CN104297476A

CN104297476A - 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒

Info

Publication number: CN104297476A
Application number: CN201410533091.5A
Authority: CN
Inventors: 徐锋; 魏华; 甘敏; 武晓丽; 叶若松; 陈星星; 王登远; 杨栋; 刘琚珥; 许恒毅; 胡海宁
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2014-10-11
Filing date: 2014-10-11
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明涉及一种基于菌体荧光染色技术，并利用单一抗体对染色的鼠伤寒沙门氏菌菌体进行检测免疫层析试纸盒，包括单一抗体试纸条、荧光染料盒。本发明的优点是：使用荧光染料对鼠伤寒沙门氏菌菌体进行预染色，再利用鼠伤寒沙门氏菌的特异性抗体喷涂于试纸条T线捕获混合样本中的鼠伤寒沙门氏菌菌体，达到对样本中菌体的快速、特异性地检测。

Description

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒

技术领域

本发明涉及细菌学与免疫学技术领域。具体涉及单抗体检测细菌的免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

免疫层析技术( immunochromatography)是20世纪80年代末90年代初在免疫渗滤的基础上建立的一种快速检测技术，其技术特征为：将能与待检样本中的抗原（或抗体）起抗原抗体反应的抗体（或抗原）以带状预先涂敷在免疫层析试纸片的特定位置上，待检样本中的抗原（或者抗体）在利用展开液展开的过程中预先被颜色标识上，被颜色标识上的待检样本中的抗原（或者抗体）展开特定位置（即带状涂敷有抗体（或抗原）的位置）时，被颜色标识上的待检样本中的抗原（或者抗体）通过抗原抗体反应被捕捉，因此，在特定位置上形成通过颜色而发色的显色线。由于免疫层析技术不须进行结合标记物与自由标记物的分离，因而操作简单、快速，非常适合现场检测之用。因此，基于免疫层析技术研制的免疫层析试纸条发展很快，能通过免疫反应的检测都能通过免疫层析技术进行。

目前广泛采用的免疫胶体金层析法试纸条存在以下不足之处：

1.胶体金是一种纳米颗粒，制备胶体金纳米颗粒较难，且颗粒直径较难控制均匀；

2.胶体金标记过程中用到强还原剂，同时要接触重金属者离子，对人体健康和安全有一定影响；

3.胶体金标记过程是物理吸附过程，故液相时稳定性较差；

4.只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度；

5.不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。

传统试纸条均采用双抗体夹心法（double antibody sandwich format）检测细菌和、病毒、蛋白质、LPS等。此方法特点在于将已知的特异性抗体以一定的量包被于膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗作为质控带。而大的抗原分子有多个抗原位点，试纸条所用抗体不能选择同一位点，需要进行抗体配对。抗原配对过程耗费时间长，增加研发成本。

发明内容

本发明的一个目的是于克服现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高，操作简便的定性和定量检测混合样本中检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒，为我国致病菌的检测和预防提供一种简便的检测和诊断方法及工具。

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒，其特征在于包括单一抗体试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有鼠伤寒沙门氏菌抗体作为检测线T线，抗荧光染料抗体喷质控线C线；

所述荧光染料盒装有的荧光染料为碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green；所述抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%；

所述鼠伤寒沙门氏菌抗体喷涂浓度为1mg/mL。

检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒进行细菌检测的方法，其特征在于包括如下步骤：取待测样品，离心后用荧光染料盒中荧光染料进行染色5 min，用1×PBS洗3遍并重悬沉淀；取20 uL，与1×PBS混合后加至单一抗体试纸条的样品垫，反应15min后单一抗体试纸条在紫外灯下判定定性结果，检测线处有条带，说明待测样品中有目标菌，结果为阳性；检测线无亮带，说明待测样品中无目标菌，结果为阴性。

利用标准梯度浓度的目标菌分别加入到不同的样品垫上，检测线上荧光强度利用荧光定量光谱仪进行检测，通过梯度浓度的目标菌在检测线上的荧光强度作成标准曲线；读出待测样品在检测线上的荧光强度，对照标准曲线，对待测样品中的目标菌浓度进行定量检测。该方法优选用于食品样品中的鼠伤寒沙门氏菌检测。

本发明的有益效果是：

1.单一抗体纸条只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题，使用荧光染料抗体制作C线；

2.由于不需要氯金酸，也不需要考虑抗体配对问题，且工艺简便，制备方便，比传统胶体金试纸条更节约成本；

3.一个菌可以结合的染料分子比该菌可结合的抗体要多很多，因此多重试纸条比普通试纸条的灵敏度更高；

4.相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要胶金垫，因此更简便。

附图说明

图1 普通胶体金试纸条结构示意图

图2 本发明单一抗体试纸条的示意图

图3 其他染料染色菌体后的试纸条检测

1.番红，2.结晶紫，3.沙黄，4.DiOC₁₈(3)，5.异硫氰酸荧光素

图4 鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条检测结果

鼠伤寒沙门氏菌体数量分别是：1.10¹⁰，2.10⁸，3.10⁷，4.10⁶，5.10⁵，6.10⁴，7.空白对照

图5 鼠伤寒沙门氏菌单一抗体试纸条检测结果

鼠伤寒沙门氏菌体数量分别是：1.空白对照，2. 10¹⁰，3.10⁸，4.10⁷，5.10⁶，6.10⁵，7.10⁴。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 本发明单一抗体试纸条结构描述、制备方法

1.本发明试纸盒

检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒，包括单一抗体试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有鼠伤寒沙门氏菌抗体作为检测线T线，抗荧光染料抗体喷质控线C线；

荧光染料盒中装有荧光染料碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green。抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%；

所述鼠伤寒沙门氏菌7抗体喷涂浓度为1mg/mL。

2.胶体金试纸条的制备

2.1胶体金溶液的制备

采用柠檬酸三钠还原法进行制备，具体步骤如下：取100 mL超纯水装入洁净的烧杯中，向其中加入1 mL浓度为1%的HAuCl₄溶液，置于磁力搅拌器上边搅拌边加热煮沸后，立即加入1%柠檬酸三钠溶液。最后当溶液颜色变为透亮的红色后，继续搅拌10 min并停止加热，待其自然冷却至室温后，4℃保存备用； 2.2金标抗体的制备

吸取一定量的胶体金溶液于洁净的小烧杯中，用0.2 M K₂CO₃溶液将pH值调整为8.1；室温条件下，边搅拌边逐滴加入抗体稀释液至终浓度为20 μg/mL。反应1 h后，逐滴加入1/10体积的1% PEG 20000，搅拌30 min后，再逐滴加入1/10体积的封闭剂溶液；继续搅拌30 min后，4℃，5000 rpm离心30 min，弃上清，沉淀用原体积1/10的胶体金重悬液重悬； 2.3胶体金试纸条的制备及组装

按10 μL/cm的喷金量喷于胶金垫上，30℃真空干燥2 h后，检测线和控制线分别用2.0 mg/mL抗目的菌抗体体和1.0 mg/mL二抗，37℃干燥8 h后用0.5% OVA进行封闭，然后置于37℃条件下充分干燥；将滤纸、样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接粘于PVP底板上，用BIODOT切割机切成4 mm宽条状后装入卡壳，置于包装袋中，加干燥剂密封，于常温下保存。具体如图1。

3.检测

摇床中取出培养好的细菌，用含5%吐温20的1*PBS洗3遍，期间用75%乙醇洗一遍，1W rpm离心5min。用荧光染料盒中碘化丙啶（PI）染色洗好后的菌体，直接加入PI即可，PI浓度25ug/ml染色5min后用5%吐温20的1*PBS洗3遍并重悬沉淀；

取20 uL菌体染色后的混合液，与90 uL5%吐温20的1*PBS混合后加入我们所制备的单一抗体试纸条和胶体金试纸条的加样孔中，反应15min后单一抗体试纸条在紫外灯下判定结果，检测线处有条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性，并与所制备的胶体金试纸条作比较。

由普通胶体金试纸条与单一抗体试纸条的示意图，图1与图2的比较可知，由以以上内容可知，单一抗体试纸条1、单一抗体试纸条只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题，使用荧光染料抗体制作C线。2、一个菌可以结合的染料分子比该菌可结合的抗体要多很多，因此单一抗体试纸条比普通试纸条的灵敏度更高。3、相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要金垫，因此更简便。4、由于不需要氯金酸，也不需要考虑抗体配对问题，可以简化工艺，节约成本。

实施例2 ：其他染料染色菌体后的试纸条检测

用普通染料蕃红、沙黄、结晶紫和常见荧光染料DiOC₁₈(3)、异硫氰酸荧光素（FITC）对鼠伤寒沙门氏菌进行染色10 min后，上样到本发明的试纸条上。C线喷相应的染料抗体；

结果如图3所示，其他染料发现均不能在试纸条上进行显色。推测原因可能是这些染料不适合应用于试纸条，他们与菌体结合的同时，与试纸条的硝酸纤维素膜或样品垫等也结合，导致染色的菌体不能在试纸条上迁移，最终不能显色。而本发明筛选的碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green四种荧光染料可以较好的适合试纸条的使用，染色菌体可在试纸条上迁移，并在T线上显色。

实施例3：本发明试纸盒检测鼠伤寒沙门氏菌

取实施例1制备的试纸盒；

取菌体数量分别为：空白组、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10¹⁰ CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌悬液使用0.01%荧光染料染溶液色5 min。将染色结束的菌液滴加4滴样品(约100μL)于试纸条加样孔中。反应15min后在紫外灯下判定结果，检测线处有两条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性；

与相同菌体数量鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条检测结果比较，图4鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条检测结果表明其最底检测限在菌体数量10⁷ CFU/mL。鼠伤寒沙门氏菌单一抗体试纸条检测结果表明其最底检测限在菌体数量10⁶至10⁵之间，由此我们可以得出本发明鼠伤寒沙门氏菌单一抗体试纸条（图5）比鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条（图4）更加灵敏，至少约高出一个数量级。

Claims

1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒，其特征在于包括单一抗体试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有鼠伤寒沙门氏菌抗体作为检测线T线，抗荧光染料抗体喷质控线C线。

2.根据权利要求1所述的试纸盒，其特征在于所述荧光染料盒装有的荧光染料为碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green；所述抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%。

3.根据权利要求1所述的试纸盒，其特征在于所述鼠伤寒沙门氏菌抗体喷涂浓度为1mg/mL。

4.一种利用如权利要求1所述检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸盒进行细菌检测的方法，其特征在于包括如下步骤：取待测样品，离心后用荧光染料盒中荧光染料进行染色5 min，用1×PBS洗3遍并重悬沉淀；取20 uL，与1×PBS混合后加至单一抗体试纸条的样品垫，反应15min后单一抗体试纸条在紫外灯下判定定性结果，检测线处有条带，说明待测样品中有目标菌，结果为阳性；检测线无亮带，说明待测样品中无目标菌，结果为阴性；利用标准梯度浓度的目标菌分别加入到不同的样品垫上，检测线上荧光强度利用荧光定量光谱仪进行检测，通过梯度浓度的目标菌在检测线上的荧光强度作成标准曲线；读出待测样品在检测线上的荧光强度，对照标准曲线，对待测样品中的目标菌浓度进行定量检测。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的样品为食品样品。