CN105823885A - 一种超灵敏定量检测c-反应蛋白的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学检测领域，涉及一种运用免疫荧光纳米球的定量检测C‑反应蛋白方法和试剂盒。荧光纳米球上标记上C‑反应蛋白的鼠源单克隆抗体1，试纸条有检测线和质控线，所述检测线固定有C‑反应蛋白的鼠源单克隆抗体2，质控线则固定有羊抗鼠IgG抗体。本发明以荧光纳米球为标记材料，采用免疫层析技术实现C‑反应蛋白的超灵敏定量检测。相比传统的胶体金免疫层析试纸条，标记效果好，能够实现定量检测，并获得更高的检测灵敏度、更小的批内差及批间差，更好的重现性。

Description

一种超灵敏定量检测C-反应蛋白的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及一种超灵敏定量检测C-反应蛋白的方法和试剂盒。
背景技术
C-反应蛋白是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白，被公认为是最有价值的急性时相反应蛋白，自上世纪八十年代以来，C-反应蛋白一直作为炎症和组织损伤的非特异性标志物被广泛用于临床感染性疾病的检测。近年来更多的研究发现，C-反应蛋白在心血管疾病诊断和预测中发挥越大越大的作用，而且它更是一种非特异性的肿瘤标志物，与肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤有着密切关系，得到越来越多的关注。目前，定量检测CRP的方法主要是还是免疫扩散、浊度法或酶联免疫分析法。但是这些方法都存在步骤繁琐，耗时长，检出限高，灵敏度低等问题，不利于临床上快速定量检测。
免疫层析法是快速检测方法里最受瞩目的一种方法，它通常是以硝酸纤维素膜作为层析膜，在毛细作用下使样品溶液在层析膜上流动，样品中的目标物会与层析膜上的待测物的受体（抗体或者抗原）发生特异性的免疫反应。传统的免疫层析法利用胶体金作为标记物，通过判断胶体金的比色信号来进行定性或者半定量检测，因此当检测低浓度的目标物时，胶体金的信号较弱导致误判结果。因此传统的胶体金层析法灵敏度较低。
近年来，出现了很多替代胶体金的荧光标记材料，如染料、上转换材料、量子点等材料，它们很好的解决了金标免疫层析系统中无法定量检测的问题。其中量子点以其优异的荧光性质（荧光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长等）展现出更好的层析性能。然而，由于量子点在复杂体系中不够稳定的缺点，也限制了其广泛应用。基于量子点的荧光纳米球则可以很好的解决这些问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种超灵敏定量检测C-反应蛋白的方法和试纸条。
为实现上述目的，本发明的定量检测C-反应蛋白的方法是：
1、制备免疫荧光纳米球（IFNs）：选择某抗C-反应蛋白的抗体作为标记抗体，与荧光纳米球偶联，并用牛血清白蛋白（BSA）进行封闭，得到免疫荧光纳米球；
2、制备试纸条，试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述的硝酸纤维素膜上有测试线和质控线，所述测试线上包被C-反应蛋白的不同于标记抗体的另一种单克隆抗体，所述质控线上包被标记抗体的抗体。
3、将免疫荧光纳米球和待测样品混合，将混合液滴到试纸条的样品垫上层析，层析液为加了牛血清白蛋白的pH7.4的碱性缓冲液；
4、通过检测试纸条上测试线上的免疫荧光球的荧光强度实现对C-反应蛋白的定量检测。
其中步骤1中，将抗C-反应蛋白的抗体偶联到荧光纳米球表面，具体为：通过EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化法将荧光纳米球和抗C-反应蛋白的抗体偶联。
所述荧光纳米球，表面带有-COOH，是将油溶性的CdSe/ZnS量子点(QDs)包埋到苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球中制备得到。
本发明还提供了一种定量检测C-反应蛋白的试剂盒，包括本发明前述的试纸条、免疫荧光纳米球和层析液，所述免疫荧光纳米球为选择某抗C-反应蛋白的抗体作为标记抗体，与荧光纳米球偶联，并用牛血清白蛋白（BSA）进行封闭得到，层析液为加了1wt%牛血清白蛋白的pH7.4的碱性缓冲液。
荧光纳米球上标记上C-反应蛋白的鼠源单克隆抗体1，试纸条有检测线和质控线，所述检测线固定有C-反应蛋白的鼠源单克隆抗体2，质控线则固定有羊抗鼠IgG抗体。
本发明方法利用免疫荧光球和侧向层析试纸条实现对目标蛋白的快速检测，通过检测荧光球-蛋白-抗体复合物的荧光信号来检测蛋白，步骤极其简单，无需对样品进行预处理或预富集，而且灵敏度高，特异性好。通过复合物的荧光强度检测，得到很好的定量关系，线性范围0.025~1.6mg/L，R2=0.995。整个检测过程非常简单，灵敏度高，特异性强，可以在20min内完成检测。
附图说明
图1为免疫层析所用试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为层析膜，3为吸水纸，4为测试线，5为质控线，6为底板。
图2为荧光纳米球和量子点的荧光强度分别与其浓度的线性关系。
图3为本发明快速定量检测C-反应蛋白实验过程及结果判读图
图4为检测C-反应蛋白的的荧光强度与C-反应蛋白浓度的线性拟合。
图5为检测前列腺特异性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、人血清白蛋白（HSA）以及C-反应蛋白的荧光强度。
图6为实际病人血浆样本的检测结果。
具体实施方式
一、方法
1.荧光纳米球的制备
荧光纳米球（FNs）是本实验室自主制备的。以表面羧基化的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球(Pst-AAm-COOH)为载体，通过超声溶胀的方法，利用疏水相互作用，将疏水的量子点（CdSe/ZnSQDs）包埋到共聚纳米球的疏水空腔内部，从而得到表面带有羧基的FNs。
2.免疫荧光纳米球（IFNs）的制备
取大约2mgFNs分散到0.01MpH6.8PBS中，并加入EDC/NHS使其最终浓度为50mM，活化20min，用0.01MpH7.2PBS离心洗涤一次，然后分散到1mL0.01MpH7.2PBS中，加入5μg的C-反应蛋白的抗体，反应4h，用0.01MpH7.2PBS离心洗涤五次，即得到了对C-反应蛋白靶向的免疫荧光纳米球(IFNS)。最后用BSA封闭后置于4°C冰箱中待用。
3.C-反应蛋白样品的检测
将4μLIFNs（1.57nM）、1μLC-反应蛋白样品与75μL层析液混合均匀，得到一系列C-反应蛋白终浓度为0.025mg/L、0.1mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L的混合溶液。将混合液体加到样品垫上。20min后用倒置荧光显微镜拍检测线区域的图片，并测定检测线的平均荧光强度。
4.定量检测曲线
将不同浓度的C-反应蛋白，按照3描述的步骤进行检测，并测定每个样品检测区域的平均荧光强度，绘制C-反应蛋白浓度与荧光强度关系曲线并拟合。
5.特异性实验
采用前列腺特异性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、人血清白蛋白（HSA）作为对照组。分别按照步骤3进行实验。
6.重复性
将浓度为0.025mg/L、0.4mg/L和1.6mg/L的C-反应蛋白，用同一批按步骤2制备的IFNS进行检测，按照步骤2重复实验3次，记录每次检测结果的荧光值，计算批次内相对标准偏差Intra-assayCV。同时，用3种不同批次制备的IFNS对上述样品进行检测，记录检测结果的荧光值，计算批次间相对标准偏差Inter-assayCV。
7.实际病例样本检测
将健康人、肺癌患者的血浆样本，按照步骤3对其进行检测。并用标准曲线计算病人体内的C-反应蛋白浓度。
二、结果
1.荧光纳米球的表征
对比纳米球和荧光纳米球的透射电镜可以看出QDs很好地分散在共聚纳米球里。FNs的粒径统计和水合粒径表明FNs分散性很好，而且粒径均一。FNs的荧光显微镜和荧光光谱表明FNs具有优良的荧光性质。而FNs和QDs的同浓度时的荧光光谱可以看出，FNs具有超强的荧光强度。由FNs和QDs的荧光强度与各自浓度关系曲线（图2）可以看出，对比两个曲线的斜率，一颗荧光纳米球的荧光强度是一颗量子定的380倍。
2.C-反应蛋白的检测
检测C-反应蛋白的原理图见图1所示：将免疫荧光球、样本以及层析液混匀后，加载到样品垫上。在毛细作用下，免疫荧光纳米球和C-反应蛋白的复合物被测试带捕获，未结合蛋白的免疫荧光球则继续流动，被控制带捕获。如图3所示对检测结果进行定性检测。如图4所示，C-反应蛋白浓度在0.025~1.6mg/L浓度范围内该方法呈现很好的定量关系（R2=0.995）最低检出限为0.016mg/L。
3.特异性
分别用前列腺特异性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、人血清白蛋白（HSA）来检验改方法的特异性。由图5可以看出，阴阳性结果对比明显。
4.重复性
为了评价该方法的重现性，测定了该方法的批内相对标准偏差（Intra-assayCV）和批间相对标准偏差（Inter-assayCV），计算Intra-assayCV是使用同一批次的IMNS和IFNS进行检测，重复实验5次后计算其相对标准偏差。计算Inter-assayCV是用五种不同批次的IMNS和IFNS对样品进行检测记录荧光强度，计算其相对标准偏差，计算得到Intra-assayCV和Inter-assayCV分别为5.3%和6.6%，表明该法重现性较好，方法可靠。
5.实际病例检测
将健康人以及癌症病人的血浆稀释80倍后用该方法检测，检测结果图6，健康人体内的C-反应蛋白浓度极低，均在正常范围，而肺癌患者体内的C-反应蛋白浓度都明显升高，这与文献报道的肺癌患者体内的C-反应蛋白会明显升高是一致的。该结果也说明此方法有望应用于复杂实际样品。
通过以上各项检测，证明本发明方法可以应用于C-反应蛋白的超灵敏定量的检测，操作简单快速，灵敏度高、检测限可达到0.016mg/L；重复性好而且具有很好的选择性和特异性，常见的PSA、CEA、AFP不干扰检测。

Claims (8)

1.一种量子点的荧光纳米球免疫层析超灵敏定量检测C-反应蛋白的方法，其特征在于，该荧光纳米球是在共聚纳米球里包裹油溶性的CdSe/ZnS荧光量子点，一颗荧光纳米球比一颗量子点的荧光强度高出380倍。
2.根据权利要求1所述的一种免疫层析试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述的硝酸纤维素膜上分别包被了C-反应蛋白的捕获抗体得到测试线；质控线则固定的是抗鼠抗体。
3.根据权利要求1所述的免疫荧光球，其特征在于，通过EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化法将C-反应蛋白的单克隆抗体连接到荧光纳米球上，最后用牛血清白蛋白对偶联了抗体的荧光纳米球进行封闭。
4.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于，底板上顺次搭接样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的测试线和质控线均设在硝酸纤维素膜上。
5.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于，测试线上固定的是C-反应蛋白的不同于标记抗体的另一种单克隆抗体，质控线上固定的是标记抗体的抗体。
6.一种使用如权利1-5所述的免疫层析试纸条检测样品的方法，包括：
(1)将样品、免疫荧光纳米球和层析液混匀后，将混合液体加载到免疫层析试纸条的样品垫上，静置15-20分钟；
(2)通过荧光显微镜读取信号。
7.根据权利6所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述层析液为pH7.4的碱性缓冲液。
8.根据权利7所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述的碱性缓冲液中包含牛血清白蛋白。
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