CN110609024B - 一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法 - Google Patents
一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法,是由聚多巴胺纳米球和在单一激发光下发射不同颜色荧光的两种铜纳米团簇组成,在两种铜纳米团簇表面分别修饰有甲基苯丙胺单克隆抗体和氯胺酮单克隆抗体。本发明的检测探针,制备方法简单、成本低廉,使用方便、灵敏度高、可信度强,并可实现多种毒品的同步可视化检测。
Description
技术领域
本发明涉及公共卫生安全检测领域,尤其是涉及一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法。
背景技术
毒品是严重威胁人类健康的重大问题,准确的毒品检测对打击毒品犯罪、侦破毒品案件、遏止毒品蔓延具有非常重要的意义。近年来,不断飙升的毒品案件,对毒品检测技术也提出了更高的要求。
目前,常用的毒品检测技术有传统的色谱法、光谱法、免疫法、电化学法等。虽然这些毒品检测手段在一定程度上可以满足了缉毒、禁毒警察以及戒毒机构在工作中的需要,但是这些检测方法需要昂贵的仪器、专业的测试人员、繁琐的操作步骤,这无疑是增加了工作的时间和金钱成本。同时,这些传统的检测方法也面临着检测灵敏度低、准确性差、检测通量低的问题。
基于荧光探针的可视化毒品检测方法,是一种简单、快速、高效、低成本的检测毒品的手段。然而,在毒品检测领域中,目前的荧光检测法大多是基于荧光猝灭机制的,因此,检测灵敏度不够高,检测信号的信噪比高,准确性差。此外,大多的荧光检测毒品法是针对单一的毒品种类,无法实现多种毒品的同步检测。
发明内容
基于上述现有技术所存在的问题,本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、灵敏度高、准确性强、检测通量高的荧光增强型双色可视化毒品检测探针及其制备方法。
本发明为实现发明目的,采用如下技术方案:
本发明首先公开了一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针,其特点在于:所述检测探针是由聚多巴胺纳米球和在单一激发光下发射不同颜色荧光的两种铜纳米团簇组成,在两种铜纳米团簇表面分别修饰有甲基苯丙胺单克隆抗体和氯胺酮单克隆抗体。
进一步地,两种铜纳米团簇分别为在365nm激发光下发射出中心波长为450nm的蓝色荧光的铜纳米团簇,和在365nm激发光下发射出中心波长为600nm的橙色荧光的铜纳米团簇。
进一步地,所述聚多巴胺纳米球的粒子直径为100-500nm,具有良好的生物相容性和生物可降解性;所述铜纳米团簇的粒子直径为0.5-5nm,具有良好的生物相容性和稳定的荧光发射性能。
进一步地,所述检测探针中,两种铜纳米团簇的质量比为1:1,聚多巴胺纳米球的质量与两种铜纳米团簇的总质量的比为1:5-25。
在探针体系中,聚多巴胺纳米球与铜纳米团簇之间通过π-π弱相互作用力连接,聚多巴胺纳米球的吸收光谱与铜纳米团簇的荧光发射光谱重叠,聚多巴胺纳米球作为荧光共振能量转移的受体、铜纳米团簇作为荧光共振能量转移的给体;
上述荧光增强型双色可视化毒品检测探针的检测原理为:在无目标检测物甲基苯丙胺和氯胺酮存在时,由于聚多巴胺纳米球和铜纳米团簇之间的荧光共振能量转移机制,检测探针在365nm激发光下,没有荧光发射,处于荧光猝灭的状态;在有目标检测物甲基苯丙胺和/ 或氯胺酮存在时,铜纳米团簇表面修饰的抗体与目标检测物之间特异性结合,且这种特异性结合的能力强于铜纳米团簇与聚多巴胺纳米球之间的π-π弱相互作用力,使得铜纳米团簇脱离了聚多巴胺纳米球,因此在365nm激发光下,检测探针显示出了蓝色和/或橙色的荧光,实现了检测探针荧光信号的增强;所述荧光信号的增强与目标检测物的含量呈正比例关系,从而可实现基于荧光增强的多种毒品的可视化同步检测。
本发明还公开了所述荧光增强型双色可视化毒品检测探针的制备方法,包括如下步骤:
(1)合成聚多巴胺纳米球、发射蓝色荧光的铜纳米团簇和发射橙色荧光的铜纳米团簇;
(2)将浓度为0.9-3.8mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为 1.1-4.3mg/L的N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的水溶液,按体积比1:1进行混合,之后分别加入甲基苯丙胺或氯胺酮单克隆抗体,在37℃下持续搅拌0.5-2小时,获得两种备用抗体溶液;在所述备用抗体溶液中抗体浓度范围在50-200μM;
将发射蓝色荧光的铜纳米团簇和发射橙色荧光的铜纳米团簇分别分散在水中,获得浓度为0.95-3.8mg/mL的分散液;
然后在一种备用抗体溶液中按体积比1:1-5加入发射蓝色荧光的铜纳米团簇的分散液,在另一种备用抗体溶液中按体积比1:1-5加入发射橙色荧光的铜纳米团簇的分散液,再在37℃下孵化3-6小时,即完成铜纳米团簇表面抗体的修饰,分别获得修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和修饰后橙光铜纳米团簇的分散液;
(3)按照两种铜纳米团簇的质量比为1:1、聚多巴胺纳米球的质量与两种铜纳米团簇的总质量的比为1:5-25,将所述修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和所述修饰后橙光铜纳米团簇的分散液混合后,再加入聚多巴胺纳米球,均匀混合30-90s,即获得荧光增强型双色可视化毒品检测探针。
进一步地,所述聚多巴胺纳米球的合成方法为:将0.05-0.3g的盐酸多巴胺,加入到50-500 mLTris缓冲液和乙醇或异丙醇的混合溶液中,搅拌12-72小时;反应完成后,离心、洗涤、干燥,即获得聚多巴胺纳米球粉末;在所述混合溶液中,Tris缓冲液的浓度为2-20mM。
进一步地,所述发射橙色荧光的铜纳米团簇的合成方法为:将200-500mmol铜盐和1-25 mol含有羧基官能团的表面配体在6-16mL超纯水中混合,用碱性物质调节pH至3-5,获得混合液;按照混合液与不良溶剂的体积比为1:25-95,向混合液中加入不良溶剂,然后离心,所得沉淀真空干燥后,即获得发射橙色荧光的铜纳米团簇粉末。
进一步地,所述发射蓝色荧光的铜纳米团簇的合成方法为:将0.1-1g的分子量40000的聚乙烯吡咯烷酮、0.025-0.4μmol铜盐和0.25-4μmol还原剂在5-20mL超纯水中混合,用碱性物质调节pH至6-8范围内;所得混合液在室温下用截留分子量为15000的透析袋透析反应 24-72h;在所得透析液中加入0.05-4μmol的还原剂,再用酸性物质调节pH至3-5范围内,室温下孵化3-5天,随后用截留分子量为15000的透析袋进行透析反应24-72h;对所得溶液进行离心,收集沉淀,经真空干燥后,得到发射蓝色荧光的铜纳米团簇粉末。
在所述铜纳米团簇的合成中:所述铜盐为硫酸铜、硝酸铜、氯化铜、醋酸铜或氰化亚铜;所述含有羧基官能团的表面配体为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、对巯基苯甲酸或甘氨酸;所述还原剂为水合肼、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、柠檬酸钠或抗坏血酸;所述碱性物质为氢氧化钠或氢氧化钾;所述不良溶剂为乙醇、异丙醇或丙醇;所述酸性物质为盐酸或硫酸。
与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
1、本发明的荧光增强型双色可视化毒品检测探针,原料来源丰富、价格低廉,合成方法简单、无毒。
2、本发明的荧光增强型双色可视化毒品检测探针,其检测机制相对于荧光猝灭型毒品检测机制,信噪比高、检测灵敏度高、可信度强。
3、本发明的荧光增强型双色可视化毒品检测探针,相对于传统的毒品检测方法,操作简单、成本低、无需专业技能,并且检测通量高,可也实现多种毒品的同步检测。
附图说明
图1为聚多巴胺纳米球的吸收光谱。
图2为修饰抗体后的铜纳米团簇的荧光发射光谱及在365nm激发光下的颜色照片。
图3为检测探针对不同浓度的目标待测物的荧光强度变化。
图4为检测探针对甲基苯丙胺的标准曲线及标准浓度换算公式。
图5为检测探针对氯胺酮的标准曲线及标准浓度换算公式。
图6为在不同浓度的甲基苯丙胺、氯胺酮的存在下,在365nm激发光下的检测的颜色照片,图中M代表甲基苯丙胺、K代表氯胺酮。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例按如下步骤制备荧光增强型双色可视化毒品检测探针:
(1)聚多巴胺纳米球的合成
将0.1g的盐酸多巴胺,加入到60mLTris缓冲液和40mL异丙醇的混合溶液中,搅拌48小时;反应完成后,离心、超纯水洗涤3-5次、30℃真空干燥箱中干燥留存,即获得聚多巴胺纳米球粉末;在混合溶液中,Tris缓冲液的浓度为10mM。
所得聚多巴胺纳米球粉末的吸收光谱如图1所示。
(2)铜纳米团簇的合成
发射橙色荧光的铜纳米团簇的合成:将360mmol硝酸铜和9mol谷胱甘肽在8mL超纯水中混合,用1.5M的氢氧化钠调节pH至4,获得混合液;按照混合液与不良溶剂的体积比为1:60,向混合液中加入乙醇,然后离心,所得沉淀真空干燥后,即获得发射橙色荧光的铜纳米团簇粉末;
发射蓝色荧光的铜纳米团簇的合成方法为:将0.5g的分子量40000的聚乙烯吡咯烷酮、 0.25μol硝酸铜和2.5μmol抗坏血酸,在10mL超纯水中混合,用1.5M的氢氧化钠调节pH 至6;所得混合液在室温下用截留分子量为15000的透析袋透析反应48h;在所得透析液中加入0.05μmol的柠檬酸钠,再用1.5M盐酸调节pH至4,室温下孵化4天,随后用截留分子量为15000的透析袋进行透析反应48h;对所得溶液进行离心,收集沉淀,经真空干燥后,得到发射蓝色荧光的铜纳米团簇粉末。
(3)铜纳米团簇表面修饰相应抗体
将浓度为1.9mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为2.15mg/L的 N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的水溶液,按体积比1:1进行混合,之后加入甲基苯丙胺或氯胺酮单克隆抗体,在37℃下持续搅拌1小时,获得备用抗体溶液;在所述备用抗体溶液中抗体浓度范围在100μM;
将发射蓝色荧光的铜纳米团簇和发射橙色荧光的铜纳米团簇分别分散在水中,获得浓度为2mg/mL的分散液;
然后在甲基苯丙胺抗体溶液中按体积比1:1加入发射蓝色荧光的铜纳米团簇的分散液,在氯胺酮抗体溶液中按体积比1:1加入发射橙色荧光的铜纳米团簇的分散液,再在37℃下孵化4小时,即完成铜纳米团簇表面抗体的修饰,分别获得修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和修饰后橙光铜纳米团簇的分散液;
修饰抗体后的铜纳米团簇的荧光发射光谱见图2(左侧曲线对应修饰后蓝光铜纳米团簇、右侧曲线对应修饰后橙光铜纳米团簇)。
(4)荧光增强型双色可视化毒品检测探针的合成
按照两种铜纳米团簇的质量比为1:1、聚多巴胺纳米球的质量与两种铜纳米团簇的总质量的比为1:5,将修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和修饰后橙光铜纳米团簇的分散液混合后,再加入聚多巴胺纳米球,均匀混合60s,即获得荧光增强型双色可视化毒品检测探针。
对甲基苯丙胺和氯胺酮的标准浓度换算公式的建立:在上述检测探针中,逐步加入目标待测物,在365nm激发光下,记录荧光发射光谱,对450nm和600nm处的荧光发射峰的强度进行数据记录。以加入目标待测物时与未目标加入待测物时的450nm或600nm处的荧光发射峰强度的比值作为纵坐标,目标待测物的浓度作为横坐标,做点图,并对数据进行线性拟合,得到标准曲线,并获得标准浓度换算公式。甲基苯丙胺,标准浓度换算公式为: y=0.91946+0.0359x,R2=0.9959。氯胺酮,标准浓度换算公式为:y=0.94738+0.02656x, R2=0.9973。基于此,对未知浓度的样品,可以做到定量检测。在不同浓度待测物的条件下,检测探针的荧光发射光谱见图3。甲基苯丙胺和氯胺酮的标准曲线及标准浓度换算公式分别见图4、图5。
对甲基苯丙胺和氯胺酮的可视化检测:在365nm激发光下,用人眼可以观察到,检测探针的荧光发射随着目标检测物浓度的变化而变化,以此作为可视化定性检测。同时,用相机记录在特定浓度的目标检测物下,检测探针的荧光发射,基于此,可以作为今后的可视化半定量检测。对甲基苯丙胺和氯胺酮的荧光增强型双色可视化检测见图6,图中M代表甲基苯丙胺、K代表氯胺酮。
Claims (4)
1.一种荧光增强型双色可视化毒品检测探针,其特征在于:所述检测探针是由聚多巴胺纳米球和在单一激发光下发射不同颜色荧光的两种铜纳米团簇组成,在两种铜纳米团簇表面分别修饰有甲基苯丙胺单克隆抗体和氯胺酮单克隆抗体;
两种铜纳米团簇分别为在365nm激发光下发射出中心波长为450nm的蓝色荧光的铜纳米团簇,和在365nm激发光下发射出中心波长为600nm的橙色荧光的铜纳米团簇;
所述聚多巴胺纳米球的粒子直径为100-500nm;所述铜纳米团簇的粒子直径为0.5-5nm;
所述检测探针中,两种铜纳米团簇的质量比为1:1,聚多巴胺纳米球的质量与两种铜纳米团簇的总质量的比为1:5-25。
2.一种权利要求1所述荧光增强型双色可视化毒品检测探针的制备方法,其特征在于:
(1)合成聚多巴胺纳米球、发射蓝色荧光的铜纳米团簇和发射橙色荧光的铜纳米团簇;
(2)将浓度为0.9-3.8mg/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为1.1-4.3mg/L的N-羟基琥珀酰亚胺钠盐的水溶液,按体积比1:1进行混合,之后加入甲基苯丙胺或氯胺酮单克隆抗体,在37℃下持续搅拌0.5-2小时,获得备用抗体溶液;在所述备用抗体溶液中抗体浓度范围在50-200μM;
将发射蓝色荧光的铜纳米团簇和发射橙色荧光的铜纳米团簇分别分散在水中,获得浓度为0.95-3.8mg/mL的分散液;
然后在一种备用抗体溶液中按体积比1:1-5加入发射蓝色荧光的铜纳米团簇的分散液,在另一种备用抗体溶液中按体积比1:1-5加入发射橙色荧光的铜纳米团簇的分散液,再在37℃下孵化3-6小时,即完成铜纳米团簇表面抗体的修饰,分别获得修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和修饰后橙光铜纳米团簇的分散液;
(3)按照两种铜纳米团簇的质量比为1:1、聚多巴胺纳米球的质量与两种铜纳米团簇的总质量的比为1:5-25,将所述修饰后蓝光铜纳米团簇的分散液和所述修饰后橙光铜纳米团簇的分散液混合后,再加入聚多巴胺纳米球,均匀混合30-90s,即获得荧光增强型双色可视化毒品检测探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
所述聚多巴胺纳米球的合成方法为:将0.05-0.3g的盐酸多巴胺,加入到50-500mLTris缓冲液和乙醇或异丙醇的混合溶液中,搅拌12-72小时;反应完成后,离心、洗涤、干燥,即获得聚多巴胺纳米球粉末;在所述混合溶液中,Tris缓冲液的浓度为2-20mM;
所述发射橙色荧光的铜纳米团簇的合成方法为:将200-500mmol铜盐和1-25mol含有羧基官能团的表面配体在6-16mL超纯水中混合,用碱性物质调节pH至3-5,获得混合液;按照混合液与不良溶剂的体积比为1:25-95,向混合液中加入不良溶剂,然后离心,所得沉淀真空干燥后,即获得发射橙色荧光的铜纳米团簇粉末;
所述发射蓝色荧光的铜纳米团簇的合成方法为:将0.1-1g的分子量40000的聚乙烯吡咯烷酮、0.025-0.4μmol铜盐和0.25-4μmol还原剂,在5-20mL超纯水中混合,用碱性物质调节pH至6-8范围内;所得混合液在室温下用截留分子量为15000的透析袋透析反应24-72h;在所得透析液中加入0.05-4μmol的还原剂,再用酸性物质调节pH至3-5范围内,室温下孵化3-5天,随后用截留分子量为15000的透析袋进行透析反应24-72h;对所得溶液进行离心,收集沉淀,经真空干燥后,得到发射蓝色荧光的铜纳米团簇粉末。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:所述铜盐为硫酸铜、硝酸铜、氯化铜、醋酸铜或氰化亚铜;
所述含有羧基官能团的表面配体为谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸、对巯基苯甲酸或甘氨酸;
所述还原剂为水合肼、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、柠檬酸钠或抗坏血酸;
所述碱性物质为氢氧化钠或氢氧化钾;
所述不良溶剂为乙醇、异丙醇或丙醇;
所述酸性物质为盐酸或硫酸。
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CN110609024A (zh) | 2019-12-24 |
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