CN108226509A - 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 - Google Patents
一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108226509A CN108226509A CN201711348563.XA CN201711348563A CN108226509A CN 108226509 A CN108226509 A CN 108226509A CN 201711348563 A CN201711348563 A CN 201711348563A CN 108226509 A CN108226509 A CN 108226509A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- salmonella typhimurium
- quantum dot
- fluorescence
- detection
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发提供了一种鼠伤寒沙门氏菌检测试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及底板。量子点荧光微球上标记了鼠伤寒沙门氏菌的单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被有检测抗体和质控抗体。基于该试纸条本发明还提供了一种高灵敏、快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。该方法充分利用量子点超强且稳定的荧光信号，结合聚合物亚微米球易于标记以及操控的优点，构建了一种量子点荧光微球免疫层析技术，实现了鼠伤寒沙门氏菌的灵敏、快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全快速检测技术领域，具体涉及一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸，该方法可以灵敏快速定量检测食品中鼠伤寒沙门氏菌。
背景技术
食源性病原体一直严重威胁人类的健康和财产安全。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位，中国国家卫计委的公报均显示沙门菌在引起食物中毒的各类致病菌中长年稳居首位，全球食源性疾病监测网(Global Foodborne Infections Network,GFN)估算每年有9,400万非伤寒沙门菌感染者，并引发155,000人死亡，全球每年新发伤寒杆菌感染者则达2,000～3,000万。
传统沙门氏菌等病原微生物的检测方法为琼脂培养法，其主要是依据病原微生物的形态特征和生理性状，进行分离、培养及一系列生化反应，整个过程通常需要两到三天，需要专业的操作人员且步骤繁琐。这对货架寿命较短的食品在产品卫生状况方面的评估作用不大，难以满足食品生产厂家特别是出口厂家的检测期较短的需求。
近年来，不断发展的免疫荧光技术、酶联免疫技术、放射免疫技术等免疫学方法已逐步应用于沙门氏菌等病原微生物的检测，但仍存在操作繁琐，灵敏度偏低等问题。且相比传统方法所需仪器设备要求高，在很大程度上限制了这些方法的应用和推广，大大降低了其实用价值。快速试纸条因成本低、操作简单、检测时间短等明显优势，近年来备受关注。它是沙门氏菌等病原微生物快速检测技术的重要研究方向，对有效预防和控制病原微生物类食品安全事件的暴发，减轻病原微生物对人类造成的危害将发挥重要的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸，快速灵敏定量检测食品中鼠伤寒沙门氏菌，以克服现有免疫层析法检测鼠伤寒沙门氏菌灵敏度低的缺点。
本发明第一方面提供了一种鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为鼠伤寒沙门氏菌抗体，所述质控线为羊抗鼠二抗。
本发明第二方面提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，步骤包括：
S1、制备量子点荧光微球：在聚苯乙烯微球中加入水溶性CdSe/ZnS量子点，孵育后离心洗涤除去过量的量子点，然后加入正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷水解，最后与丁二酸酐反应得到表面富含羧基的量子点荧光微球；
S2、制备鼠伤寒沙门氏菌抗体标记的量子点荧光微球：通过交联试剂EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)将鼠伤寒沙门氏菌抗体与步骤S1所得量子点荧光微球偶联，得到免疫量子点荧光微球；
S3、将待测样品离心去上清后与缓冲液和步骤S3所得免疫量子点荧光微球混合均匀，然后将混合液滴加至权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌检测试纸的样品垫上进行层析；
S4、通过在紫外灯照射下观察检测线和控制线上的荧光条带实现鼠伤寒沙门氏菌的定性以及半定量检测，通过读取检测线上的荧光信号实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。
本发明的有益效果是：本发明的基于量子点荧光微球的免疫层析试纸条，充分利用了量子点强且稳定的荧光信号，既能实现目标物的可视化读出，同时可以实现目标物的定量检测。与商品化检测鼠伤寒沙门氏菌的胶体金免疫层析试纸条相比，本发明的基于量子点荧光微球的试纸条能够实现定量检测、高灵敏的检测，对于浓度5×104CFU/mL及以上的鼠伤寒沙门氏菌能够实现准确的检出。无需高要求的仪器设备即可实现鼠伤寒沙门氏菌的定性及定量，灵敏度高、准确度高、重现性好，易于推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于量子点荧光微球的免疫层析法所用试纸条的组装及检测示意图。
图2为量子点的透射电镜图。
图3为量子点荧光微球的透射电镜图。
图4为量子点和量子点荧光微球的荧光光谱度。
图5为量子点荧光微球的荧光显微镜图。
图6为本发明快速检测鼠伤寒沙门氏菌的实验过程及结果判读示意图。
图7为检测不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度实验图。
图8为鼠伤寒沙门氏菌的定量检测标准曲线。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为鼠伤寒沙门氏菌抗体，所述质控线为羊抗鼠二抗。
具体的，所述样品垫搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，所述吸水纸接于硝酸纤维素膜的另一端上表面；所述检测线和质控线之间的间距为9mm。
本发明第二方面提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，步骤包括：
S1、制备量子点荧光微球：在聚苯乙烯微球中加入水溶性CdSe/ZnS量子点，孵育后离心洗涤除去过量的量子点，然后加入正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷水解，最后与丁二酸酐反应得到表面富含羧基的量子点荧光微球；
S2、制备鼠伤寒沙门氏菌抗体标记的量子点荧光微球：通过交联试剂EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)将鼠伤寒沙门氏菌抗体与步骤S1所得量子点荧光微球偶联，得到免疫量子点荧光微球；
S3、将待测样品离心去上清后与缓冲液和步骤S3所得免疫量子点荧光微球混合均匀，然后将混合液滴加至权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌检测试纸的样品垫上进行层析；
S4、通过在紫外灯照射下观察检测线和控制线上的荧光条带实现鼠伤寒沙门氏菌的定性以及半定量检测，通过读取检测线上的荧光信号实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。
本发明制备的量子点荧光微球是以表面富含羧基的苯乙烯微球为载体，通过静电吸附的作用将带正电荷的量子点(CdSe/ZnS)结合到微球的表面，然后通过硅烷化试剂(正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷)水解，在量子点荧光微球表面包覆上一层硅壳，最后通过与丁二酸酐反应，得到表面富含羧基的量子点荧光微球。再将鼠伤寒沙门氏菌的单克隆抗体连接到量子点荧光微球表面，与待测样品混合后滴加到样品垫上层析，通过在紫外灯照射下观察检测线和控制线上的荧光条带实现鼠伤寒沙门氏菌的定性以及半定量检测，利用荧光试纸条读值仪读取检测线上的荧光信号实现定量检测。结果读取方便，检测准确，灵敏度高。
优选的，步骤S1中，每1mL聚苯乙烯微球中加入350～450μL水溶性CdSe/ZnS量子点，20～35℃下孵育1.5～2.5h后离心洗涤除去过量的量子点。
优选的，步骤S1中，所述离心洗涤的步骤包括：将孵育后产物用超纯水洗涤4～6次后加入聚乙烯亚胺溶液，超声分散后于摇床上20～35℃反应1.5～2.5h，超纯水离心洗涤2～4次，无水乙醇离心洗涤2～4次，再用聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液重新分散。
更加优选的，所述聚乙烯亚胺溶液添加体积与聚苯乙烯微球体积相等，聚乙烯亚胺溶液浓度为16mg/mL，所述聚乙烯亚胺分子量为750k；所述聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液浓度为20mg/mL。
优选的，步骤S1中，所述水解的步骤包括：加入氨水和正硅酸乙酯反应11～13h，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷继续反应11～13h后离心，用无水乙醇离心洗涤；所述正硅酸乙酯添加体积与聚苯乙烯微球添加体积比为0.015～0.025:1，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷添加体积与聚苯乙烯微球添加体积比为0.15～0.25:1。
优选的，步骤S1中，所述与丁二酸酐反应的步骤包括：与用N,N-二甲基甲酰胺溶解的丁二酸酐反应0.8～1.2h，每1mL聚苯乙烯微球对应丁二酸酐添加量为0.08～0.12g。
优选的，步骤S2中，将步骤S1所得量子点荧光微球分散于PB中后，加入EDC和NHS活化15～25min，离心洗涤，加入鼠伤寒沙门氏菌的抗体，20～35℃下置于摇床上反应3～5h，离心洗涤，得到免疫量子点荧光微球；其中，每100μL子点荧光微球对应EDC的添加量为1.8～2.2mg，对应NHS的添加量为1.8～2.2mg，对应鼠伤寒沙门氏菌抗体的添加量为8～12μg。
优选的，步骤S3中，所述缓冲液为pH＝7.4的碱性缓冲液，具体的，为含有质量百分比1％BSA和1％Tween-20的PBS缓冲液。
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，所述吸水纸接于硝酸纤维素膜的另一端上表面，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的间距为9mm，所述检测线为鼠伤寒沙门氏菌抗体，所述质控线为羊抗鼠二抗。所述试纸条的组装及检测示意图如附图1所示。
基于上述鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，本实施例还提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，步骤包括：
1.量子点荧光微球的制备
取1mL聚苯乙烯微球(重量为20mg)，加入400μL CdSe/ZnS量子点，室温下置于摇床上150rpm反应2h后离心(12000rpm×20min)，加入超纯水离心洗涤5次后加入1mL聚乙烯亚胺溶液(分子量为750K，浓度为16mg/mL)，超声分散后室温下置于摇床上150rpm反应2h后离心(12000rpm×20min)，用超纯水离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次后，用聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液(20mg/mL)重新分散。室温下摇床上反应24h后加入100μL氨水和20μL正硅酸乙酯继续反应12h后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(200μL)，继续反应12h后离心，并用无水乙醇离心洗涤3次后，与4mL N,N-二甲基甲酰胺溶解的0.1g丁二酸酐室温下继续反应1h后，用无水乙醇和超纯水分别离心洗涤3次，最后用1mL超纯水重新分散得到表面富含羧基的量子点荧光微球。所述CdSe/ZnS量子点及量子点荧光微球的TEM表征图分别如附图2和附图3所示，CdSe/ZnS量子点及量子点荧光微球在相同浓度下归一化后发光强度如附图4所示，量子点荧光微球的荧光显微镜图片如附图5所示。
2.免疫量子点荧光微球的制备
取100μL制备好的量子点荧光微球用0.01M,pH＝6.8的PB(磷酸缓冲液)离心洗涤两次，并重新用200μL PB(0.01M,pH＝6.8)重新分散并加入2mg EDC和2mgNHS的溶液，活化20min后用0.01M,pH＝7.2的PB离心洗涤四次，然后分散到300μL PB(0.01M,pH＝7.2)中，加入10μg的鼠伤寒沙门氏菌的抗体，室温下置于摇床上150rpm反应4h，用400μL PB(0.01M,pH＝7.2)离心洗涤，并重复洗涤五次，即得到了对鼠伤寒沙门氏菌靶向的免疫量子点荧光微球，置于4℃冰箱中待用。
3.鼠伤寒沙门氏菌样品的检测
将1mL含有鼠伤寒沙门氏菌的样本离心除去上清后加入50μL层析液(1×PBS包含1％BSA和1％Tween-20)以及3μL免疫量子点荧光微球混合均匀，将混合液体加到样品垫上层析。10min后在紫外灯照射下观察检测线上的荧光或者用荧光试纸条读值仪读取检测线上的荧光。定性检测结果判断方法示意图如附图6所示。
4.定量检测曲线
将不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌样本，按照3描述的步骤进行检测，所述鼠伤寒沙门氏菌样本浓度分别为0CFU/mL、104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL。各浓度下的试纸条结果如附图7所示，结果可见，浓度在5×104CFU/mL及以上的样本均可实现有效检出。
测定浓度为5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL样品检测区域的平均荧光强度，绘制鼠伤寒沙门氏菌浓度与荧光强度关系曲线并拟合。所得鼠伤寒沙门氏菌的定量检测标准曲线如附图8所示，结合标准曲线及待测样品的检测区域的平均荧光强度即可读取出待测样品中的鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
实施例2
本实施例对实施例1提供的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法的重现性以及准确性进行了测试，具体过程包括：
1、配制不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液，各溶液中鼠伤寒沙门氏菌的浓度分别为0CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL。
2、各浓度溶液分别取10个样本，采用实施例1所述方法进行检测，检测结果如表1所示。
表1.鼠伤寒沙门氏菌试纸条的重现性以及准确性实验结果
从表1可见，不同浓度下的鼠伤寒沙门氏菌样本检出率为100％，所有样品检测结果均准确，重现性及准确度极高。
实施例3
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其采用的试纸与实施例1相同，所述检测方法的步骤包括：
1.量子点荧光微球的制备
取1mL聚苯乙烯微球(重量为20mg)，加入380μL CdSe/ZnS量子点，室温下置于摇床上150rpm反应1.5h后离心(12000rpm×20min)，加入超纯水离心洗涤5次后加入1mL聚乙烯亚胺溶液(分子量为750K，浓度为16mg/mL)，超声分散后室温下置于摇床上150rpm反应2h后离心(12000rpm×20min)，用超纯水离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次后，用聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液(20mg/mL)重新分散。室温下摇床上反应24h后加入100μL氨水和22μL正硅酸乙酯继续反应13h后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(230μL)，继续反应13h后离心，并用无水乙醇离心洗涤3次后，与4mL N,N-二甲基甲酰胺溶解的0.12g丁二酸酐继续反应1h后，用无水乙醇和超纯水分别离心洗涤3次，最后用1mL超纯水重新分散得到表面富含羧基的量子点荧光微球。
2、免疫量子点荧光微球的制备
取100μL制备好的量子点荧光微球用0.01M,pH＝6.8的PB(磷酸缓冲液)离心洗涤两次，并重新用200μL PB(0.01M,pH＝6.8)重新分散并加入2.1mg EDC和2.1mgNHS的溶液，活化25min后用0.01M,pH＝7.2的PB离心洗涤四次，然后分散到300μL PB(0.01M,pH＝7.2)中，加入10μg的鼠伤寒沙门氏菌的抗体，室温下置于摇床上150rpm反应4h，用400μL PB(0.01M,pH＝7.2)离心洗涤，并重复洗涤五次，即得到了对鼠伤寒沙门氏菌靶向的免疫量子点荧光微球，置于4℃冰箱中待用。
3、鼠伤寒沙门氏菌样品的检测
将1mL含有鼠伤寒沙门氏菌的样本离心除去上清后加入50μL层析液(1×PBS包含1％BSA和1％Tween-20)以及3μL免疫量子点荧光微球混合均匀，将混合液体加到样品垫上层析。10min后在紫外灯照射下观察检测线上的荧光或者用荧光试纸条读值仪读取检测线上的荧光。定性检测结果判断方法参照附图6所示，定性检测结果参照同实施例1相同方法得到的标准曲线读取样本中鼠伤寒沙门氏菌浓度。
实施例4
本实施例提供了一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其采用的试纸与实施例1相同，所述检测方法的步骤包括：
1.量子点荧光微球的制备
取1mL聚苯乙烯微球(重量为20mg)，加入450μL CdSe/ZnS量子点，室温下置于摇床上150rpm反应2.5h后离心(12000rpm×20min)，加入超纯水离心洗涤5次后加入1mL聚乙烯亚胺溶液(分子量为750K，浓度为16mg/mL)，超声分散后室温下置于摇床上150rpm反应2h后离心(12000rpm×20min)，用超纯水离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次后，用聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液(20mg/mL)重新分散。室温下摇床上反应24h后加入100μL氨水和18μL正硅酸乙酯继续反应11h后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(180μL)，继续反应11h后离心，并用无水乙醇离心洗涤3次后，与4mL N,N-二甲基甲酰胺溶解的0.08g丁二酸酐继续反应1h后，用无水乙醇和超纯水分别离心洗涤3次，最后用1mL超纯水重新分散得到表面富含羧基的量子点荧光微球。
2、免疫量子点荧光微球的制备
取100μL制备好的量子点荧光微球用0.01M,pH＝6.8的PB(磷酸缓冲液)离心洗涤两次，并重新用200μL PB(0.01M,pH＝6.8)重新分散并加入1.8mg EDC和1.8mgNHS的溶液，活化15min后用0.01M,pH＝7.2的PB离心洗涤四次，然后分散到300μL PB(0.01M,pH＝7.2)中，加入10μg的鼠伤寒沙门氏菌的抗体，室温下置于摇床上150rpm反应4h，用400μL PB(0.01M,pH＝7.2)离心洗涤，并重复洗涤五次，即得到了对鼠伤寒沙门氏菌靶向的免疫量子点荧光微球，置于4℃冰箱中待用。
3、鼠伤寒沙门氏菌样品的检测
将1mL含有鼠伤寒沙门氏菌的样本离心除去上清后加入50μL层析液(1×PBS包含1％BSA和1％Tween-20)以及3μL免疫量子点荧光微球混合均匀，将混合液体加到样品垫上层析。10min后在紫外灯照射下观察检测线上的荧光或者用荧光试纸条读值仪读取检测线上的荧光。定性检测结果判断方法参照附图6所示，定性检测结果参照同实施例1相同方法得到的标准曲线读取样本中鼠伤寒沙门氏菌浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，其特征在于：包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为鼠伤寒沙门氏菌抗体，所述质控线为羊抗鼠二抗。
2.如权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌检测试纸，其特征在于：所述样品垫搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，所述吸水纸接于硝酸纤维素膜的另一端上表面；所述检测线和质控线之间的间距为9mm。
3.一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤包括：
S1、制备量子点荧光微球：在聚苯乙烯微球中加入水溶性CdSe/ZnS量子点，孵育后离心洗涤除去过量的量子点，然后加入正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷水解，最后与丁二酸酐反应得到表面富含羧基的量子点荧光微球；
S2、制备鼠伤寒沙门氏菌抗体标记的量子点荧光微球：通过交联试剂EDC和NHS将鼠伤寒沙门氏菌抗体与步骤S1所得量子点荧光微球偶联，得到免疫量子点荧光微球；
S3、将待测样品离心去上清后与缓冲液和步骤S3所得免疫量子点荧光微球混合均匀，然后将混合液滴加至权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌检测试纸的样品垫上进行层析；
S4、通过在紫外灯照射下观察检测线和控制线上的荧光条带实现鼠伤寒沙门氏菌的定性以及半定量检测，通过读取检测线上的荧光信号实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。
4.如权利要求3所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S1中，每1mL聚苯乙烯微球中加入350～450μL水溶性CdSe/ZnS量子点，20～35℃下孵育1.5～2.5h后离心洗涤除去过量的量子点。
5.如权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述离心洗涤的步骤包括：将孵育后产物用超纯水洗涤4～6次后加入聚乙烯亚胺溶液，超声分散后于摇床上20～35℃反应1.5～2.5h，超纯水离心洗涤2～4次，无水乙醇离心洗涤2～4次，再用聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液重新分散。
6.如权利要求5所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺溶液添加体积与聚苯乙烯微球体积相等，聚乙烯亚胺溶液浓度为16mg/mL，所述聚乙烯亚胺分子量为750k；所述聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液浓度为20mg/mL。
7.如权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述水解的步骤包括：加入氨水和正硅酸乙酯反应11～13h，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷继续反应11～13h后离心，用无水乙醇离心洗涤；所述正硅酸乙酯添加体积与聚苯乙烯微球添加体积比为0.015～0.025:1，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷添加体积与聚苯乙烯微球添加体积比为0.15～0.25:1。
8.如权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S1中，所述与丁二酸酐反应的步骤包括：与用N,N-二甲基甲酰胺溶解的丁二酸酐反应0.8～1.2h，每1mL聚苯乙烯微球对应丁二酸酐添加量为0.08～0.12g。
9.采用权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S2中，将步骤S1所得量子点荧光微球分散于PB中后，加入EDC和NHS活化15～25min，离心洗涤，加入鼠伤寒沙门氏菌的抗体，20～35℃下置于摇床上反应3～5h，离心洗涤，得到免疫量子点荧光微球；其中，每100μL子点荧光微球对应EDC的添加量为1.8～2.2mg，对应NHS的添加量为1.8～2.2mg，对应鼠伤寒沙门氏菌抗体的添加量为8～12μg。
10.采用权利要求1所述的鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤S3中，所述缓冲液为含有质量百分比1％BSA和1％Tween-20的PBS缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711348563.XA CN108226509A (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711348563.XA CN108226509A (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108226509A true CN108226509A (zh) | 2018-06-29 |
Family
ID=62652256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711348563.XA Pending CN108226509A (zh) | 2017-12-15 | 2017-12-15 | 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108226509A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109884293A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-14 | 中国海洋大学 | 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法 |
| CN110470838A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-11-19 | 齐鲁工业大学 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法 |
| CN112114142A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-22 | 中华人民共和国太仓海关 | 一种基于量子点标记的检测试纸条及其制备方法与应用 |
| CN113687071A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-23 | 佛山墨赛生物技术有限公司 | 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法 |
| CN114609383A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-10 | 吉林大学 | 鼠伤寒沙门氏菌现场定性定量检测试剂盒及检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101912757A (zh) * | 2010-08-30 | 2010-12-15 | 武汉大学 | 一种荧光-磁性双编码微球的制备方法 |
| CN103048460A (zh) * | 2012-12-15 | 2013-04-17 | 武汉珈源生物医学工程有限公司 | 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法 |
| CN104297476A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-01-21 | 南昌大学 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒 |
| CN105823885A (zh) * | 2016-03-15 | 2016-08-03 | 武汉大学 | 一种超灵敏定量检测c-反应蛋白的方法和试剂盒 |
| CN105891508A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测h-fabp的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
| CN106596937A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-04-26 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种同步检测胰腺癌标记物的量子点试剂盒 |
| CN106706907A (zh) * | 2016-12-14 | 2017-05-24 | 武汉市农业科学技术研究院农业环境安全检测研究所（武汉市农业科学技术研究院中心实验室） | 一种基于量子点微球和抗生素的金黄色葡萄球菌快速层析试纸条 |
-
2017
- 2017-12-15 CN CN201711348563.XA patent/CN108226509A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101912757A (zh) * | 2010-08-30 | 2010-12-15 | 武汉大学 | 一种荧光-磁性双编码微球的制备方法 |
| CN103048460A (zh) * | 2012-12-15 | 2013-04-17 | 武汉珈源生物医学工程有限公司 | 一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法 |
| CN104297476A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-01-21 | 南昌大学 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒 |
| CN105823885A (zh) * | 2016-03-15 | 2016-08-03 | 武汉大学 | 一种超灵敏定量检测c-反应蛋白的方法和试剂盒 |
| CN105891508A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测h-fabp的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
| CN106596937A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-04-26 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种同步检测胰腺癌标记物的量子点试剂盒 |
| CN106706907A (zh) * | 2016-12-14 | 2017-05-24 | 武汉市农业科学技术研究院农业环境安全检测研究所（武汉市农业科学技术研究院中心实验室） | 一种基于量子点微球和抗生素的金黄色葡萄球菌快速层析试纸条 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109884293A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-14 | 中国海洋大学 | 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法 |
| CN110470838A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-11-19 | 齐鲁工业大学 | 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法 |
| CN112114142A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-22 | 中华人民共和国太仓海关 | 一种基于量子点标记的检测试纸条及其制备方法与应用 |
| CN113687071A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-23 | 佛山墨赛生物技术有限公司 | 鼠伤寒沙门氏菌活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法 |
| CN114609383A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-10 | 吉林大学 | 鼠伤寒沙门氏菌现场定性定量检测试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108226509A (zh) | 一种鼠伤寒沙门氏菌的荧光免疫层析检测方法及检测试纸 | |
| Song et al. | Development of a lateral flow colloidal gold immunoassay strip for the simultaneous detection of Shigella boydii and Escherichia coli O157: H7 in bread, milk and jelly samples | |
| Han et al. | Rapid field determination of SARS-CoV-2 by a colorimetric and fluorescent dual-functional lateral flow immunoassay biosensor | |
| Koletzko et al. | Evaluation of a novel monoclonal enzyme immunoassay for detection of Helicobacter pylori antigen in stool from children | |
| CN101893623B (zh) | 超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法 | |
| CN106680496B (zh) | 一种比色荧光双信号纳米球的制备及其在免疫层析定量检测中的应用 | |
| Wang et al. | Lanthanide-labeled fluorescent-nanoparticle immunochromatographic strips enable rapid and quantitative detection of Escherichia coli O157: H7 in food samples | |
| Chamberlin et al. | Serodiagnosis of Bartonella bacilliformis infection by indirect fluorescence antibody assay: test development and application to a population in an area of bartonellosis endemicity | |
| Jiang et al. | A novel dynamic flow immunochromatographic test (DFICT) using gold nanoparticles for the serological detection of Toxoplasma gondii infection in dogs and cats | |
| CN111999507B (zh) | 一种检测新型冠状病毒抗体的荧光免疫层析试纸 | |
| CN114113585B (zh) | 一种双信号探针、检测大肠杆菌的试纸条及应用 | |
| CN102645536A (zh) | 一种检测金黄色葡萄球菌的方法 | |
| CN109932505A (zh) | 一种检测食品中广谱型沙门氏菌的试纸条及其制备、使用方法 | |
| CN106771208A (zh) | 布鲁氏菌抗体检测试纸条 | |
| CN109342740A (zh) | 一种检测人幽门螺旋杆菌抗体的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法 | |
| Ge et al. | Lateral flow immunoassay for visible detection of human brucellosis based on blue silica nanoparticles | |
| CN106290274A (zh) | 大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备及检测方法 | |
| Shi et al. | Visual typing detection of brucellosis with a lateral flow immunoassay based on coloured latex microspheres | |
| CN111796096A (zh) | 一种新型冠状病毒IgGIgM抗体联合检测试剂制备方法 | |
| US10151749B2 (en) | Method and kit for the detection of microorganisms | |
| CN107957497A (zh) | 一种禽流感h5亚型病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用 | |
| Khan et al. | Development of a simple, peripheral-blood-based lateral-flow dipstick assay for accurate detection of patients with enteric fever | |
| CN101082059A (zh) | 大肠杆菌o157:h7抗原快速检测测试条 | |
| CN117233383A (zh) | 一种艰难梭菌抗原以及毒素a和毒素b的联合检测卡及其制备方法、试剂盒 | |
| CN102712947B (zh) | 检测由微生物所引起感染的凝集反应的改良方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180629 |