JPH02504640A - 表面カップリング官能性を有するイットリウム、ランタニドおよびアクチニドの大環状錯体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 表面カップリング官能性を有するイツトリウム、ランタニドおよびアクチニドの 大環状錯体 主亘亘１１ 主里坐立立　　−本発明は原子番号５７〜７１０ランタニドの、原子番号８９〜 １（１３のアクチニドのおよび原子番号３９のイツトリウム（ＩＩＩ）の機能化 、水溶性大環状錯体を合成するプロセスに関する。

また、本発明は、上記錯体を生物学的活性または生物学的相客性分子に、または １または２個以上の反応性を有する表面ペンダント（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｐ ｅｎｄａｎｔ）置換基を介して生物細胞にカップリングする方法を含んでいる。

これらの錯体は免疫検定法、分析細胞学、組織染色および画像処理におけるリポ ータ−分子として特にを用である（レイフ氏ほか細胞の自動マルチパラメーター 分析における計装および蛍光色素の開発）　Ｃ１１ｎｉｃａｌ江堕ｎ江Ｌ２３Ｌ 、　１４９２（１９７７）　　；　し４７氏ホカ（女性生殖路（Ｄ細胞の機器評 価についての標識）　Ｔｈｅ　　Ａｕｔｏｏ＋ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｌｔｅｒｉ ｎｅＣａｎｃｅｒ　ＣｔｏｌｏＬ　　ワイド、バージおよびバーテルス氏共版。

３１３〜３４５　ページ）。

１米Ｍｉ５−　−　ランクニド　イオンの有機および無機化合物との錯体、およ び生成錯体の工業的および生物学的環境におけるその後の利用については以前か ら報告されている。また、「配位化合物」として称される上記錯体は、特にラン タニド　イオンと負に帯電できるかまたはイオン的に中性にできる適当な配位子 との結合によって形成する。

ランクニド（Ｉ［ｌ）イオンに一坐配位子または二坐キレート配位子が配位した 錯体は掻めて不安定で、錯体および配位子−交換平衡をほとんど瞬間に達成する ことは知られている。それ故、ランタニド（Ｉ［ｔ）イオンおよび二坐キレート 配位子、例えばトリス（アセチルアセトナト）−ランタン（Ｉ［［）の極めて安 定な錯体を種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の混合物として溶液に存在しても、非錯化（溶 媒和（ｓｏｌνａｔｅｄ））金属イオンが相当量の割合で存在する。

溶成（ｆｕｓｅｄ）ポリキレート非環状配位子のランタニド錯体は幾分不安定で ないのに対して、環状配位子のランタニド錯体は比較的に不活性である。

ランタニド（Ｉｎ）−配位子錯体の安定性および不安定性は特定の使用および／ または環境に厳格に影響を受ける。特に、金属−交換および配位子−交換速度論 の時間の枠は、上記錯体を生物系にプローブとして用いる場合には、主として考 察されている。しばしば、潜在的に競合する配位子との接触を含む、こわらの系 に要求される稀薄水溶液または有機水溶液において、不安定である場合には、上 記錯体は解離する。この解離が生ずる場合、プローブの値が減少するか、または 失う。あるいは、水分子との相互作用による蛍光の振動急冷が生ずる。例えばエ バンゲリスタＲ，Ａ、氏（タンパク賞標識付けおよび時間分解蛍光定量応用にお ける新しいユーロピウム　キレ−）　）　Ｃ１１ｎｉｃａｌ−ＬＡ劇胆見ｊ山１ −　ｍ、１７３〜１７８（１９８８）に報告されているように、ジネガティブ（ ｄｉｎｅｇａｔｉｖｅ）陰イオン配位子４，７−ビス（クロロスルホフェニル） −１，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸（ＢＣＰＤＡ）はユーロ ピウム（ＩＩＩ）と蛍光錯体を形成する。しかしながら、この錯体はピコグラム または低濃度で存在する興味ある多くの検体を検定するのに必要とされる濃度で は検出することができない。ユーロピウム（ＩＩ）イオンのＢＣＰＩＩＡ錯体は 蛍光を消滅するのに十分な水を結合するから、試料を乾燥する不便な付加段階を 測定前に行う必要がある。更に、ＢＣＰＤＡユーロピウム（ＩＩＩ）１９体の量 子効率が比較的に低く、このためにホースラビＬＪ、およびダイアマンデスＥ、 Ｐ、氏（血清中のフォリトビンの時間・分解免疫蛍光定量法）且旦旦虹匹り紅旦 ■皿、Ｎ０１１、１８０１９８９）に報告されているように、多層系を形成する 中間段階としてキレートをチログロブリンに結合することによって、低濃度で存 在する検体に対する感受性を高める必要がある。

ソイニイおよびラブグリーン氏（ランクニド　プローブの時間−分解蛍光および バイオテクノロジーにおける応用）　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｉｅ ｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　Ｖｏｌ、１８．第２ 版、１０５〜１５４ページ（１９８７）　、およびソイニイおよびヘミラ氏（蛍 光分光器検定手段）米国特許第４３７４１２０号明細書（１９８３）には、ラン タニドの蛍光キレートの利用について報告されている。配位子はユーロピウム（ Ｉ［［）と強いが、しかも非蛍光の錯体を形成するＤＴＰＡ　（国際公開特許（ ＷＯ）第０３６９８号（１９８４））であった。この錯体は酸で解離しくヘミラ 氏はか（時間−分解免疫蛍光検定法における標識としてのユーロピウム）　Ａｎ ａｌ、　Ｂｉｏｃｂｅｏ＋、　１３５＋＋３３５〜３４３（１９８４）　　；お よび可ン容化ユーロピウムＣＩ［Ｉ）はミセル相においてベーターケトンと錯化 した。これらの解離−錯化段階は手順の複雑さを高め；蛍光測定の敏感さを制限 するキレートの濃度を低下させ；および結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｉｅｔ ｉｅｓ）からの発蛍光団の分離により立体情報を失う。特定の結合分子から蛍光 標識を分離するために、この技術は流動細胞計測法または顕微鏡による単細胞ま たは他の粒子の免疫蛍光または顕像測定に矛盾する。

制限される数のランクニド（ＩＩＩ）イオンの不活性で動的に安定な非機能化大 環状錯体の生成については、バ？カーーデイルクス氏ほかＪ、Ｃ，Ｓ、Ｃｈｅｍ 、Ｃｏｍｍ、　７７４（１９７９）の技術文献に報告されている、この文献に記 載されている合成法はランタン（Ｉ［Ｉ）およびセリウム（ＩＩ）の硝酸塩の存 在における２、６−ジアセチルピリジンとエチレンジアミンの金属鋳型（ｏ＋ｅ ｔａｌ　ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）シッフ塩縮合を含んでいる。しかしながら、縮合 について選択した条件ではランタン系列の重いメンバー（ｈｅａｖｉｅｒ　ｍｅ ｍｂｅｒｓ）から顕像錯体の生成に成功しなかった。これらの錯体の高い動的安 定性および稀薄水溶液における解離に対する抵抗のために、研究者は水性ＮＭＲ シフト試薬としての潜在的使用を提寓している。

金属鋳型縮合技術によるランクニド（ＩＩＩ）の動的に安定な大環状錯体の合成 は、最近、放射性プロメチウム＋６１Ｐ＠を外いて、ランタン系列中のすべての 元素を包含するように開発されている。

既知の非機能化（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）大環状錯体について の他の文献を列挙する。リス）Ａは発明者のうちの少なくとも一人による文献を 含んでいる。リストＢは他の研究者による文献を含んでいる。

ニス上人 り、デ　コラ、　Ｄ、Ｌ、スマイルスおよびり、　Ｍ、バラリノ氏、×Ｃｏｎｖ ｅ　ｎｏ　Ｎａｚｉｏｎａｌｅ　Ｄｉ　Ｆｏｔｏｃｈｉｍｉｅａ　　４ページ（ １９８５）　　’Ｅｕ（ＩＩＩ）およびＴｂ　（Ｉ［［）の陽イオン大環状錯体 の発光特性におけるヘテロ配位子の作用」 Ｌ、デ　コラ、　Ｉ）、Ｌ、スマイルスおよびり、Ｍ、バラリノ氏。

１部ユｌ幻■旦」≧１色ム」ＸＪｗエ　１ｌＬＬｌ　−Ｌ２（１９８５）　　ｒ ウラニル　イオンの新規な大環状錯体の金属−鋳型合成」Ｌ、デ　コラ、　Ｄ、 Ｌ、スマイルスおよびり、Ｍ、バラリノ氏。

Ｉｎｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　　　益１７２９（１９８６）　’ラン クニドのヘキサアザ（ｈｅｘａａｚａ）大環状錯体」 Ｇ、ボンビエリ、Ｆ、ベネトロ、Ａ、ボロ、Ｌ、デ　コラ、　Ｄ、Ｌ、スマイル スおよびＬＪ、バラリノ氏、　　Ｉｎｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒ　 ＋　ＩＪ１１２７（１９８６）　ｒルテチウム（Ｉ［［）のヘキサアザ大環状錯 体の合成、特性および結晶構造」 Ｎ、サバチニイ、Ｌ、デ　コラ、　Ｌ、ｌ’１．バラリノおよびＧ、ブラッセ氏 、　Ｊ、　ｈ　ｓ、ｃｈｅｓ、　　　９Ｘ、４６８１〜４６８５（１９８７）、 、’Ｅｕ　（ＩＩＩ）ヘキサアザ大環状錯体［Ｅｕ（ＣｚＪｚ＊Ｎｉ）　（ＣＨ ３ＣＯＯ）　］（ＣＨｓＣＯＯ）ＣＩ”　２ＮｔＯにおける放射性および非放射 性転移」 Ｇ、プラッセ、Ｌ、デ　コラ、Ａ、ポロ、Ｉｌ、Ｌ、スマイルスおよびり、Ｍ、 バラリノ氏、鳳］お山し恒旺肚り可」口１匹Ｌ　川、９５（１９８７）　ｒラン タニド　イオンの存在における２、６−ジアセチルピリジンおよび１，２−ジア ミノベンゼンの縮合」Ｆ、ベネトロ、Ｇ、ポンビエリ、　Ｗ、　Ｔ、ハウキンス 、Ａ、ポロおよびり、Ｍ、バラリノ氏＋　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｏｒ 　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ１９３（１９８７）　　ｒＹ（ＩＩＩ）大環状錯 体の合成、構造および特性」Ａ、ボロ、　ＩＲ，ファブリアノおよびり、］’！ 、バラリノ氏。

Ｖ”　°Ｊｏｕ　　ａ　　　Ｓ’ｅ　　　　、１１．１４０（１９８Ｂ）’１８ −クラウン−６の第６−窒素類位体のランクニド錯体」Ｗ、Ｔ、ハウキンス、Ａ 、ボロおよびり、Ｍ、バラリノ氏、　　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ　　１９＋　３６（１９Ｂ？）　　’イツト リウム＜ｍ＞の第６−窒素−供与体大環状錯体の合成」ニス１旦 ＾１Ｍ、アリフ、　Ｊ、Ｄ、Ｊ、バッカー−ディルクス、　Ｃ，Ｊ、グレー、Ｆ 。

Ａ、ハートおよびＭ、Ｂ、バーストユース氏、Ｌ工ｈｅｍ　Ｓ匹エエ１６６５（ １９８７）　ｒ大環状ヘキサンのランタニド硝酸塩との錯体の合成、Ｘ−線構造 および特性ｊ Ｋ、に、アビドおよびり、Ｅ、フェントン氏、江肛■旦ｃａ　　Ｃｈｉｍｉｃａ 紅立、　８２．２２３〜２２６（１９８４）　　ｒ２，５−フランジアルデヒド およびα、ω−アルカンジアミンから誘導した大環状ランタニド錯体の合成」 Ｂ、ボンビエリ氏、ｎ虹…■組」肚畦■」■紅１３９．２１〜３２（１９８７） 　ｒアクチニドおよびランタニド配位化合物の構造化学における新しい傾向」 一、ラテッカーパリゼック氏、　Ｉｎｏｒ　ａｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃ ｔａ　１０９＋Ｌ２１〜２３（１９８５）　ｒセリウム（■）、プラセオジウム （ＩＩりおよびネオジウム（ＩＩＩ）硝酸塩のヘキサアザ１Ｂ−員（＋＋＋ｅｗ ＋ｂｅｒｅ５）大環状錯体の鋳型合成および特性化」 Ｋ、に、アビドおよびり、Ｆ、フェント、ン氏、　１ｎｏｒ　ａｎｉｃａ　Ｃｈ ｉｍｉｃａ紅旦工９５．１１９〜１２５（１９８４）　　ｒピリジン−２，６− ジカルボキシアルデヒドおよびα、ω−第一ジアミンから誘導したある大環状シ ッフ塩基のランタニド錯体」 Ｗ、ラテツカーパリゼック氏、　　Ｉｎｏｒ　ａｎｉｃａ　Ｃｈｉ＋＊ｉｃａ　 Ａｃｔａ４５、　Ｌ１４７〜１４Ｂ（１９８０）　　ｒランタン（ｍ）過塩素酸 塩の１８．員ヘキサアザ大環状錯体の鋳型合成および特性化」Ｖ、に、マンチア ンダおよびＣ，Ａ、シャング氏、　　Ａｎａ　　Ｃｈｅｗ。

８１３〜８１８（１９８７）　　ｒイオン化性大環状配位子およびテノイルトリ フルオロアセトンによるユーロピウム（■）、イッテルビウム（ＩＩ［）および ルテチウム（Ｉｎ）の溶剤抽出研究」−、ラテッカーバリゼック氏＋　　Ｉｎｏ ｒ　ａｎｉｃａ　Ｃｂｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ＋２５、２６１〜２６Ｂ（１９８１ ）　　ｒランタニドと２．６−ジアセチルピリジンおよびヒドラジンとの反応に おいて形成した大環状および開環錯体の合成および特性化」 Ｅ、Ｅ、フェントンおよびＰ、Ａ、ビガド氏、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｒｅｖ、　 、　１７＋６９〜９０（１９８Ｂ）　ｒランタニドおよびアクチニドの大環状シ ッフ塩基錯体」 リストＡに示したバラリノ氏の文献に記載している合成において、大環状錯体は ２．６−ジアセチルピリジンおよび１．２−ジアミノエタン（エチレンジアミン ）の金属鋳型縮合によって放射性プロメチウムを除いて、すべてのランタニド（ ＩＩＩ）イオンから作られている。重質（ｈｅａｖｉｅｒ）ランタニドから大環 状錯体を作るバラリノ技術の成功は反応媒質に存在する特定の対イオンによって 影響されると思われる。特に、バラリノ氏が上述する硝酸塩または過塩素酸塩の 代りに、ランタニド　アセテートの存在において金属鋳型縮合を行った場合に、 大員環（Ｉｌｌａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ）の形成がルテチウムに展開され、更に生 成錯体の著しく改善された収率および純度が達成されている。それ故ランクニド 　イオン源としてランタニド　アセテートの使用は好ましいものとされている。

バラリノ氏により得られた大環状錯体は細胞学的試料の染色について適当である 稀薄水溶液における解離に対する動的安定性および抵抗を示している。これらの ランタニド大環状錯体の画像科学への、および蛍光免疫検定法への適用には、生 物基質にまたは他の反応基および／または存在物（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）にカンプ リングする誘導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）が要求される。かかる機能 化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）については、まだ報告されていない 。

工業的および生物学的環境におけるランタニドの独特の特性の開発について他の 試みがされている。いずれの場合においても、ランタニド（Ｉ［［）イオンをキ レート配位子と結合させている。あるプロセスは、固相および液相蛍光顕微鏡に おいて適当に報告されている１時間−ゲー）　（ｔｉ＋ｎｅ−ｇａｔｅｄ）　Ｊ 蛍光検出システムにおけるランタニド−配位子錯体の使用を含んでいるか、また はこれに関係している。米国特許第４３５２７５１号明細書にはランタニド　イ オンと種−結合ジアミン四酢酸のキレート化、およびこのキレートの増感剤との 使用について記載されている。

増悪剤はこれらのランタニド　キレートの蛍光励起収率を高めるのに用いられて いる。更に、ランタニド　キレートは、いわゆる、標的分子、すなわち、関与す る検体を免疫化学的に模擬する化合物を結合することによって誘導化でき、この ために検体に特定の抗体に関与する検体と競合する（ｃｏ＋＋＋ｐｅｔｅ）こと ができる。

また、キレートの誘導化はキレートに結合したと報告された「スペーサー」単位 の存在を企図するもので、他の誘導化または標的分子への付着の点として作用す る。「スペーサー」単位の使用は、キレートが「生物学的に活性の標的分子」、 すなわち、治療薬、酵素、ホルモン、ペプチドおよび免疫検定法により検定する 他のタイプの巨大分子と用いることが望ましいとされている。しかしながら上述 する米国特許第４３５２７５１号明細書にはどのタイプのスペーサ一単位を使用 する場合に、その選択についての基準が比較的に情報価値がないか、およびどの ような条件下でキレートが上記スペーサ一単位の結合に適切に変えることができ るかが記載されている。

関連する好結果がランクニド　イオンについてのキレート剤として種−結合ジア ミン四酢酸化合物であることを米国特許第４３５２７５１号明細書に報告してい るにもかかわらず、他の改良として生物分析環境の使用に、特に免疫検定法につ いてのランタニド−配位子錯体の開発が必要とされている。特に、動的安定性お よび所望とする物理的特性を実質的に変えることなく、生物学的活性材料に適合 （共役）しやすくできるランタニド組成の必要性がある。所望の特性としては、 例えば、蛍光プローブとして意図する錯体についての高い蛍光励起収率および適 当な寿命、または生体内の磁気共鳴対照液として意図する錯体についての水のプ ロトンに対する高い緩和性（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を包含している。

本発明は従来技術の欠点を解決するためにランクニド、アクチニドまたはイツト リウム　イオンに結合する一連の水溶性ヘキサ−アザ−大環状錯体（以後、「大 環状錯体」と称する）を提供することであり、この場合上記錯体は抗体または抗 原のような生物学的活性分子に、または直鎖または架橋多糖質のような生物学的 に適合性のイオン的に帯電しない（ｉｏｎｉｃａｌｌｙｕｎｃｈａｒｇｅｄ）巨 大分子に結合／共役しやすくできる高い動的安定性およびペンダント官能基を保 有している。官能基は縮合反応の前または後に大環状構造に結合することができ る。更に、大環状錯体はその意図する用途に必要な特性を存している０例えば、 ユーロピウム（Ｉ［［）およびテルビウム（Ｉ［ｌ）は適当なエンハンサ−との 相互作用によって実質的に高めることのできる長期間持続する蛍光強さを保有す るのに対して、ガドリニウム（ＩＩＩ）の錯体は高い緩和性を保有している。

二里Ω皿！ 金属中心としてランクニド、アクチニドまたはイツトリウムイオンを有し、かつ 表面カップリング＠能性を有する本発明の大環状錯体を次の一触式１および■で 示すことができる０式１においては、置換基Ｑが大環状環に直接に付着し、およ び式■においては、置換基Ｑが芳香族部分に付着している。

式ｌ 式■ 上記式Ｉおよび■において、 Ｒは水素、メチル、直鎖アルキルまたは側鎖アルキル；アリール−置換アルキル 、アリール、およびアルキル−置換アリールからなる群から選択する置換基（但 し、上記置換基が生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中、錯体の環化 を妨げるという条件で）を示し； Ｍは原子番号５７〜７１０ランクニド、原子番号８９〜１０３のアクチニドおよ び原子番号３９のイツトリウム（Ｉ［［）からなる群がら選択する金属イオンを 示し： ＸはＸでし示す位置においてピリジン、チオフェンまたはフランからなる群から 選択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄または酸素を示し； Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール 置換アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル−置換子り−ルからなる群 から選択する置換基（但し、上記置換基の基が置換基と架橋結合部分との間にカ ップリング官能性を与える受容体分子または相当する受容体分子である存在物に より誘導化することができるという条件で）を示し；ｎは２または３の整数を示 し； Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン化物、ニトレート 、バークロレート、チオシアネートおよびピクラートを包含する負に帯電したイ オン（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｈａｒｇｅｄｉｏｎ）　（但し、陰イオンが生 成錯体の溶解性を制限しないか、またはカップリング処理または蛍光を導びくエ ネルギー移動を妨げるという条件で）を示し； 鋼は大環状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し：および ｙは大環状錯体における対イオンのイオン電荷を示す。

上述する大環状錯体は２．６−ジカルボニルピリジンまたはそのフランまたはチ オフェン類似体と１．２−ジアミノエタンとの、まニル−またはジアミノ−前駆 物質とのランタニド、アクチニドまたはイツトリウム鋳型環状シッフ−塩基縮合 によって作ることができる。あるいは、またカップリング官能性を次の反応に加 えることができる。

機能化ジアミノ−前駆物質は置換α−アミノ酸を相当する１゜２、ジアミノエタ ン誘導体に転化することによって作ることができる。アミノ酸が還元またはアミ ノ化に敏感な他の官能基を有する場合には、これらの基を普通のように保護する 。

一旦、機能化１，２−ジアミノエタン誘導体が生成すると、この誘導体を２．６ −ジカルボニル−ピリジンまたはそのフランまたはチオフェン類似体と、および ランタニド、アクチニドまたはイツトリウム　イオンの塩、好ましくは酢酸塩と 反応させる。金属イオンは、ジカルボニル化合物と１．２−ジアミノ誘導体の環 状２：２縮合についての幾何学的鋳型を与える。この縮合はメタノールまたはエ タノールのような無水アルコールにおいて行うのが好ましい０反応生成物、特に ランタニド、アクチニドまたはイツトリウム大環状錯体を、真空蒸発によって反 応媒質から固体残留物として回収する０次いで、固体残留物を再結晶して結晶生 成物を得、この組成および構造は所望の大環状錯体に相当することを化学および 分光分析によって確めた。

機能化ジカルボニル前駆物質は相当する機能化複素環から文献に記載されている 適当な方法で作ることができる。必要に応じて、官能基はジカルボニル誘導体に 転位する前に保護する。

次いで、機能化ジカルボニル化合物を１．２−ジアミノエタンと鋳型として金属 塩の存在において上述する条件下で反応させて複素環部分において機能化した金 属−大員環を生成する。

大環状錯体は各中心金属イオンの独特の特性によって、錯体の他の成分によって 、およびランタニド　イオンと錯体の任意の他の成分との相互反応によって影響 される多くの用途を有している。

ペンダント官能基は、更に生物学的活性分子、例えば抗体、抗原、結合タンパク 質、多糖類および／または関連する検体と反応（共役）する０次いで、この共役 体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を分析処理、例えば蛍光免疫検定法に；生物生成物、 例えば細胞、タンパク質および低分子量物質の確認に；組織学的染色に；核磁気 共鳴または抜機形成（ｎｕｃｌｅａｒ　ｉｍａｇｉｎｇ）に；および免疫療法に 用いる。特に、本発明における共役体は標準診断像実験計画案（ｓｔａｎｄａｒ ｄ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｉｗ＋ａｇｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）による標 的組織の生体内の観察および／または標識付けのために受容体に投与する注射液 として；あるいは、また特異抗原に関連する疾患、すなわち新生組織形成および 自己免疫疾患の治療に用いることができる。

の　　商　　　　　　２５．・ヨ 本発明の大環状錯体は二三の有意な点において独特のものである。ランタニド、 アクチニドまたはイツトリウム　イオンの他の錯体は別として、定められている 特性の組合せとしては、稀１水溶液における動的不活性（化学的安定化）；反応 能力、すなわち、直接または中間架橋部分を介しての生体分子、すなわち、抗原 、抗体、架橋タンパク質などに共有的に結合することによって反応する能力；お よび合成の容易さを包含している。

錯体のそのペンダント官能基を介しての所望基質への共役は、実際上、制限を受 けない。更に、この共役は非機能化類似体に比べて、錯体の蛍光挙動、緩和性ま たは動的安定性に悪影響を与えることなく作用する。

本発明の錯体は一般に入手しうる材料から作ることができ、または確立されてい る合成手段およびその適応により一般に入手しうる出発材料から合成することが できる。上述するように、本発明の主目的の一つは（１）機能化１，２−ジアミ ンと２，６−ジカルボニルピリジン、またはそのフランまたはチオフェン類似体 との、および（２）機能化ジカルボニルピリジン、フランまたはチオフェンと１ ，２−ジアミノエタンとの金属鋳型シッフ−塩基縮合によって、上記錯体、すな わち、大環状ランタニド、アクチニドまたはイツトリウム錯体を生成する合成方 法を提供することである。シッフ−塩基縮合反応に関係しないジアミンまたはジ カルボニル前駆物質の機能化部分はタンパク質または多糖材料に対する後カップ リングとの相客性を与えるように選択する。

これらの大環状錯体の合成は２，６−ジアセチルピリジンまたは２゜６−シホル ミルピリジンおよび１，２−ジアミノエタンのランタニド鋳型縮合について技術 を達成する。しかしながら、機能化ジアミンまたはジカルボニル前駆物質による 上記合成を達成する能力はこのプロセスに独特のものであり、大員環を生物学的 に和　　゛合性の合成巨大分子にカップリングすることができ、また「生体分子 」、すなわち、細胞表面標識、ポリペプチドまたは遺伝ポリヌクレオチド配列と して分類することができる。このカップリングは大員環の未反応カップリング官 能性を介して、またはかかるカップリング官能性に付着する架橋部分を介して行 われる。

本発明における１つの好適例において、機能化１，２−ジアミノエタンを置換ア ミノ酸から次の一般的な反応プロセスによって得ることができる。先づ、置換ア ミノ酸を相当するメチル　エステル塩酸塩に無水メタノールおよび塩化水素ガス によって転化する。更に、このエステル中間体をガス状アンモニアと無水メタノ ール中で反応して相当するアミド塩酸塩を生成する。次いで、このアミド塩酸塩 を遊離アミドに、無水テトラヒドロフラン中でのアンモニアによる反応によって 変える。必要に応じて、カップリング結合として用いるペンダント官能基を文献 に記載されている多くの保護基のうちの１種の保護基を用いて保護する。次いで 、この保護遊離アミドを硼化水素／テトラヒドロフランまたは水素化リチウムア ルミニウム／テトラヒドロフランで還元し、次いで酸加水分解して機能化ジアミ ン塩酸塩を生成する。このジアミン塩酸塩を塩基、例えばナトリウムメトキシド または水酸化カリウムと無水メタノール中０°Ｃで反応して遊離ジアミンに転化 する。上述する基準を満たす置換アミノ酸には、例えばチロシン、アミノフェニ ルアラニン、リシンおよびその類似体、シスチン、システィンおよびセリンを包 含する。

本発明の他の例において、機能性ジカルボニル前駆物質を３−ヒドロキシピリジ ンから次のプロセスによって作ることができる。３−ヒドロキシピリジンをホル ムアルデヒド（水中３７χ）と強塩基（水酸化ナトリウム、Ｎａ０Ｈ）の存在で ９０’Ｃで反応して３−ヒドロキシ−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジ ンを得る。

次いで、得られた３−ヒドロキシ−２，６−ビス　（ヒドロキシメチル）ピリジ ンを炭酸カリウム（ＬＣ（ｈ）の存在において酸化マンガン（ＩＶ）で酸化する 。最終生成物を酸化して２，６−シホルミルピリジンの塩酸塩を得る。

次に示す構造式はこれらの錯体の製造に適当なある材料を示紅　ジカルボニル　 １ 上記式中、ｎは２〜３の整数を示し；χはχで示す位置においてピリジン、チオ フェンまたはフランからなる群から選択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄 または酸素を示し；Ｒは水素、メチル、直鎖または側鎖アルキル、アリール−置 換アルキル；アリール、およびアルキル−置換アリールからなる群から選択する 置換基（但し、上記置換基が生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中、 錯体の環化を妨げないという条件で）を示し；およびＱは機能化メチル、機能化 直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール−アルキル、機能化アリー ルおよび機能化アルキル−アリールからなる群がち選択する置換基（但し、上記 置換基の基が置換基とブリッジ／結合部分との間にカップリング官能性を与えて 受容体分子または相当する受容体分子である存在物（ｅｎｔｉｔｙ）により誘導 化することができるという条件で）を示す。

特に上述する環構造はピリジン、フランおよびチオフェン環を含んでいる。

Ｌ　童】しＬ虹Ｚ鵠− （ｎ）、　（ｙ）。

上記式中、Ｍは原子番号５７〜７１０ランタニド、原子番号８９〜１０３のアク チニドおよび原子番号３９のイツトリウム（ＩＩＩ）からなる群から選択する金 属イオンを示し；Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン 化物、ニトレート、バークロレート、チオシアネートおよびビクラートを包含す る負に帯電したイオン（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｈａｒｇｅｄ　ｔｏｎ）　（ 但し、上記陰イオンが生成錯体の溶解性を制限しないか、またはカップリング処 理または蛍光を導びくエネルギー移動を妨げるという条件で）を示し；ｍは大環 状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し；およびｙは大環状錯体における 対イオン電荷を示す。

上記式中、Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能 化アリール−アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル−アリールからな る群から選択する置換基（但し、置換基のグループが置換基と架橋／結合部分と の間にカップリング官能性を与えて受容体分子または相当する受容体分子である 存在物により誘導化することができるという条件で）を示す。

金属鋳型シッフ塩基環化はただ１種の機能化前駆物質；ジカルボニル化合物また はジアミンを含む、ジアミンに付着したＱを有する前駆物質から誘導した機能化 六環性化合物は式ｌの構造を有する化合物を生ずる。複素環部分に付着したＱを 有する前駆物質から誘導した機能化大環状化合物は式■の構造を有する化合物を 生ずる。

Ｑがジアミン前駆物質に付着した（４−アミノフェニル）メチル基である式１の １例の種は次の式で示すことができる：Ｑがジアミン前駆物質に付着した（４− ヒドロキシフェニル）メチル基である式ｌの他の例の種は次の式で示すことがで きる：Ｑがジカルボニル前駆物質の複素環に付着したヒドロキシ基である式■の １例の種は次の式で示すことができる：、ｐＨ くへ・ 〔Ｉ　〕 、＋、ｒｎＪｒ、　　　　　　（ｙ７つニー−＋１１＋＋ ・′ｉ゛パ・Ｎ Ｈヲし〕ご−２ｒ〕＼Ｈ この前駆物質によって生成した大環状錯体は補正および分光分析特性によって結 晶質固体として分離する。多くの化合物は溶媒和物として分離する。

所望の特異性を達成するために、本発明の錯体を、（１）関連する検体にだけ結 合するために標的にすることができ、および／または（２）ＭＨＩ対照液として 用いるために溶液における回転速度（ｔｕｍｂｌｉｎｇ　ｒａｔｅ）を減少する ことができる反応基質、生体分子または生体和合性または合成巨大分子に共有的 に結合する。

上記（１）の場合には、検体は相補的結合相手が存在する関連する任意の化合物 にすることができる。関連するかかる検体は自然に生ずるかまたは合成すること ができ、一般に生理活性を有する化合物である。これらの検体は分子量によって 都合よく分類される。かかる検体の１つのグループは約１２５〜２０００ダルト ンの範囲の分子量を有する化合物からなり、広範囲にわたる種々の薬剤、僅かな ポリペプチド、ビタミン、酵素基質、補酵素、農薬、ホルモン、脂質などを包含 する。しばしば、化合物は「パブテン」と称される。これらの化合物としてはレ チノール、ビタミンＫ、コバラミン、ビオチン、葉酸塩、エピネフリン、プロス タグランジン、チロキシン、エストロゲン、コルチコステロン、エクジソン、オ キシトシン、ソマトスタチン、ジギトキシン、アスピリン、ペニシリン、ヒドロ クロロチアジド、キニジンおよびジフェニルヒダントインを包含する。

他のグループの検体はポリ　（アミノ）酸またはポリペプチド、タンパク質、多 糖類、核酸、およびその混合物のような２０００ダルトンまたはこれ以上の分子 量を有する化合物、例えばグリコサミノグリカン、糟タンパク質、リポソームな どからなる。化合物としては、例えばタンパク質、例えばアルブミン、グロブリ ン、ヘモグロビン、ブドウ糖菌タンパク質Ａ、α−フェトプロティン（ｃｒ　− ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、レチノール−結合タンパク質、免疫グロブリン、ア ビジン、ストレプタビジン（ｓ　ｔｒｅｐ　ｔａν１ｄｉｎ）、Ｃ−反応性タン パク質、コラーゲン、ケラチン、酵素、Ｔ−およびＢ−リンパ球における細胞表 面抗原、すなわちＣＤ−４およびＣＤ−８タンパク賞、および最近使用されてい るＣＤ命名法に記載されているような白血球細胞表面抗原の残部（ｒｅｓｔ）　 ；　Ａ、　ＢおよびＲｈのような血液型抗原；クラス１および２の主な組織適合 性；発ガン遺伝子生成物；腫瘍関連抗原、例えばガン胎児性抗原；毒素、例えば コレラ毒素、ジフテリア毒素、ボッリヌス毒素、ヘビ毒素、テトロドトキシン、 サキシトキシン；レクチン、例えばコンカナバリン、小麦胚凝集素、大豆凝集素 ；ポリシアリン酸（ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ）　、キチンなどを挙げる ことができる。

像形成（ｉｍａｇｉｎｇ）または治療のための大環状錯体に結合する生体分子は 、一般に特異標的作用を行うように選択する生体分子である。１例において、生 体分子は選択された細胞表面標的部位に対して特定される単クローン性抗体また は抗体フラグメントである。これらの抗体は一般に入手することができ、または 周知の技術によって作ることができる。また、血清アルブミンのような他の血清 タンパク賞腫瘍局在化についての金属−キレート共役体におよび放射線像形成に 有利に用いることができる（Ｃ，Ｓ、Ｈ，レウング氏ほか’Ｉｎｔ、Ｊ、Ａｐｐ １．Ｒａｄ、　　Ｉ　ｓＪ　２９　：　６８７（１９７８）。

非標的核磁気共鳴像形成の他の例において、大環状錯体に結合する生体適合性巨 大分子は、−ｉに体温において水溶液中で遅い回転速度を有する大きい分子量お よびかさくｂｕｌｋ）の水溶性高分子化合物中から選択する。例えば多糖類およ びポリペプチドを示すことができる。

機能性大員環を所望の基質にカンプリングすることは、直接に、または大員環の 官能基を基質の適当な反応基に結合することによって達成することができる。ま た、カンプリングは間接的に基質に共有結合する二官能性架橋剤を用いることに よって、または基質に対して高い親和性を有する他の分子に大員環を結合するこ とによって達成することができる。ビオチンをアビジンまたはストレブタビジン で結合する親和性は、マウス単クローン性抗体によるヤギ　アンチ−マウス免疫 グロブリンのように周知の例である。

機能性大員環の直接カップリングは次の式で示すことができる： 上記式中、Ａは大環状錯体の末端反応基と反応性生体分子または特定の反応性対 （ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐａｉｒ）の員（＋＋＋ｅｍｂｅｒ）との間の結合基を示 し；ａはＯ〜１の整数を示し；およびＺは反応性生体分子または特定の反応性対 の員を示す。

血清タンパク質は、天然の（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質に存在するカルボニル、 アミンまたはチオール基を介して大環状錯体に直接に結合する０例えば、アミン 、機能化大員環を水溶性カルボジイミドの作用によってタンパク質のカルボニル 基に直接に結合して安定な架橋結合を形成することができる。逆のオーダ（ｒｅ ｖｅｒｓｅ　ｏｒｄｅｒ）の同じ反応が、カルボキシル−機能化大員環をタンパ ク質の遊離第一アミン基とカンプリングさせる。スルホヒドリル−機能化大員環 はゆるやかな酸化によって遊離チオール基（システィン）を含有するタンパク質 に結合して安定なジスルフィド結合を形成することができる。あるいは、また抗 体または抗体フラグメントを含む多くのタンパク質の場合には、遊離スルホヒド リル基は、例えばジスルフィド試薬によって共役前に還元することによってジス ルフィド結合から形成することができる。大環状錯体のアミノ官能基の亜硝酸処 理は、タンパク質におけるチロシン部分と反応できてジアゾ結合を介して結合を 形成する相当するジアゾニウム　イオンを生ずる。また、大員環のアミノ基はチ オホスゲンによる処理によって相当するイソチオシアネートに転化することがで き、次いでイソチオシアネートはチオ尿素結合を介してカップリングすることに よってタンパクと直接に反応する。このカップリング反応はＣ，Ｆ、メアレス氏 ほかＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ユ４２．６８（１９８４）に記載されている。

なお、他の反応は第一アミノ基とアルデヒドを縮合してシッフ塩基結合を形成す ることを含んでいる。大環状錯体の官能基がタンパク質と、またはその還元スル ホヒドリル基と直接に反応する場合、大環状タンパク質リンカ−（ｐｒｏｔｅｉ ｎ　１ｉｎｋｅｒ）の長さは、丁度大員環の官能基の長さである。

機能化大環状錯体の生体分子または生物学的に和合性の巨大分子への間接的なカ ップリングは、種々の一般に入手しうる架橋基（リンカ−）の使用によって達成 できる（例えばｒＰｉｅｒｃｅ）１ａｎｄｂｏｏｋ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　 Ｃａｔａｌｏｇ　Ｊ　２２２〜２５０ページ（１９８Ｂ）参照）、かかる架橋剤 を用いる場合には、大員環基質リンカ−の長さは実質的にそれ自体の架橋剤の長 さである。この使用の例については米国特許第４６７８６６７号明細書（実施例 ■）に記載されており、この米国特許明細書には金属−錯化剤ｐ−ブロモアセト アミド−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ　’　、Ｎ″″−四酢酸（Ｔ）：ＴＡ）をタンパク質−反応性試薬２−イミノ チオラン（２−ｉｓｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）を用いて抗体にカップリングして 比較的に長いリンカ−を形成する方法が報告されている。

他の反応において、大環状錯体のアミン官能基をブロモアセチルプロミドのよう な試薬でアシル化して遊離タンパク質のアルキル化を容易にする反応性ブロモア セトアミド基を形成して所望のタンパク質／錯共役（ｃｏｓｐｌｅｘ　ｃｏｎｊ ｕｇａｔｅ）を形成する。

また、カップリングは非共有結合が関連する特定の結合対の１員と大環状錯体と の間に形成する場合に、間接的に形成することができる。この間接技術の場合、 関連する特定の結合対置の１つの存在は、その種および大員環の両者に結合する 中間種を用いて検定する０例えば、大環状錯体をアビジンに共役する場合には、 ビオチンを大環状錯体に共有的に共役し、生成するビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎ ｙｌａｔｅｄ）大環状錯体がアビジンと結合し、これによってアビジン標識付さ れた大環状錯体を生ずる。アビジン−結合大員環のビオチン化（ｂｉｏｔｉｎａ ｔｅｄ）基質への逆のカップリングを同じ程度に形成でき、多くのビオチン化生 体分子を一般に入手する場合に有利である。この非共有カップリングは他の手段 に利用することができる０例えば、大員環を、第２抗体に対して反応し、更に関 連する抗原と反応する第１抗体に共有的に結合することができる。また、ビオチ ン−アビジンまたはストレプタビジンービオチン錯体の利点には、この補足的対 （ｃｏｍｐｌｅ＋ｍｅｎｔａｒｙ　ｐａｉｒ）の員を大員環に共有的に結合し、 他の員を抗体に共有的に結合する。

また、本発明の大環状錯体は、関連する検体を少なくとも免疫化学的に模擬でき る他の試薬と反応することができる。関連する検体に影響するが、広範囲るわた る種々の大環状錯体を、多くの場合２０００ダルトンの低分子量化合物である上 記他の試薬に共役するのに用いることができる。大員環をかかる試薬に直接にま たは間接にカップリングする方法は、一般に、大員環をタンパク質および他の基 質にカップリングすることについて上述している。

本発明の大環状錯体の主な使用は、大環状錯体が蛍光標識（リポータ−分子）と して作用する免疫検定または競合的タンパク質結合検定の分野である。蛍光標識 として特に興味ある大環状錯体はユーロピウム（ＩＩＩ）またはテルビウム（Ｉ ［Ｉ）イオンを含有する。これらの各大環状錯体は２８０〜３６０ｎ−の範囲に おける励起エネルギーを吸収する０発光は全く狭い、半一バンド幅、約４ｎ−で あり、電磁スペクトルの可視範囲に生ずる。もっとも強い発光は、ユーロピウム （Ｉ［［）の場合、約６１５ｎ−および６８０ｎｌ１％およびテルビウム（ＩＩ Ｉ）の場合、約５４５１である。好ましい大環状錯体は蛍光強さを高めるある増 感剤と組合せて用いることができる。例えば、Ｅｕ（ｍ）大環状錯体の光応答性 （ｐｈｏｔ。

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）を、錯体と結合するアセテート　イオンの置換 によって、１．３−ジフェニルプロパン−１，３−ジオン（ジベンゾイルメタン ）、　４，４．４−　）リフルオロ−１−（２−チェニル）−ブタン−１，３， ジオン　２−ピコリン酸、２−フラン酸または２−チオフェン酸の陰イオンによ って高めることができる。　Ｔｂ　（ＩＩ［）大環状錯体の場合には、蛍光の増 強はアセテートをアセチルアセトネートおよびそのフルオロ−誘導体で置換する ことによって得られる。大員環のペンダント官能基は、蛍光構造を検体、検体模 擬または受容体（抗体）に共役することができる。多くの場合、選択の抗体はＩ ｇＧフラクシッン、他の抗体、例えばＩｇＡ、１ｇＤおよびＩｇＥであり、また ＩｇＭは検定の目的物に影響するが、適当に用いることができる。更に、種々の 天然に生ずる受容体、特にアビジンのような高い結合特異性ををする受容体を用 いることができる。受容体または大環状錯体のビオチニル化によって、広範囲に わたる種々の分子をアジピンを介して結合することができる。生成する共役体は 多くの蛍光検定に用いることができる。

電子配置４ｆ’〜４ｆ１３を有するランタニドの、特にカドリニウム（ＩＩＩ） （４ｆ’）の常磁性は、核磁気共鳴実験において水のプロトンの緩和時間に影響 を及ぼすことがよく知られている。この作用は、従来において生体内核磁気共鳴 像形成の感受性を高めるのに用いられており、例えば米国特許第４６７８６６７ 号明細書第１欄第１２〜６８行に記載されている０本発明の大環状錯体は、水性 媒質において、ガドリニウム（Ｉ［［）−）リエチレンジアミン五酢酸の塩のよ うな従来この目的のために用いられていた化合物より優れたＭＨＩ対照液として の本来の感受性を得ることができる。

更に、機能化大員環の生体分子または生体適合性巨大分子、特に線状または架橋 多１１１Ｍへの結合から生ずる溶液回転速度の緩延によって主として付加的な感 受性を高めることができる。

また、共役しうる大環状構造は、超ウラン元素を含む５ｆ−ブロック元素（ｂｌ ｏｃｋ　ｅｌｅｏ＋ｅｎｔ）のイオン、およびイットリウム（Ｉ［［）のイオン の放射性同位体を含んでいる。これらの元素の放射性発光はα−粒子、核分裂片 、β−線、陽電子およびＴ−線を含んでいる。新生細胞または他の選定細胞の特 異的キラー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｋｉｌｌｉｎｇ）はこれらの細胞に付近の放射 性元素を適当な標的生体分子に結合する大環状構造を介して達成することができ る。放射能が強いＴ−線のように長い範囲である場合には、また金属−大員環を 像形成のためのリポータとして用いることができる。

肚の　の 上述するように、本発明の大環状錯体は広範囲にわたる種々の水性溶剤、水の混 合物、水相容性溶剤、例えばジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホ キシドおよび低級アルキルアルコール、およびジエチルエーテルまたは炭化水素 以外の多くの非水性有＠溶剤において独特である。更に、これらの大環状存在物 は稀薄水溶液に解離しなく、また、酸、塩基または競合配位子（ｃｏｍｐｅｔｉ ｎｇ　ｂｉｇａｎｄｓ）の存在でもランタニド、アクチニドまたはイツトリウム を放出しない優れた動的安定性を保有している。強い蛍光を必要とする場合には 、錯体をあるエンハンサ−と組合せて励起を最大に高めることができ、およびエ ネルギーを蛍光色素イオンに移転し、溶剤による消滅に対する付加保護度を得る ことができる。最後に、これらの１つの生成反応によって得られる官能性は、検 体模擬または受容体、直鎖または側鎖多糖類、または予備形成機能化重合体のよ うな任意の適当な天然または合成基質による大員環の誘導化の付加能力を与える 。金属−イオン蛍光を示す大環状錯体の場合、この誘導化は活性電磁放射の吸収 効率および／または吸収種から錯体のランクニド　イオンへのエネルギー移転を 実質的に変えないで達成することができる。磁気共鳴対照液として用いるガドリ ニウム（ＩＩり大員環の場合には、大きい分子量の水相容性基質による誘導化が 溶液における常磁性種の回転速度を徐々に下げることによって緩和性を高めるこ とができる。

次に示す例は本発明の大環状錯体の合成、特性および用途について説明している 。これらの大環状錯体の合成、特性および評価に用いる装置および設備は後述す るように一般的である。

これらの例に示す「部」および「百分率」は、特に記載しないかぎり、質量で示 す。

史上　　ペン゛ント（４−ヒドロキシフェニル　メチル　・　　　るユーロピウ ム（Ｉ［［）の　　　ヘキサ−アザ−（ａ）　　含水酢酸ユーロピウム（白色、 非吸湿性結晶）、アルファーチオコール（Ａｌｐｈａ−Ｔｈｉｏｋｏｌ）社製、 カタログＮＣＬ　１５３０７（１９８６〜８７）； （ｂ）　　２．６−ジアセチルとリジン（白色、結晶質粉末）、アルドリッヒ　 ケミカル　カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製、カタ ログＮＣＬ　Ｄ８８０−１（１９８７）　　？および（Ｃ）　　チロシン　アミ ド（白色、結晶質粉末）、シグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｓ＋ａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製、カタログｋ　３８７９（１９８７）。

ｈ玉里 、　２−ジアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン（チロシン　ジア ミン　の前言ｌ゛＆ 大環状錯体の製造に先立って、先づメアレス氏はかにより記載された手順（Ｃ， Ｆ、メアレス氏ほか、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　　１４２＋　６８（１９ ８４）”）を僅かに変えて、チロシン　アミドを相当するジアミン塩酸塩に転化 した。この転化は、次の手順を含むように非酸化雰囲気においてテトラヒドロフ ラン（ＴＨＦ）および１，２−ジメトキシエタンの混合物を溶剤として用いて行 った。

固体チロシン　アミド（１，５ｇ、８．３　ミリモル）を窒素雰囲気下で、３０ ０　ｄの無水１，２−ジメトキシエタン（アルドリンヒ　ケミカル　カンパニー 製；ゴールドーラベル　グレード）および１００−の無水ＴＨＦ　　（アルドリ ッヒ　ケミカル　カンパニー製；ゴールドーラベル　グレード）からなる溶剤混 合物を装填した反応容器に加えた。生成溶液を水浴中で冷却し、硼化水素（ＢＨ ３）をＴ）ＩＰに溶解した０、１０Ｍ溶液７５−をゴム隔膜（ｒｕｂｂｅｒ　ｓ ｅｐｔｕｍ）を介して注射器で反応器に導入した。Ｂ）Ｉｓ溶液を容器の内容物 を一定に撹拌しながら３０分間にわたって添加した。この添加中、綿毛状白色固 体が形成し、この固体を反応媒質から沈澱させた。

反応は、反応容器の内容物を更に６時間にわたって還流しながら継続させた。反 応容器の内容物を冷却し、次いで水浴で約３０分間にわたり冷却した。１００ｄ の無水メタノールを反応容器に加え、綿毛状の白色固体沈澱物を溶解した。かよ うにして得た澄んだ溶液をＨＣＬガスで飽和し、１時間還流して所望のジアミン ニ塩酸塩の第１生成物を結晶化した。固体を濾過し、母液を回転蒸発器において 減圧下で蒸発乾固した。固体残留物の再結晶化により白色結晶二塩酸塩の他の生 成物を得た。全収率は約６５χであった。微量分析およびスペクトル　データ（ ＩＲ，ＬＩＶ、’１および”ＣＮＭＲ）によって、ジアミンニ塩酸塩としての生 成物の構造および純度を確めた。

遊離塩基ジアミンを次のようにして作った：１．００ｇ（４，２ミリモル）の二 塩酸塩を１５Ｊｄの無水ＴＨＦに懸濁し、この懸濁物にナトリウム　メトキシド （０，４６ｇ、８．５　ミリモル）の約１０−のメタノール溶液を一定に撹拌し ながら添加した。混合物を１時間にわたり還流および撹拌し、反応の停止の際に 付加持間にわたって撹拌を継続した０次いで、混合物をＯ″Ｃ１１夜にわたって 冷凍機に入れた。この加熱および冷却プロセス中に、白色沈澱物（塩化ナトリウ ム）が生じ、この沈澱物を濾過により除去し、廃棄した。濾液：澄んだ黄色溶液 を無水メタノールで５０Ｍ１の全容量に稀釈し、気密封鎖ボトルに入れ、冷凍下 に貯蔵した。チロシン　ジアミン（０，ＯＢ４モル／ｊりを含むこの溶液は制限 されたセルフ　ライフ（ｓｈｅｌｆ　１ｉｆｅ）を有し、それ故、大環状錯体の 合成に用いる前に斬らしく作った。

ユーロビ　ム　　　　　　　　　の　゛告酢酸ユーロピウム（ｍ　）　（０，１ ８ｇ、　０．５０ミリモル）　、２．６−ジアセチルとリジン（０，１６３ｇ、 １．０　ミリモル）および２０１ｄの無水メタノールをフラスコに入れ、窒素の ゆるやかな連続流でフラッシュした。混合物を６０℃の温度に加熱し、無水メタ ノールに溶解した１ミリモル（この例の段１１１から溶液１１．９ｄ）のチロシ ンジアミンを上記フラスコに清々添加した。フラスコの内容物が直ち５に澄んだ 黄色に変化した。混合物を窒素雰囲気中で還流条件で１２時間にわたり加熱し、 濁った状態から澄んだ状態に段々と変わった０次いで、フラスコを回転蒸発器に 入れ、黄−琥珀色溶液を減圧下で蒸発して琥珀色の油状残留物を得た。この残留 物から、粗大環状錯体を無水ジエチルエーテルで繰返し処理して得た。生成物を 少量のメタノールに溶解し、不溶解残留物を濾別し、および０°Ｃでジエチルエ ーテルを添加して沈澱することによって精製した。生成物を白色微結晶として約 ６０χの収率で分離した。この生成物は極性有機溶剤に極めてよく溶解し、かつ 水にゆるやかに溶解した。精製物質の質量スペクトル分析並びにＩＲおよびＮＭ Ｒスペクトル（１Ｂおよび１３Ｃ）は指定した構造と一致した。

上述するようにした得たユーロピウム大環状錯体はメタノール溶液において紫外 線照射する際に蛍光を示した０発光スペクトルのパターンはヘキサ−アザ−大環 状環境においてユーロピウム（ＩＩＩ）の特性を示しくＮ、サバチニイ、Ｌ、デ 　コラ、Ｌ、ｌ’！、バラリノおよびＧ、フランセ氏Ｊ、Ｐｈ　ｓ　Ｃｈｅ＋ｓ 　　　」Ｌ４６８１〜４６８５（１９８７）　：　Ｅｕ　（ＩＩ［）ヘキサ−ア ザー大環状話体［（Ｅｕ（ＣｚＪｚＪ＊）（ＣＨｘＣＯＯ）　］　（ＣＨｚＣＯ Ｏ）ＣＩ・２Ｈ２０における放射性および非放射性転移）、この事はユーロピウ ム大環状存在物の構造に関して付加的な確認によるものである。このユーロピウ ム大環状存在物の本来の蛍光強さは比較的に低かったが、しかしある相当する陰 イオン（エンハンサ−）と組合せた場合に実質的に高めることができた。例えば 、アセテート　イオンを２−フラン酸、２−チオフェン酸または１．３−ジフェ ニルプロパン−１，３−ジオンの陰イオンで置換した場合には、強いユーロピウ ム大環状蛍光を示す淡黄色溶液を生じた。これらのエンハンサ−の存在により蛍 光強さが著しく増大したことはユーロピウム（ＩＩＩ）の非機能化ヘキサ−アザ 大環状錯体について報告されている（Ｌ、デ　コラ、Ｄ、Ｌ。

スマイルスル０Ｍ、バラリノ氏ほか＋　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　Ｘ　Ｃ ｏｎｖｅ　ｎ。

ｏ　　ａ　　　ｉ　　ｏｔｏｃｈｉｌｃａ、イタリアロ、ラヴエンナ（１９８５ ）　４ページ（Ｅｕ　　（Ｉ［［）およびＴｂ　（Ｉ［［）の陽イオン大環状錯 体の発光特性におけるヘテロ配位子の効果））。

肛　ペン゛ン　　−ヒ゛ロキシ　ェニル　　　ルールビ　ム（■　の　　　ヘキ 　−アザ−の主成 酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）の代りに酢酸テルビウム（Ｉ［［）を用いて例Ｉの 手順を繰返し行った。精製物質の赤外スペクトルによって酢酸テルビウム（Ｉｎ ）のヘキサ−アザ−大環状錯体の組成であることを確めた。

Ｕ　　ペン　ント（４−ヒドロキシフェニル　メチル　　　　る−ン　ン　　　 の　　　ヘキサ−アザー坐立底 酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）の代りに酢酸ランタン（ｍ）を用いて例１の手順を 繰返し行った。生成物のＩＲおよびＮＭＲ（’）！および１３Ｃ）スペクトルは 指定の大環状構造と一致した。

！　　ペン　ン　　−ヒ′ロキシ　ェニル　メ　ル　　　　るイード１ウム（Ｉ Ｉ［）のヘキサ−アザ−゛　　の旦 酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）の代りに酢酸インドリウム（ＩＩＩ）を用いて例１ の手順を繰返し行った。生成物のＩＲおよびＮ？’ｌＲ（’ＢおよびＩｎｃ）ス ペクトルは指定の大環状構造と一致した。

主成 酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）の代りに酢酸ウラニル（ｎｏ　ｚ″°）を用いて例 １の手順を繰返し行った０次いで、初めの酢酸塩をＮＯ，。

ＣＩＯ，またはＳＣＮ対イオンのそれぞれでイオン交換することによって、大環 状ウラニル錯体を硝酸塩、過塩素酸塩またはチオシアン酸塩として分離した。精 製物質の赤外スペクトルによって、これらの物質の構造がウラニル　イオンのヘ キサ−アザ−大環状錯体であることを確めた。

底 紅社且 （ａ）　　含水酢酸ランタン（白色、結晶質固体）、アルドリッヒケミカル　カ ンパニー製、カタログにα３０６３３−９　；（ロ）２．６−ジアセチルとリジ ン、アルドリッヒ　ケミカル　ヵンパ二−製、カタログ随Ｄ８８０−１（１９８ ７）　　；および（Ｃ）４−アミノフェニルアラニン（白色、結晶質固体）、ア ルドリッヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログｋ　８５８７０−６゜Ｌ土産 １．２−ジアミノ−３−（４−アミノフェニル　プロパンの’ａｆａランタン（ Ｉ［［）大環状錯体の製造に先立って、４−アミノフェニルアラニンを相当する トリアミン三塩酸塩に転化した。この転化は次の４一段階の手順で行った： １．１　　固体４−アミノフェニルアラニン（１，ＯＯｇ、５．５５　ミリモル ）を２５−の無水メタノールに懸濁し、室温で１５分間にわたって撹拌した。こ の懸濁物に無水１ｃＩガスの活発な流れを通して泡立て、懸濁する物質を溶解し 、淡黄色溶液が生成した。３０分間にわたって還流した後、この溶液を回転蒸発 器において減圧下で蒸発乾固した。かようにして得たクリーム色の粉末をメタノ ール−ジエチルエーテルから再結晶した。この生成物の微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ） 並びにＩＲおよびＮＭＲスペクトル（’Ｈおよび！３０）によってその組成が４ −アミノフェニル　アラニンのメチル　エステルニ塩酸塩であることを確めた。

１．２４−アミノ−フェニルアラニンのメチル　エステルニ塩酸塩を次のように 処理して相当するアミドニ塩酸塩に転化した：無水ガス状アンモニア流を、メチ ル　エステル（１，ＯＯｇ、３．７４　ミ□リモル）を無水メタノール（４０ｒ ｄ）に溶解した溶液（０°Ｃに冷却した）に泡立たせ、次いでフラスコを密閉し 、混合物を室温で４時間にわたって放置した。処理を４〜５回繰返した。生成し た澄んだ淡黄色溶液を回転蒸発器において減圧下で蒸発乾固した。淡黄色固体残 留物はその赤外線スペクトルによって少量の塩化アンモニウムを含むアミドの塩 酸塩であることを確めた。

メタノール−ジエチルエーテルから再結晶して得た純粋生成物は正しいＣ，Ｈ， Ｎ微量分析並びにＩＲおよびＮＭＲスペクトル（’ＨおよびＩｆｆ（１）を有す る白色結晶として得た。

１．３　　アミドニ塩酸塩を次のように処理して「遊離塩基」に転化した：固体 二塩酸塩（１，ＯＯｇ、　４．６４ミリモル）を微粉末に粉砕し、湿気−保護容 器に収容した無水テトラヒドロフラン（Ｔ）ＩＰ）（１５０ｄ）に懸濁した。こ の懸濁物を撹拌しながら、この懸濁物に無水ガス状アンモニア流を室温で１０分 間にわたって泡立て、次いで４５°Ｃで５分間にわたって泡立てた。この処理中 、溶液は黄色に変り、懸濁固体の外観が変化した。混合物を冷凍機において１時 間冷却し、次いで濾過し、固形物を２回ＴＨＦ／アンモニア処理し、最終残留物 （塩化アンモニウム）を廃棄した０合わせたＴＨＦ濾液を減圧下で蒸発乾固して アミンを得、このアミンを五酸化りん上で乾燥して綿毛状粉末として得た。生成 物は空気に長くさらすと変色した。微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）およびスペクトル（ ＩＲ，’Ｈおよび”ＣＮ？ｌＲ）によって化合物の構造を確めた。４−アミノフ ェニルアラニンに対して約８０χΦ全収率を得た。

１．４４−アミノフェニルアラニンのアミドを次のように乾燥窒素ガス流下で処 理して相当するトリアミン三塩酸塩に転化した。

固体アミド（２，５０ｇ、　１３．９　ミリモル）を乾燥管保護を施した還流冷 却器乾燥窒素ガス入口および隔膜ストッパーを具えた５００ｄの丸底−三ロフラ スコに入れた（アミドの添加前に、フラスコを乾燥窒素流下、火炎で加熱し、お よび窒素下で冷却した）。

アミドに、１４０　ｄの１．２−ジメトキシエタン（無水、ゴールド−ラベル　 グレード、アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー類）および５０Ｉ１１のＴＨＦ 　（無水、ゴールド−ラベル　グレード、アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー 類）をゴム隔膜を介して注射器で加えた。混合物を撹拌し、０℃で１５分間にわ たり冷却した。

更に１５分間にねたり０℃で撹拌した冷却および撹拌した混合物に、ボラン（Ｂ ＨりをＴＨＦ（７０ｄ、１．０Ｍ、アルドリッヒ　ケミカルカンパニー類）に溶 解した溶液を徐々に加えた。ゴム隔膜をテフロン　ストッパーと取り替え、容器 の内容物を５時間にわたって還流した。生成した僅かに濁った無色の混合物を０ °Ｃに冷却し、これに５０戚の無水メタノールを極めて徐々に添加した。

初めに、ガスの活発な発生が観察され、溶液がきれいになった。

次いで、溶液をＨＣＩガスで飽和し、白色沈澱物が生成した。還流冷却器の水の 循環を中断し、乾燥管を外し、溶液を活発な窒素流中で１時間にわたって加熱沸 騰させ、容量を約半分に減少。

させた。冷却後、白色沈澱物を吸引濾過し、無水ＴＨＦで洗浄し、減圧デシケー タ−において五酸化りん上で乾燥した。収率は７０χであつた。生成物はトリア ミン三塩酸塩の三水和物に相当する微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）を有し、指示構造を 確認したＩＲおよびＮＩＩＲスペクトル（’Ｈおよびｌ３（）を有していた。

２、　−ン　ン（鯰　の　゛告 ４−アミノフェニルアラニンのトリアミン三塩酸塩（０，１８８ｇ。

０．６５ミリモル）を１５ｄの無水メタノールに溶解し、この溶液に固体水酸化 カリウム（０，８９ｇ、　０．４４　ミリモル）を添加した。生成懸濁物を室温 で１時間にわたって撹拌し、しかる後に一夜、冷凍した。懸濁物を濾過し、固形 分（塩化カリウム）を捨て、澄んだ淡黄色濾液を酢酸ランタン（Ｉ［１）水和物 （０，１１０ｇ、０．３２ミリモル）を含む４０Ｊｄの無水メタノールを収容し た反応容器に、撹拌しながら清々添加した。生成混合物を室温で１５分間にわた り撹拌し、次いで２．６−ジアセチル　ピリジン（０，１０４ｇ、０．６５ミリ モル）を加えた。混合物を還流条件下で１４時間にわたり加熱し、これにより生 じたオレンジ色溶液を濾過して少量の未反応酢酸ユーロピウムを除去し、回転蒸 発器において減圧下６０″ｃＴ：蒸発乾固した。ゴム状残留物をジエチル　エー テルで繰返し処理して、最終的に固体生成物を得た。この固体を温クロロホルム に溶解し、濾過した。不溶性残留物を捨て、黄−オレンジ色の濾液をジエチルエ ーテルで徐々に稀釈し、冷却した。かようにして生じた沈澱物を濾過し、無水メ タノールに溶解し、この溶液に約３００−の冷却した無水ジエチルエーテルに撹 拌しながら清々添加した。生成した淡黄色粉末状固体を濾別し、ジエチルエーテ ルで洗浄し、真空中、五酸化りん上で乾燥した。収率は５８２であった。微量分 析およびスペクトル　データ（ＩＲ，’Ｈおよび”ＣＮＭＲ）により生成物の構 造および純度を確めた。

ａＬ　　　ベン゛ント（４−アミノフェニル　メチル　　　　るオシアン　−ン 　ン　　　の　　　ヘキ　−ア゛−１１Ｊｕｌ≧鉦或 例■の大環状錯体陽イオンのチオシアン酸塩を、相当するアセテート大員環の試 料を過剰のチオシアン酸ナトリウムで処理して作った。この場合、両反応物を少 量のメタノールに溶解した。最初に濁った分散物が生成した後、微品質の黄−オ レンジ色の固体が徐々に分離した。この固体を濾別し、メタノールで十分に洗浄 し、真空中、五酸化りん上で乾燥した。この生成物は微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）お よびＩＲスペクトルにより大環状錯体の無水トリイソチオシアネートであること を確めた。

五■　　　ベン゛ント（４−アミ　フェニル）　チル　　　　るユーロピウム　 （■　の　　　ヘキサ−ザー■生立主成 酢酸ランタン（Ｉ［Ｉ）の代りに酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）を用いて例■の手 順を繰返し行い、ユーロピウム錯体を淡黄色粉末として得た。この生成物は微量 分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）および赤外スペクトルによりユーロピウム（ＩＩＩ）大員環 の三酢酸塩であることを確めた。

…　　ベン゛ン　（４−ミノ　エニル　　　ルオシアン　ユーロピウム（の　　 　ヘキサーア゛−太１並立体坐立戒 例■の大環状酢酸ユーロピウム（Ｉ［［）を、例■に記載した手順によって相当 するチオシアン酸塩に転化した。生成物の微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）および赤外ス ペクトルがユーロピウム（Ｉ［［）大員環の無水トリイソチオシアネートに一敗 した。

１ｍ　　　ペン゛ント（４−アミノ　エニル　メチル　　　　るガドリニウム　 　　の　　　ヘキサ−アザ−゛立生旦金底 酢酸ランタン（ＩＩ）の代りに酢酸ガドリニウム（ＩＩ［）を用いて例■の手順 を繰返し行った。この生成物の微量分析（Ｃ，Ｈ。

Ｎ）および赤外スペクトルがガドリニウム（Ｉ［［）大員環の三酢酸塩と一致し た。

［ペン゛ント（４−アミノ　エニル　メ　ル　　　　る−ルビ　ム　　　の　　 　へキ　−　　−韮」ぽと皺底 酢酸ランタン（ＩＩＩ）の代りに酢酸テルビウム（ＩＩりを用いて例■の手順を 繰返し行ワた。この生成物の微量分析（Ｃ，Ｈ。

Ｎ）および赤外スペクトルがテルビウム（ＩＩＩ）大員環の三酢酸イ・ト１ウム 　　　の　　　ヘキ　−　ザー韮ｊす榎釦底 酢酸う゛ンタン（ＩＩＩ）の代りに酢酸イツトリウム（ＤＩ）を用いて例■の手 順を繰返し行った。この生成物の微量分析（Ｃ。

Ｈ，Ｎ）およびスペクトル（ＩＲ，’Ｈおよび１３ｃ　ＮｎＲ）がイツトリウム ＣＩＩＩ）大員環の三酢酸塩と一致した。

太１並且迷坐立底 例Ｘ■の大環状酢酸イツトリウム（Ｉ［Ｉ）を例■に記載した手順によって相当 するチオシアン酸塩−に転化した。生成物の微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）および赤外 スペクトルがイツトリウム（Ｉ［［）大員環の無水トリイソチオシアネートと一 致した。

（ａ）　　含水酢酸ランタン（■）、アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー製、 カタログＮα３０６３３−９　；ＣｏＪ２．６−ジアセチルとリジン、アルドリ ッヒ　ケミス・ル　カンパニー製、カタログＮｃＬ０８８０−１（１９８７）　 　：および（Ｃ）　　セリン　アミド塩酸塩−水和物（白色、結晶質固体）、シ グマ　ケミカル　カンパニー製、カタログＮα３４７５０゜この化合物を先づセ リン　アミド塩酸塩−水和物から、塩酸塩を例■、セクションＢ、３に記載して いる手順による遊離塩基アミドに変えて作った０次いで、遊離塩基アミドを例１ ．セクション８．１に記載している手順によって還元した。最終、白色結晶生成 物は２．３−ジアミノプロパノールニ塩酸塩と一致する微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ） およびＩＲスペクトルを有していた。大員環の合成に用いる直前に、遊離塩基ジ アミンを例■、セクション８．１に記載する手順で得た。

２、　−ン　ン（）　　　　の’ｂ′告この化合物を、１．２−ジアミ／−３− （４−ヒドロキシメチル）プロパンの代りに２，３−ジアミノプロパン−１−オ ールを、および酢酸ユーロピウム（Ｉ［ｒ）の代りにに酢酸ランタン（Ｉ［［） を用いて、例Ｉ、セクション２に記載する手順によって得、および精製した。生 成物は白色結晶質粉末として得、その微量分析（Ｃ，Ｈ。

Ｎ）およびスペクトル（ＩＲ，’）ＩおよびＩ３ＣＮｌ’ｌＲ）はランタン（Ｉ ＩＩ）大員環の三酢酸塩と一致した。

［ペン゛ント　ヒドロキシメチル　　　　る　　ユーロピウム　■　の　　　ヘ キサ−アザ−１のム底 この錯体を、酢酸ランタン（ＩＩＩ）の代りに酢酸ユーロピウム（Ｉ［［）を用 いて例Ｘ■、セクション８．２に記載する手順によって得た。生成物の微量分析 （Ｃ，Ｈ，Ｎ）および赤外スペクトルがユーロピウム（ＩＩＩ）大員環の三酢酸 塩と一致した。

ｍ　　ペン゛ント（４−アミノフェニル）メチル　　　　るユーロピウム　■　 のヘキサ−アザ−１の１光１弧 紅林且 （ａ）　　例■の酢酸ユーロピウム（Ｉ［［）大環状錯体；（ｂ）　　１．３− ジフェニルプロパン−１，３−ジオン（ジベンゾイルメタン、　ＨＤＢＭ）の新 しく作ったナトリウム塩、アルドリフヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログＮ ｏ、Ｄ３３４５−４　　；および（Ｃ）　　４，４．４−　　）リフルオロ−１ −（２−チェニル）−ブタン−１，３−ジオン（テノイルトリフルオロアセチル アセトン、ＴＨＴＦＡｃＡｃ、白色結晶質固体）、アルドリツヒ　ケミカル　カ ンパニー類、カタログ随Ｔ２７００−６゜ Ｌ１風 １．１３−ジフェニルプロパン−１３−ジオンの　ト１ウム　（Ｎ」■肚生製造 固体ＨＤＢＭ（０，２２３ｇ、　１．０　ミリモル）を、きれいなナトリウム金 属（０，０２３ｇ、１．０　ミリモル）を無水メタノール（５０ｍ）に溶解した 溶液に添加した。混合物を５０°Ｃで３０分間にわたり撹拌し、次いで回転蒸発 器において減圧下で蒸発乾固してナトリウム−１，３−ジフェニルプロパン、１ ．３−ジオネートの絹のような淡黄色針状結晶を得た。収率：１００χ び規則正しく高めた濃度のエンハンサ−、ジベンゾイルメタンのナトリウム塩（ ＮａＤＢＭ）（０，５０ＸＩＯ−’Ｍ、　１，５Ｘ１０−’Ｍ、　２．０ｘｌＯ −’Ｍ、　２．５Ｘ１０−’？！、　３．０Ｘ１０−’Ｍ、　３．５Ｘ１０−’ ？’ｌ、　４．０Ｘ１０−’Ｍ）を含有する一連の７種の溶液を作った。いづれ の場合においても、溶剤としてはジオキサンおよび蒸留水（２：８容量比）の混 合物を用いた。各溶液の蛍光発光スペクトルを３７ｏｎ−における励起により室 温で測定した。　６１５ｎｓにおけるユーロピウム大員環の（赤色）発光の強さ は、ＮａＤＢＭ対ユーロピウム大員環のモル比が２．５：１．０　　（近似の） モル比に達する場合に著しく増大することを観察した。

３、　ユーロピウム　ＩＩＩ”−ＤＢＨの例■のユーロピウム（Ｉ［Ｉ）大員環 （０，３７５ｇ、　１．００ミリモル）ＮａＤＢＭ　（０，４５２ｇ、　２．０ ０　ミリモル）をクロロホルム（２０ｔｄｌ”）にそれぞれ別々に溶解し、両溶 液を撹拌しながら混合した。この混合物を５０°Ｃに５分間にわたり加温し、生 成した濁った黄色懸濁物を濾過した。固形物を捨て、澄んだ黄色溶液を回転蒸発 器において減圧下で蒸発して全容量を５−にした。この溶液を５０−の無水ジエ チルエーテルで稀釈し、０°Ｃに１時間冷却してクリーム色の粒状固体の沈澱を 促進し、この固体は３７０ｎ−で励起した場合に６１５ｎｇｎに強い蛍光を現わ した。生成物のＩＲスペクトルはユーロピウム（ＩＩＩ）大員環のアセテートＤ ＢＭ錯体の場合と一致した。

４、　ユーロピウム　■　　＝　のＴＨＴＦＡｃＡｃによる　　ゞこの例のセフ シラン８．２に記載する処理をＮａＤＢＭの代りに４゜４．４−トリフルオロ− １−（２−チェニル）ブタン−１，３−ジオン（テノイルトリフルオロアセチル アセトン、　ＴＨＴＦＡｃＡｃ）を用いて繰返し行つた。最大の蛍光増強（ｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｎｈａｎｃｅｗ＋ｅｎｔ）がユーロピウム（Ｉ［Ｉ） 大員環対ＨＴＢＴＦＡｃＡｃの１．０：３．０（近似の）モル比で観察した。

ｍ　　ペン゛ント（４−ヒドロキシメチル　　　ルる　　ユーロビ　ム　■　の ヘキサ−アザー左生１光１五 例■のユーロピウム（Ｉ［［）大環状錯体の代りに例Ｉのユーロピウム（Ｉｆｆ ）大環状錯体を用いて例ＸＶ１．セクションＢ、２および８．４の手順を繰返し 行った。いずれの場合においても、３７０ｎｍに励起による６１５ｎ＋ｍでの蛍 光発光における著しい増強がユーロピウム（Ｉ［［）大員環対エンハンサ−の１ ．０：２．５　　（近似の）モル比において観察した。

（ａ）３−ヒドロキシピリジン、固体、　ｍ、ｐ、１２６〜１２９、　アルドリ ッヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログｋ　１９．３〜４０６（１９８９）　 ； （ロ）３７χホルムアルデヒド水溶液、Ａ、Ｃ，Ｓ、試薬グレード、アルドリッ ヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログＮα２５２５４−９（１９８９）； （Ｃ）　　エチレンジアミン（１，２−ジアミノエタン）二塩酸塩、白色結晶質 固体、アルドリッヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログ覧１９５８０−４（１ ９８９）　；（６）二酸化マンガン（■）、活性化黒色粉末、アルドリッヒケミ カル　カンパニー類、カタログ随２１７６４−６（１９８９）　；（ａ）　　無 水琥珀酸、１１）、１１９〜１２０℃、ゴールド　ラベル　グレード　アルドリ ッヒ　ケミカル　カンパニー類、カタログＮα２３９６９−０　：および げ）水和酢酸ランタン（ｍ）、白色結晶質粉末、アルドリッヒ　ケミカル　カン パニー類、カタログＮα３０６３３−９　。

Ｌ主属− １，３−ヒドロキシビ１ジンー２６−ジアルー°ヒトの制°。

大環状錯体の合成に先立って、１−ヒドロキシピリジンをＭ、Ａ。

バルト氏ほか方法（Ｍ、Ａ、バルド、Ｇ、チェサ、Ｇ、マランゴニイおヨヒＢ、 ヒテリ氏、ち」山＋ｅｓｉｓよ７２０（１９８７））の修正によって相当する２ 、６−ジアルデヒドに転化した０手順は次の２つの段階からなる： １．１３−ヒ゛ロキシー２６−ビス（ヒドロキシメチル　と１ジヱ皇製盈 ３−ヒドロキシ−ピリジン（２３，８ｇ、０．２５モル）および固形水酸化ナト リウム（Ｎａｉｌ、　１０．０ｇ、　０．２５モル）を水（１００ｍ）に溶解し 、溶液を９０゛Ｃに加熱した。撹拌したこの温溶液に、３７χホルムアルデヒド 水溶液（８５ｄ）を８時間にわたって清々添加した。ホルムアルデヒドの添加完 了後、混合物を９０°Ｃで更に９０分間にわたって撹拌した０次いで、加熱を止 め、混合物を０℃に冷却し、１５ｄの酢酸（ＣＨ３ＣＯＯ１１）の添加によって 中和し、回転蒸発器において減圧下で蒸発乾固した。残留物を２００１ｄのジメ チルホルムアミドに溶解し、任意の不溶性固形物を除去し、この固形分を捨て、 濃厚塩酸水溶液（２５ｍ”）の添加で酸性にした。酸性水溶液を回転蒸発器にお いて減圧下で蒸発乾固し、残留物をメタノール（１５０ｍ）に溶解し、活性炭で 清浄にし、濾過した。生成した澄んだ溶液を再び回転蒸発器において減圧下で蒸 発乾固した。

油状残留物を、先づｎ−プロパツールから、次いでメタノール・アセトンから再 結晶し、所望生成物（収率３５χ）を正しい分析およびスペクトル（ＩＲおよび ＮＭＲ）特性ををするクリーム色固体、ａ＋、ｐ、１４４℃として得た。

、　３−ヒドロキシ−２６−シホルミルピ１ジンのｌＩ゛上記段階で得た３−ヒ ドロキシ−２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジン（５，ＯＯｇ、２６　ミ リモル）を無水エタノール（１００ｍ）に溶解し、この溶液に３．５８ｇ（２６ ミリモル）の無水炭酸カリウム（ＫＩＣｏｗ）を室温で加えた。室温で５時間に わたり撹拌した後、懸濁物を濾過し、固形分を廃棄し、澄んだ濾液を回転蒸発器 において減圧下で蒸発乾固した。油状残留物を１５０ｄのメタノール−アセトン （２０：８０混合物）に溶解し、この溶液に固形活性酸化マンガン（ＩＶ）　（ ＭｎＯｚ、３５ｇ）を添加した。懸濁物を室温で７日間にわたって撹拌し、しか る後セライト上で濾過し、固形分を廃棄した。溶液を室温で減圧下で蒸発乾固し 、残留物を固体水酸化カリウムおよびドライライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ）の存在 において真空下で２日間にわたって乾燥した。かようにして得た固体をランタン （ＩＩＩ）大員環の合成に直接に用いた。生成物の同定を、空気−分解を妨げる のに再結晶することなく、ＩＲおよびＮＭＲスペクトルから得た。

２、　　−ン　ン　■　　　゛　　の　゛＆エチレンジアミンニ塩酸塩（１１， ３３ｇ、　１０ミリモル）および固形水酸化カリウム（０，５６ｇ、　１０ミリ モル）の混合物を室温で３０分間にわたって撹拌し、次いでＯ″Ｃに１時間にわ たって冷却した。

形成した固体を濾別し、廃棄し、濾液を還流冷却器および窒素ガス入口を具えた フラスコに入れた。これに、固形酢酸ランタン（Ｉ［［）水和物（１，５８ｇ、 　５ミリモル）を添加し、混合物を４０℃で３０分間にわたり撹拌、加温した。

しかる後に、この混合物に３−ヒドロキシ−２，６−シホルミルピリジン（１， ５１ｇ、１０　ミリモル）を無水メタノール（５０１ｄ”）に溶解した溶液を１ ５分間にわたり撹拌しながら清々添加した。生成した濁った黄色懸濁物を遅い窒 素流下で６時間にわたり還流し、次いで窒素流を中断し、混合物を室温に冷却し 、濾過し、固体残留物を廃棄した。澄んだ黄色溶液を回転蒸発器において減圧下 で蒸発乾固して黄色固体を得、この固体をメタノール−ジエチルエーテルから数 回にわたり再結晶した。ペンダント　ヒドロキシ基を有するランタニド大員環特 性を化学分析からおよびＩＲおよびＮ？ｌＲスペクトルから一ヒ゛ロキシビｉジ ンー　−ン　ンー　　　　の　　　モ　ニス主四二生藍上 例Ｘ■の段階Ｂ、２において得た３−ヒドロキシピリジン−ランタン大員環の試 料（０，６７ｇ、　１．０ミリモル）を１００１ｄのクロロホルムに入れ、これ に無水琥珀酸（０，２００ｇ、２．０ミリモル）を５０ｍのクロロホルムに溶解 した溶液を撹拌しながら滴下した。混合物を４時間にわたって還流し、濾過して 任意の懸濁固形物を除去し、回転蒸発器において減圧下で蒸発乾固した。残留物 をメタノール−ジエチルエーテルから数回にわたって再結晶した。ペンダント　 カルボン酸基を有するランタン（Ｉ［［）大員環の特性を化学分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ ）およびスペクトル（ＩＲおよびＮ？ｌＲ）から得た。

の　　　ヘキサ−アザ−のＡ 酢酸ランタン（Ｉ［ｌ）の代りに酢酸ユーロピウム（Ｉ［［）ヲ用いて例ＸＩＸ の手順を繰返し行った。微量分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）およびＩＲスペクトルによって 、生成物の式および純度を確めた。

■ｘｘ上　ペン゛ン　　カルボン　　　　　るユーロピウム■）のヘキサ−アザ −′ｔ　の゛ 例■のユーロピウム（Ｉ［［）大員環の代りに例ＸＸのユーロピウム（ＩＩＩ） 大員環を用いて例ＸＶＩの手順を繰返し行った。６１５ｎｍにおける最大蛍光強 さを３７０ｎ＋ｍで励起することによって大員環対エンハンサ−の１：２モル比 で観察した。

ｍＮ−サクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ　１）−３−（２−ピッジルジ チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　　　いるベン゛ント（４−アミノフェニル 　メチル　　　　る　　ユーロピウム　　　のヘキサ−アザ−１のストレプ　ビ ジンへの力・プ１ング 紅林粁 （ａ）　　Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （ＳＰＤＰ）、ビニリス　ケミカル　カンバ＝−（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌＣｏ、）製、カタログｋ　２１５５７　；（ロ）Ｄ、Ｌ−ジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）　、シグマ　ケミカル　カンパニー類、カタログＮｌＩＤ−０６３ ２；（Ｃ）　　炭酸ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ８〜８．２；（（至）り ん酸塩緩衝塩溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）（ ＰＢＳ）シグマ　ケミカル　カンパニー類、カタログＮα１０００−３　。

（ｅ）　　スペクトル分析したメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ　５ｐｅｃｔｒａ ｎａｌｙｚｅｄ）、フィッシャー　サンエンティフインク（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆ　ｉｃ）製、カタログｋ　Ａ　４０Ｂ−４； （ｆ）　　バイオゲル　Ｐ−６イオン交換樹脂カラム２００〜４００メツシユ、 １ｃｍＸ３０ｃｍ、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）製、カタログｋ　１５００７５ ０；および （樽　４，４．４−　）リフルオロ−１−（２−チェニル）−ブタン−１，３− ジオン（テノイルトリフルオロアセチルアセトンリッヒ　ケミカル　カンパニー 類、カタログＮｏ．　Ｔ２７００−６。

土産 ストレブタビジン（ＳＡ）のビオチン結合当量を計算し正規の最大ビオチン結合 活性から１６２６７ａ．ｎ＋．ｕ．　、タンパク質１５マイクログラムおよびビ オチンの分子量、２４４ａ．ｍ，ｕ，であった。これを基準として、ＳＰＤＰ架 橋の当量（分子量３１２ａ．＋＋＋．ｕ．）を計算しＳＡの■当り１９マイミク ログラムであった。

１バイアルのストレプタビジン（ジメド（Ｚｙｍｅｄ）　４３−　４３０１、ロ ット＃８０４０１０００　、　ＰＢＳにおいてｌｄのＳＡから凍結乾燥したバイ アル当り１■）をＩＪｄの水で再構成し、溶液をＳＡの第２のバイアルに定量的 に移してｄ当り１２３ｎ　　モル（ｎ　　ｄ）の濃度にした。メタノールにおけ る２ｇ／　１２　（３７２ｎモル）　ＳＰＤＰ溶液５８マイクロリットルを加え 、渦を巻かせて混合した．溶液を室温で１時間にわたり放置してＳＰＤＰをＳＡ への共役を達成させた．５０マイクロリツトルの０．１Ｍ　ＤＴＴ水溶液を加え 、生成混合物を３０分間放置してＳＰＤＰ形成−ＳＲの一Ｓ−Ｓ結合を変えた（ ｒｅｄｕｃｅ）　ａチオール−置換−ＳＡをＰＢＳで予じめ平衡させたバイオゲ ルＰ６カラム上に通して精製した。１ｍｌ！のフラクションを回収した．チオー ル−ＳＡを４〜７Ｉｄの溶離剤で溶離すると共に、未反応ＳＰＤＰおよびＤＴＴ 並びにこれらの低分子量反応生成物をフラクション８〜１０で溶離した，　ＳＡ −含有フラクションをプールした。カラムを、これに５０ｄのＰＢＳを流して再 生した。

例■のｐ−アミノフェニル−置換ユーロピウム（Ｉ［［）大環状錯体の試料（０ ．００６２ｇ．６．４ミクロモル）を１．５　ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８〜８．２）に溶解して４ｍＭ溶液にし、これに０．０６６７ｍの２ｇ／　ｊ！ 　ＳＰＤＰ溶液（６．４ミクロモル）を添加した。この混合物を約１時間にわた り放置して共役を達成した。

ＳＰＤＰ−ｐ−アミノフェニル−ユーロピウム（Ｉ［［）大員環反応混合物の試 料（０．１８６１ｄ，３７７ｎモル）をチオール−置換−ＳＡクロマトグラム　 プールに添加し、生成した溶液を３０分間にわたり放置して共役を達成させた。

反応混合物を上述するようにバイオゲルＰ６カラム上で脱塩した．ｐ−アミノフ ェニル−ユーロピウム（Ｉ［Ｉ）大員環−ストレブタビジン共役体を含有する前 端線−溶離フラクションをプールした．後端線−溶離、低分子量反応物を注意し て除去した。

標識ストレプタビジンの存在を、Ｔ）ｌＴＦＡｃＡｃの濃Ｗ−溶液の数滴を添加 し、かつ水銀３５５ｎｍ紫外線電球により誘導された赤色蛍光を観察することに よって検出した。

Ｔ−細胞表面標識（クールターＴ４細胞標識、カタログに４２３５１３１、クー ルター　イムノロジー　ディビジジン（Ｃｏｕｌｔｅｒｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　（フロリダ州、バイアレア）製）に対して特異な抗体による 例■のユーロピウムＣＩＩ□大環状錯体の誘導化または共役を、錯体および抗体 を中性ｐＨにおいてグルタルアルデヒドを含有する水性−有機溶液において化合 することによって達成した。生成した共役体を免疫検定法および時間分解（ｔｉ ｍｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光モニター技術を含むフロー　サイトメトジー分析 に用いることができる。

ｆｉｌｌ　　スルホサ　シンイミジル４−ヨー゛　セ　ル　　ミベン°゛エート （ＳＵＬＦＯ−ＳＩＡＢ　　　いるペン゛ント（４−アミノフェニル　メチル　 　　　る　　ユーロピウム　　　のヘキサ−アザ−の　　への左ＪＪυＬ乙久 Ｔ−細胞標識（クールターＴ４細胞特異抗体、カタログＮＣＬ　４２３５１３１ 、クールター　イムノロジー　ティビジョン（フロリダ州バイアレア）に特異な 抗体による例■の大環状錯体の誘導化または共役を、錯体および抗体をスルホサ クシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓｕｌｆｏ−８Ｉ ＡＢ）を含有する水性の有機溶液において、Ｊ、　Ｋ、ウェルトマン氏ほかＢｉ ｏ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕ競」＋　１４８〜１５２（１９８３）に記載されいてる手 順に従って化合することによって達成した。生成共役体は免疫検定法におよび時 間分解蛍光モニター技術を用いるフローサイトメトリー分析に用いることができ る。

■ｘｘＭ　ペン゛ント（４−アミノフェニル）メチル　　　　るユーロピ　ム　 ■　　　　　　のフローサイトメト１−についての　　　・　　とじてのＬｌ」 ＩＬ咀 例ｘｘｎ、ｘｘｍおよびＸＸｒＶに記載する手順によって抗体に結合する例■の ユーロピウム（ｎｌ）大環状錯体を、全血に見出されるＴ細胞の表面標識につい ての免疫学的染色として用いた。この使用はクールター　エレクトロニックス　 インコーポレーション（Ｃｏｕｎｔｅｒ　Ｅ１ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ＋１ｎｃ、） フロリダ州、バイアレア）により開発されたクールター＠Ｑ−ＰＲＥＰ自動染色 ／試料調製装置の使用を含んでいる。このプロセスは適当な溶菌薬システムを配 置すること、Ｑ−ＰＲＥＰ器具における染色および固定すること、全血液試料を 器具内のチャンバー（試験管）に配置すること、およびしかる後に装置を２つの 利用しろる処理シーケンスの１つのシーケンスで処理することを含んでいる。

Ｌ区！ （ａ）　　この評価に用いる溶菌薬システムはギ酸（０，５χＶ／Ｖ）の積木溶 液、およびギ酸の溶菌作用を速やかに、かつ効果的に阻止し、同時に試料のｐＨ の塩平衡を回復させおよび例ＸＶＩのエンハンサ−１ＴＨＴＦＡｃＡｃを含有す る相手塩溶液を含んでいる。

（ロ）固定液をバラホルムアルデヒドにする。

３、フローサイトメト１− 試料をＱ−ＰＲＥＰミキサー／染色器具において調製した後、染色／試料調製器 具を含む試験管をエビシス＠　（ＥＰＩＣＳ）ＩＶフローサイトメーター（ｆｌ ｏ＠ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に移し、標準ブロー　サイトメトリー分析手順に従っ て分析を行った。これにより生じた散布図は大環状錯体標識細胞と試料の他の成 分との間に良好な差を与えた。この得られた散布図は巨大錯体（ｓａｃｒｏｃｏ ｍｐｌｅｘ）標識細胞を非標識細胞から容易に識別することができ、誘導化後で も稀薄水溶液における上記誘導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）錯体の動的安定性 および錯体の維持および蛍光特性を確認することができた。

２　　ベン゛ント（４−アミノ　エニル　メ　ルユーロビ　ム　　　　　　　　 の につい　の　　　・　　　　　の ヒト白血球を、密度１．０７７ｇ／　ｄｉのフィコ−ルーパキュ（Ｆｉｃｏｌ− Ｐｓｑｕｅ）溶液上に層状に堆積し、単位重力沈降後、上層を除去するようにし て末梢血液から調製した。１００マイクロリットルのこれらの細胞を１８０マイ クロリツトルのりん酸塩緩衝塩溶液で稀釈し、２０マイクロリツトル（２５試験 バイアル）のビオチニル化Ｔ８クールター　クローン＠　（ＣＯＵＬＴＥＲＣＬ ＯＮＥ）単クローン性抗体により２５℃で３０分間にわたり標識付けした。ポリ −１−リジン（Ｉｇ／　１２　）で予備処理した顕微鏡スライドをＣｅｎｔｒｉ ｆｕｇａｌＣｙｔｏｌｏｇｙ　Ｂｕｃｋｅｔ　Ｃｏｕｌｔｅｒ部品ＮＣＬ　７７ ８７０４６に取付けた。２００マイクロリツトルのイソトン＠　（ＩＳＯＴＯＮ ）　ＩＩ［稀釈剤および１００マイクロリツトルの標識細胞を試料ブロック　チ ャンバーに挿入した。これらの細胞の分散物を５０ＯＲＰＭ　（半径６．５イン チ）で、２５°Ｃで５分間にわたり遠心処理した。上済みを取出し、分離したパ ケットおよびスライドをヒート　ガン（基本番号０３８Ｂ）を用いる迅速空気乾 燥前に固定液（アセトン：ホルムアルデヒド：酢酸８５：１０：５）に浸した。

細胞ＤＮＡを、ＰＢＳの−当り２．５　Ｘｌ０−’ｇのＤＡＰＩ（シグマ　ケミ カル　カンパニー製、カタログｋ　Ｄ−１３８８）を含む染色溶液にスライドを 浸漬することによって染色させた。細胞を例Ｘ■からのＰ−アミノフェニル−ユ ーロピウム（Ｉｌｌ）大員環−５Ａ共役体で標識付けした。生成物をエンノ１ン サーとして作用する４、４．４−　）リフルオロ−１−（２−チェニル）ブタン −１，３−ジオンを含むグリセロールに配置し、３５０〜３８５ｎ−における紫 外光励起を用いるエビ照明（ｅｐｉｉｌｌｕ＋＋＋１ｎａｔｅｄ）顕微鏡で観察 した。リンパ球核は青−緑色をし、Ｔ８リンパ球は赤色表面を有していた。

■ＸＸユ　　ペン゛ント（４−アミノフェニル　メチルる　　ユーロピウム（■ 　　　　°社　の１２個の井戸ストリップ（ｗｅｌｌ　５ｐｒｉｐｓ）（ポリス チレン白色微量滴定井戸、ミクロフルオ（Ｍｉｃｒｏ　Ｆｌｏｕｒ）　、グイナ テツチ　ラボラドリース（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、 アレクサンドリア、Ｖ＾２２３１４）を、５０ミリモルノ！炭酸塩糧衝液、ｐ） １９．６に溶解した井戸当り２００■（１００マイクロリツトル）精製単クロー ン性アンチーＡＦＰ抗体（メディクス　ビオチッチ　インコーポレーション（Ｍ ｅｄｉｘ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）、フォスター市、ＡＣ９４４０４：カタ ログＮ（ＬＡ−０１３−０１）で４°Ｃ１１８〜２０時間にわたって被覆した。

井戸を０．５　ｄ／　ｆのポリオキシエチレン　ソルビタン　モノラウレート　 （ツイーン２０）を含有する９ｇ／２のＮａＣ１溶液からなる洗浄溶液で２回、 手で洗った。１０ｇのウシ血清アルブミン（ＲＩＡ　　グレード；シグマ　ケミ カル　カンパニー製）　、２．０ｇのスクロースおよび０．５ｇのアジ化ナトリ ウム（リットル当り）を含有する０、１モル／！の重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ ）１８．３）からなるブロッキング溶液を添加しく２００マイクロリツトル／井 戸）、室温で１時間にわたり反応した。再び、井戸を洗浄溶液で洗った。これら の井戸を４°Ｃで貯蔵乾燥し、数週間の間装置した。

のビオ　ニル アフィニティー精製ヤギ　アンチ−ＡＦＰ多クローン性抗体（アトランティック 　アンチボディース（Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、スカーバラ、 　ＭＥ　０４０７４；　ｃａｔ　ｃｏ、　０７７−０６）を５！の等張塩溶液（ ｉｓｏｔｏｎｉｃ　５ａｌｉｎｅ）ＮａＣ１９ｇ／　ｆ）に対して２回透析し、 次いで炭酸塩緩衝液（０，１モル／　ｊ２．ｐ）Ｉ　９．０）で稀釈して０．５ ０ｇ／　ｊ２の最終濃度にした。１−の溶液に１００マイクロリツトルのジメチ ルスルホキシドに溶解した５００倍モル過剰量のスルホサクシンイミジル−６− （ビオチンアミド）ヘキサノエート（ｒＮ）Ｉｓ−ＬＣ−ビオチン」；　ピアス 　ケミカル　カンパ＝　　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を添加 し、混合物を室温で１時間にわたり温間した。次いで、反応混合物を０．２５ｇ ／　１．のアジ化ナトリウムを含有する５！の０．１　ミリモル／！重炭酸塩緩 衝液（ｐＨ８，３）に対して４０°Ｃで２回使用前に、ビオチニル化抗体溶液を リットル当り、４００　ミリモルのＭＣＩ　、１０ｇのウシ血清アルブミン、０ ．１ｇのアジ化ナトリウムおよび０．１ｇのチメロサールを含有する１０ミリモ ル／！のトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，８）に３００倍に稀釈した。

ｉｉｍレブ　ビジンの８゜制 例ＸＸ■のユーロピウム（Ｉ［［）−大員環−ストレプタビジン共役体を、使用 前にリットル当り、１０ｇのウシ血清アルブミン、９ｇのＮａＣ］、０．１ｇの アジ化ナトリウムおよび０．１ｇのチメロサールを含有する５０ミリモル／！の トリス）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ７，帥に稀釈して１０ミクロモル／！の最終濃度に した。

旺し髪エ ヒトＡＦＰ　　（インターメティコ（Ｉｎｔｅｒ　Ｍａｄｉｃｏ）、カナダ国、 トロント）をＡＦＰについての国際参照標準（７２／２２７）に対して計算した 。ＡＦＰ標準を標準−稀釈溶液において１〜１０００マイクログラムの範囲の濃 度に調製した。

免孜ｍ順 ２０マイクロリツトルの標準液または試料を各井戸に加え、次いでリットル当り 、１０ミリモルのＥＤＴＡ、５０ｇのアルブミン、０．１ｇのアジ化ナトリウム および０．１ｇのチメロサールを含有する１００マイクロリットル標準−稀釈緩 衝液（１０ミリモル／ｌりん酸塩緩衝液）（ｐＨ７，０）を添加した。井戸を３ ７°Ｃで４５分間にわたって温間した（エアオープン）。この井戸を洗浄溶液で ２回洗浄した。井戸に３００倍稀釈したビオチニル化アンチ−ＡＦＰ抗体溶液（ １００マイクロリツトル／井戸）を添加し、井戸を上述するように洗浄した。井 戸に１００マイクロリツトル／井戸のユーロピウム（Ｉ［［）−大員環−ストレ プタビジン錯体使用液を加え、井戸を３７゛Ｃで更に３０分間にわたって温間し た。井戸を上述するように洗浄し、これに１００マイクロリツトルのエンハンサ −ＴＨＴＦＡｃＡｃの１ミクロモル溶液を加えた。各井戸の蛍光を、３３７．１ ｎｍ（窒素レーザ源）の励起波長および６１５（＋−５）ｎＩｌｌ（干渉フィル ター）を用いるサイμ　フルオ（Ｃｙｂｅｒ　Ｆｌｕｏｒ）６１５時間−分解蛍 光計／アナライザーを用いて測定した。

種々の妊娠期間における妊婦からの血清、および肝臓−および精巣−腫瘍からの 血清の試験体を用いた。ヒト血清ベースド「トリーレベル（Ｔｒｉ−１ｅｖａｌ ）　Ｊ配位対照（ｌｉｇａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ）をオルソ　ファーマシュー ティカルス（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ニュージャジー 州　ラリタンから入手した。分析前に、羊水を標準−稀釈溶液に５０倍に稀釈し た。

本発明の大環状錯体の動的安定性は独特のものである。それ故、分析、治療およ び像形成（ｉｍａｇｉｎｇ）通用における上記錯体の使用は最近入手され、かつ 従来において記載されている材料とは異なるものである。

上述において、本発明の好適な例について説明した。しかしながら、本明細書お よび請求の範囲を逸脱しないかぎり、種々の変更を加えることができる。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ） （１）▲数式、化学式、表等があります▼（２）（Ｍ）ｙ（Ｙ）ｍおよび （３）▲数式、化学式、表等があります▼（上記式中、 Ｍは原子番号５７〜７１のランタニド、原子番号８９〜１０３のアクチニドおよ び原子番号３９のイットリウム（ＩＩＩ）からなる群から選択する金属イオンを 示し； Ｒは水素、メチル、直鎖および側鎖アルキル、アリール−置換アルキル、アリー ルおよびアルキル−置換アリールからなる群から選択する置換基（但し、前記置 換基が生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中、前記錯体の環化を妨げ ないという条件で）を示し； ＸはＸで示す位置においてピリジン、チオフェンまたはフランからなる群から選 択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄または酸素を示し； Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール 、アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル、アリールからなる群から選 択する置換基（但し、前記置換基の基が前記置換基とブリッジ／結合部分との間 にカップリング官能性を与えて受容体分子または相当する受容体分子である存在 物により誘導化することができるという条件で）を示し； ｎは２〜３の整数を示し； Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン化物、ニトレート 、パークロレート、チオシアネートおよびピクラートを包含する負に帯電したイ オン（但し、陰イオンが生成錯体の溶解性を制限しないか、またはカップリング 処理または蛍光を導くエネルギー移動を妨げるという条件で）を示し； ｍは大環状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し；および ｙは大環状錯体における対イオン電荷を示す）で表わされる各反応物の組合せで 、金属塩および適当なジカルボニルおよびジアミン前駆物質を普通の反応容器に おいて化合させ；および （ｂ）上述する化合物をジカルボニルおよびジアミン化合物のシッフ塩基環状、 金属鋳型縮合を行う条件下で反応させて金属イオンを有する配位錯体を生成する ことを特徴とする機能化ヘキサ−供与体−大環状錯体の製造方法。 ２．（ａ） （１）▲数式、化学式、表等があります▼（２）（Ｍ）ｙ（Ｙ）ｍおよび （３）▲数式、化学式、表等があります▼（上記式中、 Ｍは原子番号５７〜７１のランタニド、原子番号８９〜１０３のアクチニドおよ び原子番号３９のイットリウム（ＩＩＩ）からなる群から選択する金属イオンを 示し； Ｒは水素、メチル、直鎖および側鎖アルキル、アリール−置換アルキル、アリー ルおよびアルキル−置換アリールからなる群から選択する置換基（但し、前記置 換基が生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中、前記錯体の環化を妨げ ないという条件で）を示し； ＸはＸで示す位置においてピリジン、チオフェンまたはフランからなる群から選 択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄または酸素を示し； Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール 、アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル、アリールからなる群から選 択する置換基（但し、前記置換基の基が前記置換基とブリッジ／結合部分との間 にカップリング官能性を与えて受容体分子または相当する受容体分子である存在 物により誘導化することができるという条件で）を示し； ｎは２〜３の整数を示し； Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン化物、ニトレート 、バークロレート、チオシアネートおよびピクラートを包含する負に帯電したイ オン（但し、陰イオンが生成錯体の溶解性を制限しないか、またはカップリング 処理または蛍光を尊びくエネルギー移動を妨げるという条件で）を示し； ｍは大環状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し；および ｙは大環状錯体における対イオン電荷を示す）で表わされる各反応物の組合せで 、金属塩および適当なジカルボニルおよびジアミン前駆物質を普通の反応容器で 化合させ；および（ｂ）上述する化合物をジカルボニルおよびジアミン化合物の シッフ塩基環状、金属鋳型縮合を行う条件下で反応させて金属イオンを有する配 位錯体を生成することを特徴とする機能化ヘキサ−供与体−大環状錯体の製造方 法。 ３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素、メチル、直鎖アルキル、側鎖アルキル、アリール−置換アル キル、アリールおよびアルキル−置換アリールからなる群から選択する置換基（ 但し、前記置換基が生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中前記錯体の 環化を妨げないという条件で）を示し；Ｍは原子番号５７〜７１のランタニド、 原子番号８９〜１０３のアクチニドおよび原子番号３９のイットリウム（ＩＩＩ ）からなる群から選択する金属イオンを示し； ＸはＸで示す位置においてピリジン、チオフェンまたはフランからなる群から選 択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄または酸素を示し； Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール −アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル−アリールからなる群から選 択する置換基（但し、前記置換基の基が前記置換基とブリッジ／結合部分との間 にカップリング官能性を与えて受容体分子または相当する受容体分子である存在 物により誘導化することができるという条件で）を示し； ｎは２〜３の整数を示し； Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン化物、ニトレート 、バークロレート、チオシアネートおよびピクラートを包含する負に帯電したイ オン（但し、陰イオンが生成錯体の溶解性を制限しないか、またはカッブリング 処理または蛍光を導びくエネルギー移動を妨げるという条件で）を示し； ｍは大環状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し；および ｙは大環状錯体における対イオン電荷を示す）で表わされる化合物。 ４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａは大環状錯体の末端反応基と反応性生体分子または特異的反応性対の メンバーとの間の結合基を示す）で表わされる結合基を有する大環状錯体を含む 請求の範囲３記載の化合物の共役体。 ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｚは反応性生体分子、または特異的反応性対のメンバーを示し、お よびａは０〜１の整数を示す）で表わされる請求の範囲４記載の共役体。 ６．（ａ）関連する検体を含有すると思われる試料を、請求の範囲５に記載する 式の共役体と反応媒質において結合条件下で接触させ、これにより前記共役体の 反応性生体分子部分および試料の検体を互いに接触させるか、または検体と相互 作用するのに特異的な結合材料とのおよび前記検体を模擬する前記共役体の生体 分子部分との相互作用のために競合し；および：（ｂ）反応媒質を監視して （１）共役体の存在； （２）共役体と検体との相互作用の生成物の存在；および（３）共役体と結合材 料との相互作用の生成物の存在の１つを検出する関連する検体を含有する試料の 分析方法。 ７．（ａ）請求の範囲５に記載する式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）像形成の有効量の前記注射しうる溶液を関連する細胞検体を有すると思わ れる受容体に注射し、これにより共役体の反応性生体分子部分を関連する検体と 相互に作用させ；および （ｃ）関連する細胞検体について前記受容体を前記受容体における前記共役体の 検出によって監視することからなる関連する細胞検体の生体内標識付け方法。 ８．（ａ）請求の範囲５に記載の式の共役体の注射しうる溶液を得；および （ｂ）像形成に有効量の前記注射しうる溶液を受容体に、プロトン緩和を高める 目的のためにＭＲＩ検査前に注射し、これによって像コントラストおよび感受性 を改善することからなる生体内磁気共鳴像形成（ＭＲＩ）を高める方法。 ９．（ａ）請求の範囲５に記載の式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）細胞障害有効量の前記注射しうる溶液を特異的抗原を有する細胞を有する と思われる受容体に注射し、これによって共役体の反応性生体分子部分を前記細 胞の特異的抗原と結合させ、錯体の金属からの放射発光が前記細胞を殺すことか らなる特異的抗原を有する細胞の選択的生体内破壊方法。 １０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｑはアミノフェニル、Ｒはメチル、Ｘは窒素およびｎは３を示す） で表わされる請求の範囲３記載の化合物。 １１．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａは大環状錯体の末端反応基と反応性生体分子または特異的反応性対の メンバーとの間の結合基を示す）で表わされる結合基を有する大環状錯体を含む 請求の範囲１０記載の化合物の共役体。 １２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｚは反応性生体分子、または特異的反応性対のメンバーを示し、および ａは０〜１の整数を示す）で表わされる請求の範囲１１記載の共役体。 １３．（ａ）関連する検体を含有をすると思われる試料を、請求の範囲１２に記 載する式の共役体と反応媒質において結合条件下で接触させ、これにより前記共 役体の反応性生体分子部分および試料の検体を互いに接触させるか、または検体 と相互作用するのに特異的な結合材料とのおよび前記検体を模擬する前記共役体 の生体分子部分との相互作用のために競合し；および、 （ｂ）反応媒質を監視して （１）共役体の存在； （２）共役体と検体との相互作用の生成物の存在；および（３）共役体と結合材 料との相互作用の生成物の存在の１つを検出する関連する検体を含有すると思わ れる試料の分析方法。 １４．（ａ）請求の範囲１２に記載する式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）像形成の有効量の前記注射しうる溶液を関連する細胞検体を有すると思わ れる受容体に注射し、これにより共役体の反応性生体分子部分を関連する検体と 相互に作用させ；および （ｃ）関連する細胞検体について前記受容体を前記受容体における前記共役体の 検出によって監視することからなる関連する細胞検体の生体内標識付け方法。 １５．（ａ）請求の範囲１２に記載の式の共役体の注射しうる溶液を得；および （ｂ）像形成に有効量の前記注射しうる溶液を受容体に、プロトン緩和を高める 目的のためにＭＲＩ検査前に注射し、これによって像コントラストおよび感受性 を改善することからなる生体内磁気共鳴像形成（ＭＢＩ）を高める方法。 １６．（ａ）請求の範囲１２に記載の式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）細胞障害有効量の前記注射しうる溶液を特異的抗原を有する細胞を有する と思われる受容体に注射し、これによって共役体の反応性生体分子部分を前記細 胞の特異的抗原と結合させ、錯体の金属からの放射発光が前記細胞を殺すことか らなる特異的抗原を有する細胞の選択的生体内破壊方法。 １７．酢酸ランタン（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント（４−ア ミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 １８．チオシアン酸ランタン（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント （４−アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 １９．チオシアン酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダ ント（４−アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体 。 ２０．酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント（４ −アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ２１．酢酸テルビウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント（４− アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ２２．酢酸イットリウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント（４ −アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘギサ−アザ−大環状錯体。 ２３．チオシアン酸イットリウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダ ント（４−アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体 。 ２４．酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による請求の範囲１０記載のペンダント（４ −アミノフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ２５．エンハンサーによる請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニ ル）メチル基を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による機能化ヘキサ−アザ− 大環状錯体の蛍光増強。 ２６．１，３−ジフェニルプロパン−１，３−ジオンのナトリウム塩による請求 の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチル基を有する酢酸ユー ロピウム（ＩＩＩ）による機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体の蛍光増強。 ２７．４，４，４−トリフルオロ−ト−（２−チェニル）ブタン−１，３−ジオ ンによる請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチル基を有 する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体の蛍光 増強 ２８．ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ ＰＤＰ）を用いる請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチ ル基を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大環状錯体のストレ プタピジンヘのカップリング。 ２９．グルタルアルデヒドを用いる請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミ ノフェニル）メチル基を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大 環状錯体の抗体へのカップリング。 ３０．スルホサクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ）を用いる請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノ フェニル）メチル基を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大環 状錯体の抗体へのカップリング。 ３１．請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチル基を有す る酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）大環状錯体のフローサイトメトリーについての免 疫的染色としての使用。 ３２．請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチル基を有す る酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）大環状錯体の蛍光顕微鏡についての免疫的染色と しての使用。 ３３．請求の範囲２４記載のペンダント（４−アミノフェニル）メチル基を有す る酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）大環状錯体の固相免疫検定についての免疫的染色 としての使用。 ３４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはヒドロキンメチル、Ｒはメチル、Ｘは窒素およびｎは３を示す）で 表わされる請求の範囲３記載の化合物。 ３５．酢酸ランタン（ＩＩＩ）による請求の範囲３４記載のペンダントヒドロキ シメチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ３６．酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による請求の範囲３４記載のペンダントヒド ロキシメチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ３７．式 （式中、Ｑはヒドロキシフェニル、Ｒはメチル、Ｘは窒素およびｎは３を示す） で表わされる請求の範囲３記載の化合物。 ３８．酢酸テルビウム（ＩＩＩ）による請求の範囲３７記載のペンダント（４− ヒドロキシフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ３９．酢酸ランタン（ＩＩＩ）による請求の範囲３７記載のペンダント（４−ヒ ドロキシフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ４０．酢酸イットリウム（ＩＩＩ）による請求の範囲３７記載のペンダント（４ −ヒドロキシフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ４１．ウラニルイオンによる請求の範囲３７記載のペンダント（４−ヒドロキシ フェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ４２．酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）による請求の範囲３７記載のペンダント（４ −ヒドロキシフェニル）メチル基を有する機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ４３．エンハンサーによる請求の範囲４２記載のペンダント（４−ヒドロキシフ ェニル）メチル基を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大環状 錯体の蛍光増強。 ４４．１，３−ジフェニルプロバン−１，３−ジオンのナトリウム塩による請求 の範囲４２記載のペンダント（４−ヒドロキシフェニル）メチル基を有する酢酸 ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大環状錯体の蛍光増強。 ４５．４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チェニル）ブタン−１，３−ジオ ンによる請求の範囲４２記載のペンダント（４−ヒドロキシフェニル）メチル基 を有する酢酸ユーロピウム（ＩＩＩ）のヘキサ−アザ−大環状錯体の蛍光増強。 ４６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素、メチル、直鎖アルキル、側鎖アルキル、アリール−置換アル キル、アリールおよびアルキル−置換アリールからなる群から選択する置換基（ 但し、前記置換基から生成錯体の溶解性を制限しないか、または合成中、前記錯 体の環化を妨げないという条件で）を示し；Ｍは原子番号５７〜７１のランタニ ド、原子番号８９〜１０３のアクチニドおよび原子番号３９のイットリウム（Ｉ ＩＩ）からなる群から選択する金属イオンを示し； ＸはＸで示す位置においてビリジン、チオフェンまたはフランからなる群から選 択する環構造の部分を形成する窒素、硫黄または酸素を示し； Ｑは機能化メチル、機能化直鎖アルキル、機能化側鎖アルキル；機能化アリール −アルキル、機能化アリールおよび機能化アルキル−アリールからなる群から選 択する置換基（但し、前記置換基の基が前記置換基とブリッジ／結合部分との間 にカップリング官能性を与えて受容体分子または相当する受容体分子である存在 物により誘導化することができるという条件で）を示し； ｎは２〜３の整数を示し； Ｙはアセテート、カルボキシレート、スルホネート、ハロゲン化物、ニトレート 、バークロレート、チオシアネートおよびビクラートを包含する負に帯電したイ オン（但し、陰イオンが生成錯体の溶解性を制限しないか、またはカッブリング 処理または蛍光を導びくエネルギー移動を妨げるという条件で）を示し； ｎは大環状錯体における金属イオンのイオン電荷を示し；および ｙは大環状錯体における対イオン電荷を示す）で表わされる化合物。 ４７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはヒドロキシ、Ｒは水素、Ｘは窒素およびｎは３を示す）で表わされ る請求の範囲４６記載の化合物。 ４８．ペンダントヒドロキシ基を有する酢酸ランタン（ＩＩＩ）による請求の範 囲４７記載の化合物の機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ４９．請求の範囲４８記載のベンダントカルボン酸基を有するランタン（ＩＩＩ ）の機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ５０．請求の範囲４７記載のベンダントカルボン酸基を有するユーロピウム（Ｉ ＩＩ）の機能化ヘキサ−アザ−大環状錯体。 ５１．請求の範囲５０記載のベンダントカルボン酸基を有するユーロピウム（Ｉ ＩＩ）のヘキサ−アザ−大環状錯体の蛍光増強。 ５２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａは大環状錯体の末端反応基と反応性生体分子または特異的反応性対の メンバーとの間の結合基を示す）で表わされる結合基を有する大環状錯体を含む 請求の範囲４６記載の化合物の共役体。 ５３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中、Ｚは反応性生体分子、または特異的反応性対のメンバーを示し、お よびａは０〜１の整数を示す）で表わされる請求の範囲５２記載の共役体。 ５４（ａ）関連する検体を含有をすると思われる試料を、請求の範囲５３に記載 する式の共役体と反応媒質において結合条件下で接触させ、これにより前記共役 体の反応性生体分子部分および試料の検体を互いに接触させるか、または検体と 相互作用するのに特異的な結合材料とのおよび前記検体を模擬する前記共役体の 生体分子部分との相互作用のために競合し；および、 （ｂ）反応媒質を監視して （１）共役体の存在； （２）共役体と検体との相互作用の生成物の存在；および（３）共役体と結合材 料との相互作用の生成物の存在の１つを検出する関連する検体を含有すると思わ れる試料の分析方法。 ５５．（ａ）請求の範囲５３に記載する式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）像形成に有効量の前記注射しうる溶液を関連する細胞検体を有すると思わ れる受容体に注射し、これにより共役体の反応性生体分子部分を関連する検体と 相互に作用させ；および （ｃ）関連する細胞検体について前記受容体を前記受容体における前記共役体の 検出によって監視することからなる関連する細胞検体の生体内標識付け方法。 ５６．（ａ）請求の範囲５３に記載する式の共役体の注射しうる溶液を得；およ び （ｂ）像形成に有効量の前記注射しうる溶液を受容体に、プロトン緩和を高める 目的のためにＭＲＩ検査前に注射し、これによって像コントラストおよび感受性 を改善することからなる生体内磁気共鳴像形成（ＭＲＩ）を高める方法。 ５７．（ａ）請求の範囲５３に記載する式の共役体の注射しうる溶液を得； （ｂ）細胞障害有効量の前記注射しうる溶液を特異的抗原を有する細胞を有する と思われる受容体に注射し、これによって共役体の反応性生体分子部分を前記細 胞の特異的抗原と結合させ、錯体の金属からの放射発光が前記細胞を殺すことか らなる特異的抗原を有する細胞の選択的生体内破壊方法。