CN104297474A - 一种检测细菌的检测组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于菌体荧光染色技术检测细菌的检测组合，并利用单一抗体对使用荧光染色的菌体进行检测，在一个试纸条上喷有大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线）的免疫层析试纸条。本发明的优点是：使用荧光染料对菌体进行预染色，再利用各自特异性抗体喷涂于试纸条T线捕获混合样本中的目的菌体，达到对样本中菌体的快速、特异性地检测。能够同时检测三种食源性致病菌大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌。

Description

一种检测细菌的检测组合
技术领域
本发明涉及检测技术领域。
背景技术
免疫层析技术是20世纪80年代末90年代初在免疫渗滤的基础上建立的一种快速检测技术，其技术特征为：将能与待检样本中的抗原（或抗体）起抗原抗体反应的抗体（或抗原）以带状预先涂敷在免疫层析试纸片的特定位置上，待检样本中的抗原（或者抗体）在利用展开液展开的过程中预先被色素标识上，被色素标识上的待检样本中的抗原（或者抗体）展开特定位置（即带状涂敷有抗体（或抗原）的位置）时，被色素标识上的待检样本中的抗原（或者抗体）通过抗原抗体反应被捕捉，因此，在特定位置上形成通过色素而发色的显色线。由于免疫层析技术不须进行结合标记物与自由标记物的分离，因而操作简单、快速，非常适合现场检测之用。
因此，基于免疫层析技术研制的免疫层析试纸条发展很快，能通过免疫反应的检测都能通过免疫层析技术进行。目前广泛采用的免疫胶体金层析法试纸条存在以下不足之处：1、胶体金是一种纳米颗粒，制备胶体金纳米颗粒较难，且颗粒直径较难控制均匀。 2、胶体金标记过程中用到强还原剂，同时要接触重金属者离子，对人体健康和安全有一定影响。 3、胶体金标记过程是物理吸附过程，故液相时稳定性较差。4、只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。5、不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。
传统试纸条均采用双抗体夹心法检测细菌和、病毒、蛋白质、LPS等。此方法特点在于将已知的特异性抗体以一定的量包被于膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗作为质控带。而大的抗原分子有多个抗原位点，试纸条所用抗体不能选择同一位点，需要进行抗体配对。抗原配对过程耗费时间长，增加研发成本。
基于此，我们研发的食源性致病菌的单一抗体多重试纸条只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题。可在一张试纸条上同时检测不同的菌。相对来说，可判定待检测菌的种类。相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要金垫，因此更简便。一个菌可以结合的染料分子比该菌可结合的抗体要多很多，因此多重试纸条比普通试纸条的灵敏度更高。
发明内容
本发明的一个目的是于克服现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高，操作简便的定性和定量检测混合样本中目的菌体的荧光免疫层析试纸条，为我国致病菌的检测和预防提供一种简便的检测和诊断方法及工具。
本发明的另一个目的是提供上述食源性致病菌的单一抗体多重试纸条的制备方法。本发明的单一抗体多重试纸条，其包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP背衬其具体结构是：在PVP背衬上按顺序依次粘附有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线），荧光染料抗体喷质控线（C线）。
一种检测细菌的检测组合，包括单一抗体多重试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体多重试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4 mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线T1、T2、T3线，抗荧光染料抗体喷质控线C线；
所述的菌为大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌。
所述荧光染料盒装有的荧光染料为碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green；所述抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%；
所述大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体喷涂浓度分别为1mg/mL，并将上述三种抗体分别喷到到硝酸纤维素膜上形成3条检测线。
本发明还涉及检测细菌的检测组合进行细菌检测的方法，包括如下步骤：取待测样品，离心后用荧光染料盒中荧光染料进行染色5 min，用1×PBS洗3遍并重悬沉淀；取20 uL，与1×PBS混合后加至单一抗体多重试纸条的样品垫，反应15 min后单一抗体多重试纸条在紫外灯下判定定性结果，检测线处有条带，说明待测样品中有目标菌，结果为阳性；检测线无亮带，说明待测样品中无目标菌，结果为阴性；
利用标准梯度浓度的目标菌分别加入到不同的样品垫上，检测线上荧光强度利用荧光定量光谱仪进行检测，通过梯度浓度的目标菌在检测线上的荧光强度作成标准曲线；读出待测样品在检测线上的荧光强度，对照标准曲线，对待测样品中的目标菌浓度进行定量检测；
该方法优选用于食品样品中的细菌检测。
本发明的有益效果是：
1、可在一张试纸条上同时检测不同的菌，并且不受其他杂菌和食品基质的影响，特异性良好；
2、多重试纸条只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题，使用荧光染料抗体制作C线；
3、一个菌可以结合的染料分子比该菌可结合的抗体要多很多，因此多重试纸条比普通试纸条的灵敏度更高；
4、相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要金垫，因此更简便；
5、由于不需要氯金酸，也不需要考虑抗体配对问题，且工艺简便，制备方便，比传统胶体金试纸条更节约成本。
附图说明
图1 普通胶体金试纸条结构示意图
图2 单一抗体多重试纸条的示意图
图3 蕃红染色检测结果
1．大肠杆菌O157：H7，2. 单核增生李斯特菌，3. 鼠伤寒沙门氏菌
图4 沙黄染色检测结果
1．大肠杆菌O157：H7，2. 单核增生李斯特菌，3. 鼠伤寒沙门氏菌
图5 结晶紫染色检测结果
1．大肠杆菌O157：H7，2. 单核增生李斯特菌，3. 鼠伤寒沙门氏菌
图6 DiOC18(3) 染色检测结果
1．大肠杆菌O157：H7，2. 单核增生李斯特菌，3. 鼠伤寒沙门氏菌
图7异硫氰酸荧光素染色检测结果
1．大肠杆菌O157：H7，2. 单核增生李斯特菌，3. 鼠伤寒沙门氏菌
图8 大肠杆菌O157：H7胶体金试纸条检测结果
大肠杆菌O157：H7菌体数量分别是：1.空白对照，2.104，3.105，4.106
图9 本发明多重试纸条检测大肠杆菌O157：H7检测结果
大肠杆菌O157：H7菌体数量分别是：1.空白对照，2.103，3.104，4.105
图10 单核增生李斯特菌胶体金试纸条检测结果
单核增生李斯特菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.105，3.106，4.107
图11 本发明多重试纸条检测单核增生李斯特菌检测结果
单核增生李斯特菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.104，3.105，4.106
图12 鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条检测结果
鼠伤寒沙门氏菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.106，3.107，4.108
图13 本发明多重试纸条检测鼠伤寒沙门氏菌检测结果
鼠伤寒沙门氏菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.105，3.106，4.107
图14 本发明多重试纸条检测食品基质中的致病菌的结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 本发明单一抗体多重试纸条结构描述、制备方法
1、本发明检测细菌的检测组合：
包括单一抗体多重试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体多重试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线T1、T2、T3线，抗荧光染料抗体喷质控线C线；
所述的菌为大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌；
所述荧光染料盒装有的荧光染料为碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green；所述抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%；
所述大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体喷涂浓度分别为1mg/mL，并将上述三种抗体分别喷到到硝酸纤维素膜上形成3条检测线。
2、胶体金试纸条：
第一步：胶体金溶液的制备：采用柠檬酸三钠还原法进行制备，具体步骤如下：取100 mL超纯水装入洁净的烧杯中，向其中加入1 mL浓度为1%的HAuCl4溶液，置于磁力搅拌器上边搅拌边加热煮沸后，立即加入1%柠檬酸三钠溶液。最后当溶液颜色变为透亮的红色后，继续搅拌10 min并停止加热，待其自然冷却至室温后，4℃保存备用；
第二步：金标抗体的制备：吸取一定量的胶体金溶液于洁净的小烧杯中，用0.2 M K2CO3溶液将pH值调整为8.1；室温条件下，边搅拌边逐滴加入抗体稀释液至终浓度为20 μg/mL。反应1 h后，逐滴加入1/10体积的1% PEG 20000，搅拌30 min后，再逐滴加入1/10体积的封闭剂溶液；继续搅拌30 min后，4℃，5000 rpm离心30 min，弃上清，沉淀用原体积1/10的胶体金重悬液重悬；
第三步：胶体金试纸条的制备及组装：按10 μL/cm的喷金量喷于胶金垫上，30℃真空干燥2 h后，检测线和控制线分别用2.0 mg/mL抗目的菌抗体体和1.0 mg/mL二抗，37℃干燥8 h后用0.5% OVA进行封闭，然后置于37℃条件下充分干燥；将滤纸、样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接粘于PVP底板上，用BIODOT切割机切成4 mm宽条状后装入卡壳，置于包装袋中，加干燥剂密封，于常温下保存。
3、检测
摇床中取出培养好的细菌，用含5%吐温20的1*PBS洗3遍，期间用75%乙醇洗一遍，1W rpm离心5min。用荧光染料盒中碘化丙啶（PI）染色洗好后的菌体，直接加入PI即可，PI浓度25ug/ml染色5min后用5%吐温20的1*PBS洗3遍并重悬沉淀；
取20uL各种菌染色后混合液，与90uL5%吐温20的1*PBS混合后加入我们所制备的单一抗体多重试纸条和胶体金试纸条的加样孔中，反应15min后单一抗体多重试纸条在紫外灯下判定结果，检测线处有条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性，并与所制备的胶体金试纸条作比较；
普通胶体金试纸条与本发明单一抗体多重试纸条的示意图比较如图1、图2：
由以以上内容可知，本发明检测细菌的检测组合包括单一抗体多重试纸条：1、可在一张试纸条上同时检测不同的菌。2、只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题，使用荧光染料抗体制作C线。3、一个菌可以结合的染料分子比该菌可结合的抗体要多很多，本发明检测组合比普通试纸条的灵敏度更高。4、相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要金垫，因此更简便。5、由于不需要氯金酸，也不需要考虑抗体配对问题，可以简化工艺，节约成本。
实施例2：其他染料染色菌体后的试纸条的检测
用普通染料蕃红、沙黄、结晶紫和常见荧光染料DiOC18(3)、异硫氰酸荧光素（FITC）分别对三种细菌（大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌）进行染色10 min后，上样到本发明的试纸条上。C线上喷涂相应的抗染料抗体；
结果如图3、图4、图5、图6、图7所示，发现均不能在试纸条上进行显色。推测原因可能是这些染料不适合应用于试纸条，他们与菌体结合的同时，与试纸条的硝酸纤维素膜或样品垫等也结合，导致染色的菌体不能在试纸条上迁移，最终不能显色。而本发明筛选的碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green四种荧光染料可以较好的适合试纸条的使用，染色菌体可在试纸条上迁移，并在T线上显色。
实施例3：本发明检测细菌的检测组合检测大肠杆菌O157：H7
在硝酸纤维素膜上喷涂大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线）荧光染料抗体喷质控线（C线）喷点仪（XYZ3000点膜仪，美国BIO-DOT公司）（XYZ3000点膜仪，美国BIO-DOT公司）Y值设置如下：14.5、10.5、7.5、4.5cm，37℃真空干燥；将硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；
取大肠杆菌O157：H7菌体数量分别是：1.空白对照，2.104，3.105，4.106
（CFU/mL）悬液使用本发明检测细菌的检测组合中的0.01%碘化丙啶色5 min。将染色结束大肠杆菌O157：H7的菌液滴加4滴样品(约100μL)于试纸条加样孔中。反应15min后在紫外灯下判定结果，检测线T1处有条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性。与大肠杆菌O157：H7菌体数量分别是：1.空白对照，2.103，3.104，4.105（CFU/mL）胶体金试纸条检测结果比较；
结果如图8和图9，胶体金试纸条分别加入大肠杆菌O157：H7菌体数量为空白对照，104，105，106。检测细菌的检测组合中的单一抗体多重试纸条分别加入大肠杆菌O157：H7菌体数量为空白对照，103，104，105都能够检出。可知大肠杆菌O157：H7胶体金试纸条的最底检出限在菌体数量为104到105之间。而本发明检测细菌的检测组合的最底检出限在菌体数量为104到103之间。由此比较我们可以得知本发明检测细菌的检测组合在比大肠杆菌O157：H7试纸条的灵敏度更高。
实施例4：本发明检测细菌的检测组合检测单核增生李斯特菌
在硝酸纤维素膜上喷涂大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线）荧光染料抗体喷质控线（C线）喷点仪（XYZ3000点膜仪，美国BIO-DOT公司）Y值设置如下：14.5、10.5、7.5、4.5cm， 37℃真空干燥；将硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；
取单核增生李斯特菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.104，3.105，4.106使用本发明检测细菌的检测组合中的0.01%荧光染料染溶液色5 min。将染色结束的单核增生李斯特菌菌液滴加4滴样品(约100μL)于试纸条加样孔中。反应15min后在紫外灯下判定结果，检测线T2处有条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性。与单核增生李斯特菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.105，3.106，4.107的单核增生李斯特菌胶体金试纸条检测结果比较；
结果如图10和图11，胶体金试纸条分别加入单核增生李斯特菌菌体数量为空白对照，105，106，107 CFU/mL。本发明检测细菌的检测组合中的单一抗体多重试纸条分别加入单核增生李斯特菌菌体数量为空白对照，104，105，106 CFU/mL，两种试纸条都能够检出单核增生李斯特菌。从图可知单核增生李斯特菌胶体金试纸条的最底检出限在菌体数量为106 CFU/mL左右。而本发明检测细菌的检测组合的最底检出限在菌体数量为105 CFU/mL。由此比较我们可以得知本发明检测细菌的检测组合在比单核增生李斯特菌试纸条的灵敏度更高。
实施例5：本发明检测组合检测鼠伤寒沙门氏菌
在硝酸纤维素膜上喷涂大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线）荧光染料抗体喷质控线（C线）喷点仪（XYZ3000点膜仪，美国BIO-DOT公司）Y值设置如下：14.5、10.5、7.5、4.5cm，37℃真空干燥；将硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为本发明单一抗体多重试纸条；
取鼠伤寒沙门氏菌菌体数量分别是：1.空白对照，2.105，3.106，4.107使用本发明检测组合中的0.01%荧光染料染溶液色5 min。将染色结束的菌液滴加4滴样品(约100μL)于试纸条加样孔中。反应15min后在紫外灯下判定结果，检测线T3处有条带，结果为阳性。检测线无亮带，结果为阴性。与鼠伤寒沙门氏菌菌体数量分别是：1.空白照，2.108，3.109，4.1010胶体金试纸条检测结果比较；
结果如图12和图13，胶体金试纸条分别加入鼠伤寒沙门氏菌菌体数量为空白照，108，109，1010。本发明检测细菌的检测组合中的多重快速检测试纸条分别加入鼠伤寒沙门氏菌菌体数量为空白对照，107，108，109都能够检出。可知鼠伤寒沙门氏菌胶体金试纸条的最底检出限在菌体数量为108到109之间。而本发明检测细菌的检测组合的最底检出限在菌体数量为107到108之间。由此比较我们可以得知本发明检测细菌的检测组合在比鼠伤寒沙门氏菌试纸条的灵敏度更高。
实施例6：本发明检测细菌的检测组合检测在食品基质中的致病菌
在硝酸纤维素膜上喷涂大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线（T1、T2、T3线）荧光染料抗体喷质控线（C线）喷点仪（XYZ3000点膜仪，美国BIO-DOT公司）Y值设置如下：14.5、10.5、7.5、4.5cm，37℃真空干燥；将硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；
在奶粉溶液中混入植物乳杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌作为原样。再分别向原样里加入大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、和三种菌混合一起分别作为不同样本，均经荧光染料染色后加样；
检测结果如下图14多重试纸条检测食品基质中的致病菌的结果。由图14可知我们研制的本发明检测细菌的检测组合，三条检测线（T1、T2、T3线）的特异性良好，相对普通免疫试纸条，不需要胶体金等显色剂的偶联制备步骤，甚至不需要金垫，因此更简便。由于不需要氯金酸，也不需要考虑抗体配对问题，可以简化工艺，节约成本。不受其他杂菌和食品基质所影响，本发明检测细菌的检测组合只需要单一抗体即可完成一种菌的检测，避免了抗体配对问题。而且具有低于胶体金试纸条的检测线，能够很好的应用到实际中；
各孔道加样分别为：
1.为在奶粉溶液中混入植物乳杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌的对照组
2.为向对照组里加入鼠伤寒沙门氏菌的样品1
3.为向对照组里加入单核增生李斯特菌的样品2
4.为向对照组里加入大肠杆菌O157：H7的样品3
5.为向对照组里加大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的样品4。

Claims (6)

1.一种检测细菌的检测组合，其特征在于包括单一抗体多重试纸条、荧光染料盒；所述单一抗体多重试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVP底板，其具体结构特征是：硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板上；在底板的一端为样品垫，另一端为吸水垫；以宽度为3-4mm/条切条后即为单一抗体多重试纸条；所述的硝酸纤维素膜喷有喷有大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体分别作为三条检测线T1、T2、T3线，抗荧光染料抗体喷质控线C线。
2.根据权利要求1所述的检测组合，其特征在于所述的菌为大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌。
3.根据权利要求1所述的检测组合，其特征在于所述荧光染料盒装有的荧光染料为碘化丙啶、荧光素双醋酸酯(FDA)、吖啶橙、或SYBR Green；所述抗荧光染料抗体喷涂浓度为质量浓度0.01%。
4.根据权利要求1所述的检测组合，其特征在于所述大肠杆菌O157：H7抗体、单核增生李斯特菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体喷涂浓度分别为1mg/mL；并将上述三种抗体分别喷到到硝酸纤维素膜上形成3条检测线。
5.利用权利要求1所述检测细菌的检测组合进行细菌检测的方法，其特征在于包括如下步骤：取待测样品，离心后用荧光染料盒中荧光染料进行染色5 min，用1×PBS洗3遍并重悬沉淀；取20 uL，与1×PBS混合后加至单一抗体多重试纸条的样品垫，反应15min后单一抗体多重试纸条在紫外灯下判定定性结果，检测线处有条带，说明待测样品中有目标菌，结果为阳性；检测线无亮带，说明待测样品中无目标菌，结果为阴性； 利用标准梯度浓度的目标菌分别加入到不同的样品垫上，检测线上荧光强度利用荧光定量光谱仪进行检测，通过梯度浓度的目标菌在检测线上的荧光强度作成标准曲线；读出待测样品在检测线上的荧光强度，对照标准曲线，对待测样品中的目标菌浓度进行定量检测。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的样品为食品样品。
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