CN116183934A - 一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ1-42的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白检测技术领域，具体公开了一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1‑42的试剂盒，包括包被有捕获抗体的磁珠复合物、标记有荧光微球的检测抗体复合物；包被有捕获抗体的磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，磁珠粒径为0.5‑4.7μm；标记有荧光微球的检测抗体复合物包括荧光微球和检测抗体，荧光微球粒径为200‑400nm。本发明提供的试剂盒能够快速的检测血清样本中的Aβ_1‑42，特异性强、灵敏度高且重复性佳，使用过程简单方便，1个小时之内即可检测出结果。

Description

一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ1-42的试剂盒

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是最常见的痴呆类型。由于起病隐匿、早期诊断困难，其引发的认知障碍、精神行为问题和生活功能丧失问题给公共卫生系统带来了沉重的经济和社会负担。

AD是一个从无症状、轻度认知损害(mild cognitive impairment,MCI)到痴呆的连续过程，经历早期、中期、晚期三个阶段，反映痴呆发生、发展、恶化的临床特征。早期AD无明显症状，难以诊断，极易被误诊，早期诊断、早期干预能够显著延缓病变的发生，对于降低发病率至关重要，有利于维持患者的正常生活，有助于鉴别AD患者和AD疑似病患者，提高诊断准确性。

β淀粉样蛋白(Aβ)是淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶作用后的底物，由第21号染色体编码，是AD主要病理蛋白之一。Aβ_1-42是由42-43个氨基酸组成的蛋白质片断，主要位于AD患者的脑内，Aβ_1-42的形成、沉积和降解贯穿阿尔茨默海症的整个病理过程，检测Aβ_1-42抗体能够准确的判断AD发病。

阿尔兹海默症的前期，血液中微量存在Aβ_1-42，化学发光和层析平台只能达到纳克/毫升(ng/mL)级别，检测难度大，很难进行精准检测及超微量检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，以解决上述技术问题。

本发明目的之一在于提供一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，包括包被有捕获抗体的磁珠复合物、标记有荧光微球的检测抗体复合物；包被有捕获抗体的磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，磁珠粒径为0.5-4.7μm；标记有荧光微球的检测抗体复合物包括荧光微球和检测抗体，荧光微球粒径为200-400nm；磁珠的工作浓度为0.05-0.3mg/mL。

包被有捕获抗体的磁珠复合物、标记有荧光微球的检测抗体复合物均能与Aβ_1-42抗原结合。Aβ_1-42抗原的氨基酸序列为：

DAEFRHDSGYEVHHOKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIV。

优选地，根据抗体特异性特性分类，捕获抗体可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，捕获抗体可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。

磁珠与捕获抗体偶联需用活化剂，磁珠表面的修饰基团为羧基时，活化剂可以为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、SulfoNHS、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或两种以上。磁珠的表面修饰有羧基、氨基或甲苯磺酰基中的一种或多种，优选修饰有羧基的磁珠。羧基浓度为10-35μeq/g。羧基浓度大于35μeq/g，会出现本低浓度过大，小于10μeq/g抗体与磁珠连接不充分，后续造成试剂盒出现非特异连接。

优选地，荧光微球材质为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯中的一种或两种以上，优选为聚苯乙烯。二氧化硅不易溶胀，无法将染料包裹在其内，荧光强度不稳定。聚丙烯酰胺偶联抗体后，其灵敏度能达到0.091ng/mL，但较聚苯乙烯偶联抗体后的灵敏度低。荧光微球表面修饰有羧基、氨基或甲苯磺酰基中的一种或多种，优选修饰有羧基的荧光微球。在荧光微球上修饰羧基，有助于进一步增强信号，进一步提高灵敏度。

采用内部染料包埋方法制备荧光微球，得到的荧光微球发光更加稳定。

优选地，荧光微球内包裹的染料为荧光素、量子点、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白或上转换纳米粒子。采用荧光素为染料的荧光微球的荧光强度强，能与背景信号分开，有利于在最终结果分析时的信号采集，能显著提高检测的精密度。进一步优选荧光微球内包裹的染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂，具有高吸收率、优异的荧光量子产率和良好的水溶性，稳定性佳，与蛋白质结合力优良，并且人眼对黄绿色较为敏感，方便观察，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长为520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在冷暗干燥处也可保存多年。在大量的荧光染料中，FITC由于其高吸收性，出色的荧光量子产率和良好的水溶性而成为最受欢迎的荧光团之一。像其他荧光素衍生物一样，FITC产生可检测的信号，而无需其他试剂进行检测。该功能使FITC在检测蛋白质或抗体的位置和活化，鉴定蛋白质或抗体复合物的形成和构象变化以及监测体内生物过程方面极为灵活。

量子点是一种纳米级别的半导体，通过对量子点施加一定的电场或光压，便会发出特定频率的光，而发出的光的频率会随着这种半导体尺寸的改变而变化，因而通过调节这种纳米半导体的尺寸就可以控制其发出的光的颜色，具体原理是由于这种纳米半导体拥有限制电子和电子空穴(Electron hole)的特性。

稀土元素是化学元素周期表中镧系元素—镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)，钇(Y)和钪(Sc)，共17种元素，均是非常活泼的金属，性质极为相似，常见化合价+3，其水合离子大多有颜色，易形成稳定的配化合物。

稀土螯合物是一些稀土元素Sm³⁺、Dy³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺，尤其是Eu³⁺、Tb³⁺同一些有机化合物如β-二酮化合物、菲罗啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等所形成的螯合物，在紫外光的照射下发出很强的荧光，最主要的特点是激发波长具有配体的特性即随配体的变化而变化，发射光的波长具有镧系元素的性质，即不随配体的变化而变化，有利于多种稀土离子标记进行多分析物同时监测。

荧光蛋白优选为绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)是一种β-桶状蛋白1，由238个氨基酸组成，分子量约为27kDa，激发波长为488nm，并在约507nm处有一个发射峰。GFP从水晶水母Aequorea victoria分离而来，可通过能量转移，将水母发光蛋白通过化学作用发出的蓝色荧光转变为绿色荧光。

上转换纳米颗粒(UCNP)含有无机晶体基质的晶格中有镧系元素、过渡金属或锕系元素掺杂离子，能够在受到低能量的光激发的情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光。

优选地，根据抗体特异性特性分类，检测抗体可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，检测抗体可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。

荧光微球与检测抗体偶联需要用到活化剂，荧光微球表面的修饰基团为羧基时，活化剂可以为NHS、SulfoNHS、EDC中的一种或两种以上。

优选地，还包括分别含有Aβ_1-42抗原的校准品和质控品；校准品用于试剂盒定标，质控品用于检测试剂盒是否稳定。

优选地，还包括用于荧光微球与检测抗体标记偶联液。标记偶联液包括Tris缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种。标记偶联液浓度为10-200mM。

本发明目的之二在于提供上述检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备包被有捕获抗体的磁珠复合物：

活化磁珠30-35min后，将捕获抗体和活化后的磁珠均匀混合，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；孵育结束后进行磁分离，向磁珠中加入封闭液，继续孵育，转速为800-1000rpm/min，孵育结束后进行磁分离并去除上清液；

S2、制备标记有荧光微球的检测抗体复合物：

活化荧光微球30-35min后，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；孵育后，将荧光微球和检测抗体均匀混合，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；加入封闭液，继续孵育，转速为800-1000rpm/min。

本发明的有益效果在于：

1、本发明通过控制磁珠粒径、磁珠的工作浓度、磁珠表面修饰的基团，发现当磁珠粒径为0.5-4.7μm，尤其是当磁珠粒径为3μm，试剂反应背景大大减少，检测灵敏度显著提高。磁珠的工作浓度为0.05-0.3mg/mL。磁珠工作浓度高于0.3mg/mL，磁珠用量越多试剂成本就会越高，且磁珠分散不均匀容易结团进而影响检测结果。当磁珠工作浓度为0.25mg/mL时，能够进一步提高整个试剂盒的灵敏度和准确度的同时，保证较低的生产成本。当磁珠工作浓度低于0.05mg/mL时，参与反应的磁珠量就越低，不能完全捕获样本中的目标待测物，检测结果与样本真实值存在较大偏差。

磁珠工作浓度越高，磁珠用量就越多，成本就会越高，当磁珠的工作浓度为0.05-0.3mg/mL，尤其是当磁珠的工作浓度为0.25mg/mL时，能够进一步提高整个试剂盒的灵敏度和准确度的同时，保证低的生产成本；当磁珠表面修饰的基团为羧基时，信号显著增强，灵敏度显著提高。

2、本发明通过控制捕获抗体的种类，发现当采用鼠源单克隆捕获抗体，能够减少抗体的非特异性吸附。

3、本发明通过控制磁珠与捕获抗体偶联用的活化剂种类，发现当活化剂为EDC时，抗体与磁珠存在牢固的共价结合。本发明通过控制荧光微球与检测抗体偶联需要用到的活化剂种类，发现当活化剂为EDC和NHS时，检测抗体与微球存在牢固的共价结合。

4、本发明通过控制荧光微球粒径、荧光微球的载体材质、荧光微球的内燃料种类，发现荧光微球粒径为200-400nm，荧光微球的载体材质为聚苯乙烯，荧光微球的内燃料为异硫氰酸荧光素(FITC)时，试剂盒的灵敏度较佳。

5、本发明通过控制检测抗体种类，发现当采用鼠源单克隆检测抗体，能够减少抗体的非特异性吸附。

6、本发明通过控制标记偶联液的种类，发现当标记偶联液为HEPES缓冲液时，反应体系更稳定，易于抗体与磁珠连接。

7、本发明通过使荧光微球和检测抗体均与Aβ_1-42抗原结合，从原理上进行突破，使整个试剂盒的灵敏度提高了3个数量级，从纳克/毫升(ng/mL)级别提升到了飞克/毫升(fg/mL)级别。

8、本发明试剂盒的原理如下：

(1)常规免疫荧光法采用一种固相载体包被抗体再与抗原结合，本发明提供的试剂盒在免疫荧光法的基础上进行改进，包被有捕获抗体的磁珠复合物、标记有荧光微球的检测抗体复合物均能与Aβ_1-42抗原结合，具有一定的信号增强效果，灵敏度更高。

(2)常规免疫荧光法多采用酶促发光，相对定量，本发明所采用的免疫荧光法通过对微球荧光点进行检测，能够实现绝对定量。

(3)常规免疫荧光法多采用固相载体(酶标板)，比表面积比液相载体(磁珠)小，结合到的抗体量少，能够识别的抗原也就相对应的减少，灵敏度低，重复性差。本发明提供的试剂盒从原理上进行突破，灵敏度提高了3个数量级(从纳克/毫升级别提升到了飞克/毫升级别)，对于低丰度蛋白分子标志物的检测优势明显，通过采用信号增强的荧光纳米粒子和磁性粒子，实现高灵敏度，检测速度快，线性范围广等优点。

9、本发明提供的试剂盒可测量各种不同基质(血清、血浆、脑脊液、尿液、细胞提取物等)中的浓度，灵敏度较传统免疫荧光法提高约1000倍。即使被测物含量非常低(fg/mL)，也能被准确的检测出来。本发明可以用血清作为样本进行检测，样本来源简单易取，不需要进行活体穿刺即可进行检测。

10、本发明提供的试剂盒能够快速的检测血清样本中的Aβ_1-42，特异性强、灵敏度高且重复性佳，使用过程简单方便，1个小时之内即可检测出结果，试剂盒校准曲线相关系数达到0.99，Aβ_1-42的检测下线最低可达到0.1pg/ml，检测重复性CV值可达到3.5％。

11、试剂盒的制备方法的具体检测原理如下：

(1)当磁珠活化时间＞35min，活化时间过长，会导致活化形成的中间体不稳定，降低抗体的偶联效率，当磁珠活化时间＜30min，活化时间过短，会使的羧基活化不充分，影响后续抗体的偶联。荧光微球的活化时间为30-35min的与磁珠相同。优选磁珠和荧光微球的活化时间均为30min。

(2)第一步中，当孵育时间＞3h，实验时间太长，长时间的偶联并不会增加偶联效率，反而会造成磁珠团聚，孵育时间＜1h，孵育时间过短，会造成抗体和磁珠未完全结合，抗体偶联不充分，降低偶联效率，优选孵育时间为2h。

第二步中，当孵育时间＞3h，会造成荧光微球团聚，孵育时间＜1h，孵育时间过短，会造成抗体和荧光微球未完全结合，降低偶联效率，优选孵育时间为2h。

(3)加封闭液前，转速＞1000rpm/min，转速过快，会造成磁珠(或荧光微球)不能均匀分散，无法与抗体充分结合，偶联效率降低，转速＜800rpm/min，转速过慢，会造成磁珠(或荧光微球)团聚，偶联效率降低。优选转速为800rpm/min，能使磁珠(或荧光微球)均匀的分散开，与抗体充分结合。加封闭液后，转速＞1000rpm/min，转速过快，会造成磁珠(或荧光微球)不能均匀分散，封闭液无法与磁珠(或荧光微球)未结合抗体的位点结合，封闭效率降低，后期检测会出现非特异性反应，影响灵敏度；转速＜800rpm/min，转速过慢，会造成磁珠(或荧光微球)团聚，封闭效率降低，加入封闭液后的优选转速为800rpm/min，能使磁珠(或荧光微球)均匀的分散开，且与抗体充分结合。

附图说明

图1为实施例1拟合的校准曲线斜率；

图2为健康对照组血清Aβ_1-42浓度和肺癌病人血清中Aβ_1-42浓度。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

以下实施例所用到的主要试剂如下：

实施例1：一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒

1、用途：

用于检测患者血清中Aβ_1-42的表达情况，检测灵敏度可达到飞克/毫升(fg/mL)级别，对于阿尔兹海默症的早期鉴别诊断具有重要意义。

2、试剂盒组分

表1试剂盒组分

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3、试剂盒制备

表2制备试剂盒的原料来源

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S1、制备试剂1：包被有捕获抗体的磁珠复合物

(1)取100μL 3mg/mL羧基磁珠(粒径3μm，工作浓度为0.25mg/mL)，使用磁珠清洗液清洗3次并移除。

(2)称取EDC，配制浓度成20mg/ml的活化溶液，加入到(1)中的溶液中，25℃下，恒温摇床上活化35min。

(3)取0.05mg的捕获抗体，加入到(2)的羧基磁珠中，混合均匀，在25℃下恒温摇床，孵育2h，转速：800rpm/min。

(4)孵育结束后，加入20mM PBS缓冲液清洗，在涡旋仪上混匀后置于磁力架上，进行磁分离，用PBS清洗3次。

(5)向磁珠中加入100mL 10mg/ml的BSA封闭液，于恒温摇床上孵育1h，转速：800rpm/min，磁分离后去除上清液。称取1g的BSA(牛血清白蛋白)于烧杯中，加入20mM PBS(pH 7.4)搅拌置溶解，倒入容量瓶中定容至1L，得到BSA封闭液，置于4℃保存。

(6)加入磁珠保存液，得到包被有捕获抗体的磁珠复合物的工作浓度为0.15mg/ml，4℃保存。

S2、制备试剂2：标记有荧光微球的检测抗体复合物

(1)取200μL羧基修饰的荧光微球，使用标记偶联液清洗3次，12000rpm离心15min。标记偶联液的配制方法：称取11.915g的HEPES于烧杯中，加入800mL纯化水搅拌至溶解，用盐酸调节pH值至7.4，倒入容量瓶中定容至1L。置于4℃保存。标记偶联液主要用于荧光微球与检测抗体偶联。荧光微球的工作浓度为0.2mg/mL。荧光微球的工作浓度与成本和准确度有关，荧光微球浓度越低，其成本越低；浓度过高可能会造成非特异结合，增加清洗难度，浓度过低，可能造成信号减少，影响准确度和灵敏度。

(2)称取EDC和NHS，浓度溶解成15mg/ml，加到(1)溶液中。25℃下，滚轴孵育器上活化35min。

(3)取0.05mg的检测抗体，加入到(2)的荧光微球中，混合均匀，在25℃下，滚轴孵育器上孵育2h，转速：800rpm/min。

(4)加入100μL 20mg/ml的BSA封闭液，于滚轴孵育器上孵育1h，转速：800rpm/min。

(5)封闭结束后，18000rpm离心20min，加入标记保存液4℃保存，得到标记有荧光微球的检测抗体复合物的最终浓度为1.0mg/ml。

S3、制备校准品和质控品

(1)配制校准品

①配制校准品基质：20mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.5％BSA，0.1％明胶和0.01％proclin300。

②配制校准品基质后，用0.22μm微孔滤膜过滤，微孔滤膜的孔过大会导致大粒径的杂质过滤不掉，起不到过滤作用，微孔滤膜的孔过小会将溶液中的有效物质过滤出去。

用过滤后的校准品基质将Aβ_1-42抗原作适当比例稀释，使其浓度符合试剂测试需求，作为Aβ_1-42抗体检测试剂盒校准品，例如可稀释成0pg/mL、10pg/mL和500pg/mL，分别对应校准品1、校准品2和校准品3。

(2)配制质控品

①配制质控品基质：20mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.5％BSA，0.1％明胶和0.01％proclin300。

②配制质控品基质后，用0.22μm微孔滤膜过滤。用过滤后的质控品基质将Aβ_1-42抗原作适当比例稀释，使其浓度符合试剂测试需求，作为Aβ_1-42抗体检测试剂盒质控品，例如可稀释成20pg/mL和400pg/mL，分别对应质控品1和质控品2。

4、试剂盒检测方法：

本实施例基于单分子检测技术，并在免疫荧光法的基础上进行改进，具体测定步骤如下：

(1)将Aβ_1-42抗原的浓度分别稀释为0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100以及200pg/mL；

(2)每个校准品浓度取50μL到不同反应杯中，分别取50μL试剂1加入到反应杯中，在25℃下，恒温摇床上孵育30min。

(3)孵育结束后，使用20mM PBS缓冲液清洗3次，分别加50μL试剂2加入到反应杯中，在25℃下，恒温摇床上孵育30min。按照上述方案，进行偶联缓冲液的筛选以及偶联缓冲液的筛选。

(4)使用20mM PBS缓冲液清洗3次，磁珠保存液重悬磁珠。

(5)分别取试剂1 50μL加入到10个反应杯中，放置在磁分离架上，采用20mM PBS缓冲液清洗3次后重悬。

(6)取健康人血清样本和肺癌病人血清样本，分别混匀后各取向50μL加入到上述反应杯中，在25℃下，恒温摇床上孵育30min。

(7)反应结束后，磁分离架20mM PBS缓冲液分离清洗3次后重悬，每管加50μL试剂2，混匀仪充分混匀，在25℃下，恒温摇床上孵育30min。

(8)反应结束后，将反应杯置于磁分离架上，20mM PBS缓冲液清洗3次，重悬后检测。

实施例2-9

实施例2-9与实施例1的区别主要如下表3所示：

表3实施例2-9与实施例1的区别

对上述的实施例2-9，与实施例1同样的检测步骤，测试检测下限和试剂CV值，结果见下表4，实施例1拟合的校准曲线斜率见图1。

表4实施例1-9的检测下限和试剂CV值

注：CV％值主要反应数据的离散程度，越小越佳，3％以下最佳。

图1为实施例1拟合的校准曲线斜率，可以根据标准曲线查出待测物质的含量，R²是指一系列已知含量(浓度/量)的物质与仪器响应/信号之间的关系，R²越接近1，相关性越佳。

实施例1-50中，实施例1制备试剂盒的灵敏度最佳，且数据离散程度最小。

按照上述实施例2同样的试验条件，进行50例临床样本(涵盖AD发病人群和健康人群)进行检测。本次试验通过与临床症状以及ELISA科研试剂盒比对的结果，进行一致性评价。其中对照组为其他方法学与临床症状相结合结果，50例临床样本经过医院伦理会批准，进行本前瞻性研究。如图2，纵坐标为其他方法学，横坐标为单分子检测。可以看出两种方法学对同一样本检测结果相当，符合一致性评价结果。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，包括包被有捕获抗体的磁珠复合物、标记有荧光微球的检测抗体复合物；包被有捕获抗体的磁珠复合物包括磁珠和捕获抗体，磁珠粒径为0.5-4.7μm；标记有荧光微球的检测抗体复合物包括荧光微球和检测抗体，荧光微球粒径为200-400nm；磁珠的工作浓度为0.05-0.3mg/mL。

2.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，根据抗体特异性特性分类，捕获抗体可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，捕获抗体可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，荧光微球材质为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯中的一种或两种以上。

4.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，根据抗体特异性特性分类，检测抗体可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，检测抗体可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，还包括分别含有Aβ_1-42抗原的校准品和质控品；校准品用于试剂盒定标，质控品用于检测试剂盒是否稳定。

6.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒，其特征在于，还包括用于荧光微球与检测抗体标记偶联液；标记偶联液包括Tris缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种；标记偶联液浓度为10-200mM。

7.根据权利要求1-8任一项权利要求所述的检测阿尔茨海默病标志物Aβ_1-42的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备包被有捕获抗体的磁珠复合物：

活化磁珠30-35min后，将捕获抗体和活化后的磁珠均匀混合，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；孵育结束后进行磁分离，向磁珠中加入封闭液，继续孵育，转速为800-1000rpm/min，孵育结束后进行磁分离并去除上清液；

S2、制备标记有荧光微球的检测抗体复合物：

活化荧光微球30-35min后，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；孵育后，将荧光微球和检测抗体均匀混合，孵育1-3h，转速为800-1000rpm/min；加入封闭液，继续孵育，转速为800-1000rpm/min。

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