰过的硝酸纤维素膜没有不用疏水蛋白修饰的硝酸纤维素膜先变得光滑平整，这也正体现了这种疏水蛋白的作用，即当疏水蛋白喷在硝酸纤维素膜上，会在硝酸纤维素表面形成一层很薄的蛋白膜，这层蛋白膜可以粘附抗体，当抗体落在硝酸纤维素膜的孔壁上时，如果没有这层蛋白膜，抗体会顺势落下，最初的抗体会落在洞底，随着抗体浓度的加大，抗体层层堆积，硝酸纤维素表面会被逐渐填平，如图3所示；但是当有这层蛋白膜时，因为蛋白膜的粘附功能，落在硝酸纤维素表面孔壁上的抗体也会被粘附在孔壁上而不是直接顺势落在底部，只有抗体用量达到一定浓度后，硝酸纤维素的表面才会被填平，如图4所示。
用量子点免疫荧光分析仪读出检测信号：如图2所示，上面组装好的试纸条放在一个塑料底板里，在塑料底板的样品池里滴加一定的抗原，反应一段时间后放入量子点免疫荧光分析仪中进行信号读出，其中检测线和质控线的比值作为检测信号。
比较不同浓度(由低到高)包被抗体借助蛋白和不借助蛋白固定前后检测灵敏度的改变，如图5所示；同时比较低浓度抗体(0.2mg/ml)加蛋白固定和不加蛋白固定的检测限。如图6所示。
本发明的实施过程步骤如下：
所述的制备方法，其特征在于借助疏水蛋白固定抗体，提高抗体利用率和检测灵敏度，减少抗体用量，降低检测成本。
1)首先配制0.01Mol/L的pH＝8.0～8.5的硼酸盐缓冲液。
2)精确称取定量的EDC，用移液枪取定量的量子点溶液和前列腺癌标记抗体溶液溶于250μl步骤1)配置的溶液于2ml的EP管中，锡纸包裹EP管，尽量保持量子点的荧光强度，将包裹好的EP管放在旋转培养器上，调制旋转培养器转速约50r/min，室温旋转1.5h。然后将上述液体转入1.5ml的尖头EP管，充分收集沉淀物，转速设定12000r/min，离心30min，取上清再次离心，加大转速，转速调制为15000r/min，离心30min，沉淀用约100μl的硼酸溶液溶解，第二次离心后将第一此沉淀和第二次沉淀混合，上清取出再次离心，继续加大转速，将其调制为18000r/min，离心30min后上清弃掉，将三次沉淀混合，加入硼酸缓冲液，精确称取与第一次相同的EDC，加入与第一次等量的抗体重复上述步骤，即加大抗体偶联量，最后将三次沉淀于1.5ml的EP管中用80μl的1％～3％的BSA溶液与4℃冰箱封闭过夜。
3)配置20μg/ml～50μg/ml的疏水蛋白溶液用划线仪喷在试纸条的硝酸纤维素膜上，用K2CO3溶液调节0.01M的PBS缓冲液使PH＝10.0～10.3，用该缓冲液稀释抗体，将稀释后的抗体喷在疏水蛋白上，此重叠区域做为检测线，将1mg/ml的羊抗鼠抗体溶液喷在检测线的上方，距离检测线约8mm处作为质控线，检测线和质控线喷好后放入37℃烘箱烘1.5～2h。
4)切割玻璃纤维素膜宽度约为1.7cm，浸没在含有0.5％Tween-20的0.01M的PH＝7.4的Tris-HCl缓冲液作为样品垫的处理液，浸润10～15min后，放入37℃烘箱烘1.5～2h；切割玻璃纤维素膜宽度约为5mm，浸没在含有5％蔗糖、5％PVP10000、2％Tween-20、3％BSA的0.01M的PH＝7.4的PBS缓冲液作为结合垫的处理液，浸润10～15min后，放入37℃烘箱烘1.5～2h。
5)配置5％蔗糖、5％BSA、0.1％Tween-20、1％PEG4000的0.01M的PH＝7.4的PBS缓冲液作为偶联抗体的量子点探针的稀释液，将量子点探针稀释10倍，按1cm结合垫需要稀释液15μl的稀释液，将稀释液均匀滴加在上述处理好的结合垫上，浸润10～15min，同样37℃烘箱烘1.5～2h。将处理好的样品垫，结合垫依次粘贴在试纸条上，装入用公司定制的塑料底板进行组装。
6)用移液枪取45μl的不同浓度的抗原滴加到组装好的塑料底板的样品池里，反应15～20min后，放到量子点免疫荧光分析仪进行精确读数。
以上反应为制备基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的一般步骤，在实施例中不作详述。
实施案例1：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝7.4的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和质控线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.154。
实施案例2：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝8的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.165。
实施案例3：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝9的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.192。
实施案例4：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.223。
实施案例5：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10.25的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.219。
实施案例6：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:8000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.215。
实施案例7：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:10000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.205。
实施案例8：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：30，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.210。
实施案例9：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：50，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.209。
实施案例10：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为2％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.203。
实施案例11：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将50μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为3％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.200。
实施案例12：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将30μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.212。
实施案例13：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将20μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝10的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和控制线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.203。
实施案例14：
基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法；将0μg/ml的疏水蛋白喷于硝酸纤维素膜的检测线位置，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16，BSA封闭液用量为1％，用PH＝7.4的0.01M的PBS缓冲液稀释PSA的包被抗体浓度为0.2mg/ml喷到疏水蛋白层上，它们的重叠区域作为检测线区域，滴加浓度为5ng/ml的标准抗原45μl于样品池，做三个重复，反应15min后，用量子点免疫荧光分析仪读出检测线和质控线的示数即T值和C值，得到的检测信号T/C强度平均值为0.042。
Claims (10)
1.一种基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条，包含有一个样品垫，两个结合垫，用疏水蛋白修饰检测线同时带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜，吸收垫和底板；将样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上。
2.权利要求1的基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌免疫层析试纸条的制备方法，其特征是步骤如下：
1)量子点免疫探针的制备：将水溶性量子点，前列腺癌的标记抗体，EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶解于硼酸缓冲液，室温悬培，活化量子点的羧基，离心，加入同等量抗体重复上述过程一遍，最后偶联上抗体的量子点用BSA封闭过夜；
2)借助疏水蛋白固定抗体的新型试纸条的组装：在硝酸纤维素膜上先借助疏水蛋白固定外来抗体，先用划线仪喷一层疏水蛋白，调节抗体稀释液的pH，在这层疏水蛋白上再喷包被抗体，重叠区域作为试纸条的检测线；最后将样品垫、两个结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、依次组装在一起，得到基于疏水蛋白高效固定低浓度抗体的前列腺癌抗原新型免疫层析试纸条；
3)用量子点免疫荧光分析仪读出检测信号：组装好的试纸条放在一个塑料底板里，在塑料底板的样品池里滴加系列浓度的抗原，反应后放入量子点免疫荧光分析仪中进行信号读出，其中检测线和质控线的比值作为检测信号；
4)计算不同浓度包被抗体借助蛋白和不借助蛋白固定前后检测灵敏度和检测限。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中，量子点和EDC用量的质量分数配比是1:4000-10000。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中，量子点和抗体用量的质量分数配比是1：16-50。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中，量子点偶联抗体悬培1.5～2h后，离心，洗涤，洗涤次数至少三次。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中，BSA封闭液质量浓度为1％～3％。
7.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤2)中，样品垫和结合垫，结合垫和结合垫之间的重叠区域的长度约为2mm，样品垫和结合垫的处理液是蔗糖、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯Tween-20的混合溶液。
8.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤2)中，疏水蛋白的用量为20μg/ml‐50ug/ml。
9.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤2)中，抗体稀释液的pH调节区间设置为7.4～10.25。
10.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤3)中，抗原系列浓度选择为：0-12ng/ml；建立标准曲线。
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