JPS60243052A - 種結合ジアミン三酢酸の金属キレ−ト - Google Patents
種結合ジアミン三酢酸の金属キレ−トInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の主体は、全農キレートヲ形成し得るジアミン三
詐酸である。より詳細には、本発明は、金属イオンを有
機種、たとえば有機ターゲット分子または抗体に結合さ
せるのに有効な、好ましくは、螢光分析技術に有効な種
結合螢光希土類金属キレートを形成するのに有効な、二
官能配泣子に関する。
詐酸である。より詳細には、本発明は、金属イオンを有
機種、たとえば有機ターゲット分子または抗体に結合さ
せるのに有効な、好ましくは、螢光分析技術に有効な種
結合螢光希土類金属キレートを形成するのに有効な、二
官能配泣子に関する。
螢光技術は、化学および生化学および医学分析で用途が
増大しつつある。螢光測定１去は本質的に −は著しく
敏感なものである。これら測定法は放射、線に伴う危険
なしに、少なくとも放射化学法の感度を提供することが
できる。
増大しつつある。螢光測定１去は本質的に −は著しく
敏感なものである。これら測定法は放射、線に伴う危険
なしに、少なくとも放射化学法の感度を提供することが
できる。
米国特許第４，１５０，２９５および第４，０５８，７
３２号各明細書（各々１９７９年４月１７日付および１
９７７（１９７８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）の
６７〜８０頁の章には、周囲の螢光に比較して長い崩壊
ライフタイムを有する発螢光団を用すて非螢′元種を螢
光的に定量する一般的概念が開示されている。この方法
では、原子規模螢光タッグ（ｔａｇ）（発螢光団）；社
種の個々の分子に化学的に共有結合的に固定される。こ
の種は、有機ターゲット分子自身であることができまた
はターゲット分子と本質的に同じ分子であることができ
また（はターゲット分子に特異の抗体であることができ
る。分析形態に応じて適当な手順後、タッグされた種は
励起され、上記３つの文献に教示されているタイムゲ、
） （ｔｉｍｅ−ｇａｔｅｄ ）技術を用いて、上記踵
の螢光が測定される。観察された螢光の大きさおよび画
風って用意した螢光／濃度標准曲線を用いて。
３２号各明細書（各々１９７９年４月１７日付および１
９７７（１９７８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈ
ｏ１ｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）の
６７〜８０頁の章には、周囲の螢光に比較して長い崩壊
ライフタイムを有する発螢光団を用すて非螢′元種を螢
光的に定量する一般的概念が開示されている。この方法
では、原子規模螢光タッグ（ｔａｇ）（発螢光団）；社
種の個々の分子に化学的に共有結合的に固定される。こ
の種は、有機ターゲット分子自身であることができまた
はターゲット分子と本質的に同じ分子であることができ
また（はターゲット分子に特異の抗体であることができ
る。分析形態に応じて適当な手順後、タッグされた種は
励起され、上記３つの文献に教示されているタイムゲ、
） （ｔｉｍｅ−ｇａｔｅｄ ）技術を用いて、上記踵
の螢光が測定される。観察された螢光の大きさおよび画
風って用意した螢光／濃度標准曲線を用いて。
ターゲットの量が測定される。
そのような決定において有効な発螢光団およびタッグ種
は、長め螢光崩壊ライフタイムを有しかつ分析期間中螢
光を発する能力を保持するのが理想的である。敏感な分
析には、発螢光団およびそれの他の種との結合は、非常
に低い濃度、たとえばナノグラム／ｃｃの範囲およびそ
れ以下のたとえばフェムトグラム（ｆｅｍｔｏｇｒａｍ
）／ ｃｃの範囲におりでさえ安定であることが重要
である。多くの免疫分析にとっては、発螢光団は免疫反
応性を保持する環境で抗体と反応せしめられるように水
溶性であることが望ましい。
は、長め螢光崩壊ライフタイムを有しかつ分析期間中螢
光を発する能力を保持するのが理想的である。敏感な分
析には、発螢光団およびそれの他の種との結合は、非常
に低い濃度、たとえばナノグラム／ｃｃの範囲およびそ
れ以下のたとえばフェムトグラム（ｆｅｍｔｏｇｒａｍ
）／ ｃｃの範囲におりでさえ安定であることが重要
である。多くの免疫分析にとっては、発螢光団は免疫反
応性を保持する環境で抗体と反応せしめられるように水
溶性であることが望ましい。
本発明の金属キレートは、その範囲内に、これらの所望
の特性のすべてを有する種結合配位子の一群を包含する
。さら忙、本発明の金属キレートは製造が簡単でかつ廉
価である。
の特性のすべてを有する種結合配位子の一群を包含する
。さら忙、本発明の金属キレートは製造が簡単でかつ廉
価である。
最も広い意味で述べれば、本発明は、官能基■
−Ｎ−Ｈ，−Ｎ−Ｈｌ−０−Ｈ４たは−５−Ｈ（Ｄ少な
くと■ 、も一種を有する有機種（本発明においてＩＴＪと称す
）を、ジアミン四酢酸の４個のカルボキシル基の１つ、
および本質的に１つのみを結合させて一般式１（Ｒは２
個まだはそれ以上の原子長共有結合型ブリッジ（以下、
単に共有結合ブリッジと称す）であり、Ｌは種分子Ｔ上
の上記官能基の脱プロトン化等個物（ｄｅｐｒｏｔｏｒ
＋ａｔｅｄ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ）である）で示さ
−れる形状を有する安定な構造を形成することかできる
ということである。
くと■ 、も一種を有する有機種（本発明においてＩＴＪと称す
）を、ジアミン四酢酸の４個のカルボキシル基の１つ、
および本質的に１つのみを結合させて一般式１（Ｒは２
個まだはそれ以上の原子長共有結合型ブリッジ（以下、
単に共有結合ブリッジと称す）であり、Ｌは種分子Ｔ上
の上記官能基の脱プロトン化等個物（ｄｅｐｒｏｔｏｒ
＋ａｔｅｄ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ）である）で示さ
−れる形状を有する安定な構造を形成することかできる
ということである。
Ｔは１個以上のＬ基を含有することができるので、１個
以上のジアミン三酢酸をこの穴内に共有結合させること
ができる。
以上のジアミン三酢酸をこの穴内に共有結合させること
ができる。
これらの共有結合生成物（式Ｉ）を「種結合ジアミン三
酸」と呼ぶ。これらの生成物は種々の金属イオンと安定
なキレートを形成する。これらのキレート錯体（式■）
は、本発明の他の面を構成する。
酸」と呼ぶ。これらの生成物は種々の金属イオンと安定
なキレートを形成する。これらのキレート錯体（式■）
は、本発明の他の面を構成する。
（式中、Ｍはジアミントリーまたはテトラ酸と配位錯体
を形成することができる金属イオンである。）好ましい
実施態様においては、金属イオンＭは、螢光キレート錯
体を形成し得る希土：頃金属のイオンである。
を形成することができる金属イオンである。）好ましい
実施態様においては、金属イオンＭは、螢光キレート錯
体を形成し得る希土：頃金属のイオンである。
本発明の第三の面において、特に好ましい錯体は、活性
剤まだはフラツダー（ｆｌｏｏｄｅｒ ）たとえばサリ
チル酸も又希土類金属イオンおよび種結合ジアミントリ
酸と三成分錯体結合として存在する場合に形成される。
剤まだはフラツダー（ｆｌｏｏｄｅｒ ）たとえばサリ
チル酸も又希土類金属イオンおよび種結合ジアミントリ
酸と三成分錯体結合として存在する場合に形成される。
第四の面において、本発明は有機種Ｔ、たとえくとも１
個を含有するターゲット分子または抗体の濃度または存
在を測定する方法を提供する。この方法は、そのような
種分子を一般弐■の（Ｒは２個またはそれ以−ヒの原子
長共有結合ブリッジである） ジアミン四酢酸二無水化物の実質的過剰量と、種分子上
の上記基の少なくとも１つと二無水化物の無水物基の１
つとの反応を行う条件下で接触させて°種結合ジアミン
トリ酸無水物を生成し；残りの無水物基金加水分解して
種結合ジアミントリ酸を生成し；上記種結合ジアミン）
ＩＪ酸を溶解して希土類金属イオンと混合して種結合
希土類キレート全形成し；次いで、随意に問題の分析の
種類に応じて適当な手順後、この種結合希土類キレート
を活性剤たとえばサリチル酸でフラッド（ｆｌｏｏｄ
）し；上記螢光錯体の螢光強度を測定し、；そして観察
された螢光強度をそのような螢光錯体の公知濃度の螢光
強度に関連づけることを包含する。
個を含有するターゲット分子または抗体の濃度または存
在を測定する方法を提供する。この方法は、そのような
種分子を一般弐■の（Ｒは２個またはそれ以−ヒの原子
長共有結合ブリッジである） ジアミン四酢酸二無水化物の実質的過剰量と、種分子上
の上記基の少なくとも１つと二無水化物の無水物基の１
つとの反応を行う条件下で接触させて°種結合ジアミン
トリ酸無水物を生成し；残りの無水物基金加水分解して
種結合ジアミントリ酸を生成し；上記種結合ジアミン）
ＩＪ酸を溶解して希土類金属イオンと混合して種結合
希土類キレート全形成し；次いで、随意に問題の分析の
種類に応じて適当な手順後、この種結合希土類キレート
を活性剤たとえばサリチル酸でフラッド（ｆｌｏｏｄ
）し；上記螢光錯体の螢光強度を測定し、；そして観察
された螢光強度をそのような螢光錯体の公知濃度の螢光
強度に関連づけることを包含する。
第五の面において、本発明は式■の１個またはジアミン
トリ酸分子を共有結合して有する抗体を形成し；上記抗
体結合トリ酸の希土類キレートを形成し；結合抗体のち
る量をターゲット分子を含有すると思われるｍ＠、液体
まだは固体基体にさらして上記ターゲットを抗体に結合
させ；過剰の未結合抗体を除去し；液体１組織または固
体基体に、希土類トリ酸キレートに特異の螢光活性剤を
フラッドさせ＝そして螢光を上記ターゲット分子の量ま
たは存在のインジケーターとして測定または検出すると
とにより、ターゲット分子の存在または量を検出する方
法を提供する。
トリ酸分子を共有結合して有する抗体を形成し；上記抗
体結合トリ酸の希土類キレートを形成し；結合抗体のち
る量をターゲット分子を含有すると思われるｍ＠、液体
まだは固体基体にさらして上記ターゲットを抗体に結合
させ；過剰の未結合抗体を除去し；液体１組織または固
体基体に、希土類トリ酸キレートに特異の螢光活性剤を
フラッドさせ＝そして螢光を上記ターゲット分子の量ま
たは存在のインジケーターとして測定または検出すると
とにより、ターゲット分子の存在または量を検出する方
法を提供する。
本発明の詳細な説明は、次の部分に分けられる：種結合
ジアミントリ酸化合物、 金属錯体、 フラツダーとの三成分結合。
ジアミントリ酸化合物、 金属錯体、 フラツダーとの三成分結合。
調製方法、
種分子、および
分析技術。
種結合シアミントす酸化合物
これらの化合物は、一般式Ｉで示される構造を有する。
式Ｉにおいて、Ｒは２つまだはそれ以上の原子共有結合
ブリッジである。２個またはそれ以上の原子はブリッジ
自身中の原子を指す。これらの原子は所望なら他の原子
または基で置換することができる。Ｒの機能は、間隔を
あけて離れている２個のアミンジ酢酸基を互いに共有結
合させて２個のアミンジ酢酸基に金属イオンでもって安
定な化合物を形成させることである。したがってアミン
ジ酢酸基のキレート形成能を妨害することなくこの機能
を果すいかなる基もＲとして使用することができる。
ブリッジである。２個またはそれ以上の原子はブリッジ
自身中の原子を指す。これらの原子は所望なら他の原子
または基で置換することができる。Ｒの機能は、間隔を
あけて離れている２個のアミンジ酢酸基を互いに共有結
合させて２個のアミンジ酢酸基に金属イオンでもって安
定な化合物を形成させることである。したがってアミン
ジ酢酸基のキレート形成能を妨害することなくこの機能
を果すいかなる基もＲとして使用することができる。
Ｒは、炭素−ｅ素エーテルブリッジ、炭素−窒素ポリア
ルキル第二または第三アミドブリッジおよびすべて未置
換かまたはブリッジから垂下していル置換基を含有する
アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレンを包含
する炭素−炭素ブリッジから選ばれる随意に置換された
２〜８原子共、有結合ブリッジであるのが好ましい。置
換基としてたとえば、１〜約１０炭素原子のアルキル、
６〜１０炭素原子のアリール、７〜約１４炭素原子のア
ラルキルおよびアルカリールが挙げられる。ブリッジま
だは前述した置換基は、カルボキシル、カルボニル、エ
ーテル、カルバメート、第ニアミド、スルホネート、サ
ルファメート等で置換することもできる。Ｒ基の例とし
て、エチレン、ｎ−プロピレン、インプロピレン、ｎ−
ブチレンを含む種々のブチレン、１−および２−メチル
プロピレン、１−プロピルエチレン、１−シクロヘキシ
ルエチレン、１−フェニルエチレン、アルキル！換１−
フェニルエチレンおよびプロピレン、ｌ−ベンジルエチ
レン、２−アミドプロピレン、シクロへキシル−１，２
−エン、フェニル−１，３−エン、ジエチレン−エーテ
ル−ＣＨ２−ＣＩＦ（２−０−ＣＨ２−ＣＨ２−、トリ
エチレンジエーテル−ＣＨ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−等が挙げられる。この例は
総括的なものではなく、Ｒ基の典聾的実施態様を単に示
すだけである。
ルキル第二または第三アミドブリッジおよびすべて未置
換かまたはブリッジから垂下していル置換基を含有する
アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレンを包含
する炭素−炭素ブリッジから選ばれる随意に置換された
２〜８原子共、有結合ブリッジであるのが好ましい。置
換基としてたとえば、１〜約１０炭素原子のアルキル、
６〜１０炭素原子のアリール、７〜約１４炭素原子のア
ラルキルおよびアルカリールが挙げられる。ブリッジま
だは前述した置換基は、カルボキシル、カルボニル、エ
ーテル、カルバメート、第ニアミド、スルホネート、サ
ルファメート等で置換することもできる。Ｒ基の例とし
て、エチレン、ｎ−プロピレン、インプロピレン、ｎ−
ブチレンを含む種々のブチレン、１−および２−メチル
プロピレン、１−プロピルエチレン、１−シクロヘキシ
ルエチレン、１−フェニルエチレン、アルキル！換１−
フェニルエチレンおよびプロピレン、ｌ−ベンジルエチ
レン、２−アミドプロピレン、シクロへキシル−１，２
−エン、フェニル−１，３−エン、ジエチレン−エーテ
ル−ＣＨ２−ＣＩＦ（２−０−ＣＨ２−ＣＨ２−、トリ
エチレンジエーテル−ＣＨ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−等が挙げられる。この例は
総括的なものではなく、Ｒ基の典聾的実施態様を単に示
すだけである。
製造が簡単なことから、長さが２〜５炭素、好ましくけ
２〜４炭素の未置換アルキレンが好ましいＲであり、エ
チレンおよびプロピレンがより好ましく、エチレンが最
も好ましいＲである。
２〜４炭素の未置換アルキレンが好ましいＲであり、エ
チレンおよびプロピレンがより好ましく、エチレンが最
も好ましいＲである。
本発明の種結合ジアミントリ酸化合物は、第一または第
ニアミド窒素、エステル酸素またはチオエステル硫黄で
ある１個またはそれ以上の官能性りを含有する。Ｌの各
単位は、ジアミン配立子の１単位と種分子Ｔ間の共有結
合リンクとして働く。
ニアミド窒素、エステル酸素またはチオエステル硫黄で
ある１個またはそれ以上の官能性りを含有する。Ｌの各
単位は、ジアミン配立子の１単位と種分子Ｔ間の共有結
合リンクとして働く。
Ｌの選定はＬが種分子上に存在するアミン（第−捷たは
第二）、ヒドロキシルまたはチオールから誘導され得る
ので種分子の性質により決定される。
第二）、ヒドロキシルまたはチオールから誘導され得る
ので種分子の性質により決定される。
・一般に、アミド窒素が好ましいＬ基であシ、アミド基
（したがってＴ上の第一アミン基から誘導される）が最
も好ましい。
（したがってＴ上の第一アミン基から誘導される）が最
も好ましい。
本発明の種結合ジアミントリ酸化合物は、２個のアミン
基を含有し、その１つは２個の酢酸基を担持し、もう一
方は１個の酢酸基と１個の酢酸／Ｌ−Ｔ付加物を担持す
る。簡単のだめ、本明細書および特許請求の範囲におい
て、３個の酢酸基がプロトン化（ｐｒｏｉｏｎａｔｅｄ
）形として示されている。
基を含有し、その１つは２個の酢酸基を担持し、もう一
方は１個の酢酸基と１個の酢酸／Ｌ−Ｔ付加物を担持す
る。簡単のだめ、本明細書および特許請求の範囲におい
て、３個の酢酸基がプロトン化（ｐｒｏｉｏｎａｔｅｄ
）形として示されている。
実際には、弱酸であるこれらの基は示されてｂるプロト
ン化形と対応する脱プロトン塩形−ＣＯＯ−との間で平
衡をなして存在することは理解されるであろう。２つの
形態の正確な割合は、使用環境のｐｌ（および組成によ
る。示されているプロトン化形は実際に存在する２つの
形態の平衡を表わすことが意図されている。
ン化形と対応する脱プロトン塩形−ＣＯＯ−との間で平
衡をなして存在することは理解されるであろう。２つの
形態の正確な割合は、使用環境のｐｌ（および組成によ
る。示されているプロトン化形は実際に存在する２つの
形態の平衡を表わすことが意図されている。
金属錯体
本発明の種結合ジアミントル酸は有効なキレート形成配
位子である。それらの錯体形成能は、対応する非種結合
ジアミン四酢酸配位子（たとえばエチレンジアミン四酢
酸−ＥＤＴＡ ）のそれと本質的に同じでなくとも、同
様であると思われる。さらに種への結合において使用さ
れるけれども、第四カルボニル基は金属イオンとの配位
点として機能することができ、したがって、本発明のジ
アミン） ＩＪ酸と共に形成された錯体の解離定数は当
業界のジアミン四酢酸で得られる錯体のそれと非常に頓
イ以していると思われる。
位子である。それらの錯体形成能は、対応する非種結合
ジアミン四酢酸配位子（たとえばエチレンジアミン四酢
酸−ＥＤＴＡ ）のそれと本質的に同じでなくとも、同
様であると思われる。さらに種への結合において使用さ
れるけれども、第四カルボニル基は金属イオンとの配位
点として機能することができ、したがって、本発明のジ
アミン） ＩＪ酸と共に形成された錯体の解離定数は当
業界のジアミン四酢酸で得られる錯体のそれと非常に頓
イ以していると思われる。
錯化され得る金属イオンＭとして放射ｊ生ヌクレオチド
のイオンならびに非放射性金、属イオンが挙げられる。
のイオンならびに非放射性金、属イオンが挙げられる。
広範に証明されていないけれども、金属イオンとＥＤＴ
Ａおよびその非種結合同族体との当業界で公知の錯体の
実質的すべては、本発明の種結合配位子を用いて調製で
きるようである。たとえば、錯体は遷移金属およびアク
チニド系列ならびにランタニド系列の希土類金属のイオ
ンに等しいＭでもって形成することができる。Ｍにより
表わされる金属イオンの例として、Ａ、 ＋＋＋、十＋
＋ ＋＋＋ ＋＋＋ Ａｍ 、Ｃｄ 、Ｃｅ 、 ＋＋＋ ＋＋＋Ｃｆ 、Ｃ
ｍ 。
Ａおよびその非種結合同族体との当業界で公知の錯体の
実質的すべては、本発明の種結合配位子を用いて調製で
きるようである。たとえば、錯体は遷移金属およびアク
チニド系列ならびにランタニド系列の希土類金属のイオ
ンに等しいＭでもって形成することができる。Ｍにより
表わされる金属イオンの例として、Ａ、 ＋＋＋、十＋
＋ ＋＋＋ ＋＋＋ Ａｍ 、Ｃｄ 、Ｃｅ 、 ＋＋＋ ＋＋＋Ｃｆ 、Ｃ
ｍ 。
＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋−１−十Ｃｏ
、Ｃｏ 、Ｃｒ 、Ｃｒ ＋Ｃｕ ＋Ｄｙ ｓ＋＋＋
＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋Ｅｒ 、Ｅｕ 、Ｆｅ
、Ｆｅ ％Ｇａ 。
、Ｃｏ 、Ｃｒ 、Ｃｒ ＋Ｃｕ ＋Ｄｙ ｓ＋＋＋
＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋Ｅｒ 、Ｅｕ 、Ｆｅ
、Ｆｅ ％Ｇａ 。
＋＋＋ 十＋ 十＋＋ ＋＋十’ ＋＋＋Ｇｄ 、Ｈｇ
、Ｈｏ 、Ｉｎ 、Ｌａ 、＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋
十← ＋＋十十Ｌｕ 、Ｍｎ 、Ｍｎ 、Ｎｄ 、Ｎ＋
、Ｐｂ 。
、Ｈｏ 、Ｉｎ 、Ｌａ 、＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋
十← ＋＋十十Ｌｕ 、Ｍｎ 、Ｍｎ 、Ｎｄ 、Ｎ＋
、Ｐｂ 。
＋＋ ＋← ＋← 十← ＋＋＋＋
Ｐｄ 、Ｐｍ 、Ｐｒ 、Ｐｕ 、Ｐｕ 。
＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋−＋−８ｂ
、Ｓｃ 、Ｓｍ ｓｓｍ ｓＳｎ 、Ｔｂ 。
、Ｓｃ 、Ｓｍ ｓｓｍ ｓＳｎ 、Ｔｂ 。
＋＋← 、＋＋十＋＋＋ ＋＋−１−＋十＋Ｔｈ、Ｔ＋
、ＴＩ、Ｔｍ、Ｖ。
、ＴＩ、Ｔｍ、Ｖ。
■＋＋＋十＋、Ｖｏ２＋、Ｙ＋＋＋、Ｙｂ十＋＋、ｚｎ
＋＋、およびＺｒ＋＋−＋−＋が挙げられる。
＋＋、およびＺｒ＋＋−＋−＋が挙げられる。
配合可能な金属イオンの範囲およびそのような金属イオ
ンが示す特性の広範囲および多様性のために、本発明に
よる金属イオン錯体は化学分析の分野で有効に使用され
る。本発明により種分子に結合された金属イオンの存在
は、配合された金属イオンに応じて放射能分析、Ｘ線散
乱または螢光、ＮＭＲまたはＥＳＲシフトのような技術
により検出することができる。好ましい実施態様では、
使用される金属イオンはＥＤＴＡ型キレート化配泣子と
錯体を形成する希土類金属イオンである。これらの中で
、テルビウム、ジスプロシウム、ユウロピウム、サマリ
ウムおよびネオジムが好ましく、テルビウムおよびユウ
ロピウムがよシ好ましく、チル♂ウムが金属イオンＭを
形成するのに最も好ましい希土類である。
ンが示す特性の広範囲および多様性のために、本発明に
よる金属イオン錯体は化学分析の分野で有効に使用され
る。本発明により種分子に結合された金属イオンの存在
は、配合された金属イオンに応じて放射能分析、Ｘ線散
乱または螢光、ＮＭＲまたはＥＳＲシフトのような技術
により検出することができる。好ましい実施態様では、
使用される金属イオンはＥＤＴＡ型キレート化配泣子と
錯体を形成する希土類金属イオンである。これらの中で
、テルビウム、ジスプロシウム、ユウロピウム、サマリ
ウムおよびネオジムが好ましく、テルビウムおよびユウ
ロピウムがよシ好ましく、チル♂ウムが金属イオンＭを
形成するのに最も好ましい希土類である。
金属イオンＭと謹結合ジアミントリｅ間で形成される錯
体は、１：１等モル金属：キレート錯体であると考えら
れる。それは構造的には一般式■として与えられる構造
により表わされる。
体は、１：１等モル金属：キレート錯体であると考えら
れる。それは構造的には一般式■として与えられる構造
により表わされる。
フラツダーとの三成分組合せ
、本発明の種結合ジアミントリ酸の好ましい用途は、螢
光希土類金属錯体のキレート配位子として使用すること
である。これら錯体の螢光分析技術での有効性は錯体に
第三成分が存在する場合に実質的に高められることが見
い出された。この第三成分である促進剤は、普通大過剰
に添加されるので「フラッダー」と総称される。促進剤
または増感剤とも称されるフラッダーは、希土類キレー
トの螢光励起効率を増大させるもので、非種結合希土類
イオンおよびキレート中に開示されている。
光希土類金属錯体のキレート配位子として使用すること
である。これら錯体の螢光分析技術での有効性は錯体に
第三成分が存在する場合に実質的に高められることが見
い出された。この第三成分である促進剤は、普通大過剰
に添加されるので「フラッダー」と総称される。促進剤
または増感剤とも称されるフラッダーは、希土類キレー
トの螢光励起効率を増大させるもので、非種結合希土類
イオンおよびキレート中に開示されている。
ＤａｇｎａｌｌらのＡＮＡＬＹＳＴ、 ９２．３５８−
３６３ 、 （１９６７）；９４９−９５５． （１９
６５） ； 隨Ｃａｒｔｈｙ ａｎｄ Ｗｒｎｅｆｏｒ
ｄｒ＋ｅｒ 。
３６３ 、 （１９６７）；９４９−９５５． （１９
６５） ； 隨Ｃａｒｔｈｙ ａｎｄ Ｗｒｎｅｆｏｒ
ｄｒ＋ｅｒ 。
ＡＮＡＬ、 ＣＨＥＭ、 、 ３８．８４８ （１９６
６） ； ＴａｋｅｔａｔｓｕらノＴＡＬＡＮＴＡ、
１３ 、１０８１−１０８７． （１９６６） ；ＣＨ
ＥＭ 、 、翻、 ５２９−５３６ 、 （１９６６）
参照。これらの文献および有効なフラッダーの記載は、
参考として本発明において引用するものとする。これは
完全なリストではないが、本発明の種結合ジアミントリ
酸と共に使用できるフラッド剤（ｆｌｏｏｄｉｎｇａｇ
ｅｎｔ、 ） の多数を示唆するものである。
６） ； ＴａｋｅｔａｔｓｕらノＴＡＬＡＮＴＡ、
１３ 、１０８１−１０８７． （１９６６） ；ＣＨ
ＥＭ 、 、翻、 ５２９−５３６ 、 （１９６６）
参照。これらの文献および有効なフラッダーの記載は、
参考として本発明において引用するものとする。これは
完全なリストではないが、本発明の種結合ジアミントリ
酸と共に使用できるフラッド剤（ｆｌｏｏｄｉｎｇａｇ
ｅｎｔ、 ） の多数を示唆するものである。
これらフラッダーの多くは、配位性を有しかつ種結合ジ
アミントリ酸配位子によりすでに占められていない席上
・鰯金属イオン上の場所を占拠することにより作用する
と思われる。そうすることにより、フラッダーは金属イ
オンと緊密に結合し、ンラツダーから希土類金橘への効
果的なエネルギー転移を可能にする。
アミントリ酸配位子によりすでに占められていない席上
・鰯金属イオン上の場所を占拠することにより作用する
と思われる。そうすることにより、フラッダーは金属イ
オンと緊密に結合し、ンラツダーから希土類金橘への効
果的なエネルギー転移を可能にする。
錯体形成フラツダーの例は、５−スルホサリチルｆｆ（
５−８ＳＡ）、４−アミンサリチル酸、サリチル酸、他
の置換サリチル酸、ジピコリン酸等である。これらの物
質はテルビウム錯体に対して特に有効であり、その応用
がそれらの作用を証明する。
５−８ＳＡ）、４−アミンサリチル酸、サリチル酸、他
の置換サリチル酸、ジピコリン酸等である。これらの物
質はテルビウム錯体に対して特に有効であり、その応用
がそれらの作用を証明する。
種結合ジアミントリ酸とテルビウムの錯体は、は”１２
４００Ｘの励起帯を呈する。これは比較的弱−帯域であ
り、この波長では、スペクトルの便利な部分ではない。
４００Ｘの励起帯を呈する。これは比較的弱−帯域であ
り、この波長では、スペクトルの便利な部分ではない。
５−３ＳＡ をフラッダーとして添加すると、はｘ３１
ｏｏＸの近紫外に強い励起帯が観察され、この波長はサ
ンプル透過の見地からはるかに便宜的な波長である。
ｏｏＸの近紫外に強い励起帯が観察され、この波長はサ
ンプル透過の見地からはるかに便宜的な波長である。
ユウロピウムに対して特に有効なフラッダーの例として
、塩たとえば炭酸カリウム、タングステン酸ナトリウム
等、および有機物質たとえばフェナントロリンが挙げら
れる。
、塩たとえば炭酸カリウム、タングステン酸ナトリウム
等、および有機物質たとえばフェナントロリンが挙げら
れる。
種結合ジアミントリ酸の濃度が高１ハたとえば１０・〜
１０ Ｍである場合（この場合フラッダー濃度は同じで
ある）を除いて、フラッダーの使用量は種結合ジアミン
トリ酸の量に対して非常に多い。
１０ Ｍである場合（この場合フラッダー濃度は同じで
ある）を除いて、フラッダーの使用量は種結合ジアミン
トリ酸の量に対して非常に多い。
モル基漁で金属イオンまだはジアミントリ酸の少なくと
も１０ 倍のフラッグ−を使用することが−般に好まし
く、１０３〜１０１０のモル過剰がよシ好ましい。これ
らの大過剰は、フラツダーージアミン錯体の安定性がジ
アルカリ土類金属間の錯体の安定性より何分の１も低い
ため要求される。
も１０ 倍のフラッグ−を使用することが−般に好まし
く、１０３〜１０１０のモル過剰がよシ好ましい。これ
らの大過剰は、フラツダーージアミン錯体の安定性がジ
アルカリ土類金属間の錯体の安定性より何分の１も低い
ため要求される。
フラツダー含有錯体（ｆｌｏｏｄｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ
）は、すでに形成された希土類キレート錯体を溶解し
たものにフラツダーを添加することにより簡単に形成さ
れる。これは−穀圧、フラツダー含有錯体の螢光を測定
する直前に行われる。確実性を以って知られていないけ
れども、生成するフラツダー含有錯体は、種結合ジアミ
ントリ酸：席上類金属イオンニフラツダーの１：１：１
モル三成分組合せであると思われる。
）は、すでに形成された希土類キレート錯体を溶解し
たものにフラツダーを添加することにより簡単に形成さ
れる。これは−穀圧、フラツダー含有錯体の螢光を測定
する直前に行われる。確実性を以って知られていないけ
れども、生成するフラツダー含有錯体は、種結合ジアミ
ントリ酸：席上類金属イオンニフラツダーの１：１：１
モル三成分組合せであると思われる。
調製方法
−０−Ｈ基を含有しなければならない）ｆｆ：、一般式
■で示されたジアミン四酢酸二無水物の実質的モル過剰
と極性中性液体有機反応媒体中で液相で接触させること
によシ簡単に形成することができる。
■で示されたジアミン四酢酸二無水物の実質的モル過剰
と極性中性液体有機反応媒体中で液相で接触させること
によシ簡単に形成することができる。
有効な反応媒体として、アセトン、ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ ） 、ジメチルスルホキシ）”（ＤＭＳＯ
）および１（ＭＰ Ａ等が挙げられる。これら物質の混
合物も重用できる。種分子上の反応性基がアミン、特に
第一アミンの場合、溶剤として水および水を含有する混
合溶剤を使用することができる。
ド（ＤＭＦ ） 、ジメチルスルホキシ）”（ＤＭＳＯ
）および１（ＭＰ Ａ等が挙げられる。これら物質の混
合物も重用できる。種分子上の反応性基がアミン、特に
第一アミンの場合、溶剤として水および水を含有する混
合溶剤を使用することができる。
この接触は、種の活性基を、ジアミンの２個の無水物基
の１つと反応させる条件下で行われる。
の１つと反応させる条件下で行われる。
種分子の活性基がアミンの場合、接触は穏やかな条件た
とえば約５〜約１００’Ｃ１好ましくは約１０〜約７５
℃の温度で行われる。種の活性基がチオールまたはヒド
ロキシルである場合１．幾らかより激しい条件たとえば
３〜約１５０°Ｃの温度が一般に使用される。この場合
、３５〜約１２５℃の＠変が好ましい。この反応性の差
は、もしそのようにすることが有利であれば、アミン基
との選択的反応を行い、チオールまたはヒドロキシルと
の反応を排除することを行うために利用することができ
る。もちろん、使用される反応時間は使用温１度と逆比
例する。
とえば約５〜約１００’Ｃ１好ましくは約１０〜約７５
℃の温度で行われる。種の活性基がチオールまたはヒド
ロキシルである場合１．幾らかより激しい条件たとえば
３〜約１５０°Ｃの温度が一般に使用される。この場合
、３５〜約１２５℃の＠変が好ましい。この反応性の差
は、もしそのようにすることが有利であれば、アミン基
との選択的反応を行い、チオールまたはヒドロキシルと
の反応を排除することを行うために利用することができ
る。もちろん、使用される反応時間は使用温１度と逆比
例する。
一般に約０．５時間〜約２日の時間が重用され、１〜約
３６時間が好ましい。これらの時間および温度は指標と
して与えられる。ある場合、たとえば著しく熱敏感性ま
たは熱非敏感性ターゲットの場合、こ＼１で示した例示
的範囲外であることが有利なこともある。一般に、これ
らの範囲内でよシ低い温度の使用は無水物と種分子間で
よシ良好な反応選択性をもたらすので好ましい。
３６時間が好ましい。これらの時間および温度は指標と
して与えられる。ある場合、たとえば著しく熱敏感性ま
たは熱非敏感性ターゲットの場合、こ＼１で示した例示
的範囲外であることが有利なこともある。一般に、これ
らの範囲内でよシ低い温度の使用は無水物と種分子間で
よシ良好な反応選択性をもたらすので好ましい。
二無水物の過剰量を使用することは必須である。
少なくとも４：１の二無水物：種分子比を使用すべきで
あＪ、５：１〜約ｌＯ：１の比が好ましい。
あＪ、５：１〜約ｌＯ：１の比が好ましい。
この比の上限は、経済性に基すて任意に決められる。こ
の範囲に要求されるよシ多量の無水物を使用して良好な
結果を得ることができる。そのような操作方式は、本発
明の範囲内であると考えられるが、しかし、過剰の無水
物は続く作業で刃口水分解により破壊されるので無益で
あるとも考えられる。
の範囲に要求されるよシ多量の無水物を使用して良好な
結果を得ることができる。そのような操作方式は、本発
明の範囲内であると考えられるが、しかし、過剰の無水
物は続く作業で刃口水分解により破壊されるので無益で
あるとも考えられる。
本発明で使用される二無水物社、当業界で知られている
物質（米国特許第３．４９７ 、５３５号明細書）であ
るかまたは反応するジアミン四酢酸から、カルボキシル
ジ酸無水物の普通の製造方法によりたとえばテトラ酸を
モル過剰量の無水酢酸および第三アミンの存在下で１５
０℃またはその付近の＠度（すなわち８０〜１８０℃）
に長時間たとえば１２〜３６時間加熱することにより調
製することができる。
物質（米国特許第３．４９７ 、５３５号明細書）であ
るかまたは反応するジアミン四酢酸から、カルボキシル
ジ酸無水物の普通の製造方法によりたとえばテトラ酸を
モル過剰量の無水酢酸および第三アミンの存在下で１５
０℃またはその付近の＠度（すなわち８０〜１８０℃）
に長時間たとえば１２〜３６時間加熱することにより調
製することができる。
種分子を二無水物に結合させた後、残シの無水物基は加
水分解されて対応するジ酢酸とされる。
水分解されて対応するジ酢酸とされる。
この加水分解は、カップリング反応混合物を加水分解す
べき無水物のモル数を超える過剰量の水と混合し、そし
て加熱することによシ容易（で行われる。適当な温度は
、約３０〜約１２５°Ｃである。適当な時間は約１分〜
約２降間である。好ましい温度および時間は、４０〜１
０５℃、および２〜９０分である。別法として、カルボ
ン酸無水物を酸に（たとえば無水酢酸を酢酸に）加水分
解するだめに当業界で知られている池の灸ｆ！＋を使用
することができる。
べき無水物のモル数を超える過剰量の水と混合し、そし
て加熱することによシ容易（で行われる。適当な温度は
、約３０〜約１２５°Ｃである。適当な時間は約１分〜
約２降間である。好ましい温度および時間は、４０〜１
０５℃、および２〜９０分である。別法として、カルボ
ン酸無水物を酸に（たとえば無水酢酸を酢酸に）加水分
解するだめに当業界で知られている池の灸ｆ！＋を使用
することができる。
種結合トリ酸の形成に使用される化学量論過剰量の無水
物（は、種結合物質と分離される。この過剰の無水物の
除去は無水物の酸への加水分解前または後に最も便宜的
であるように行うことができる。過剰量の無水物が除去
されなりと、金属イオンおよび存在する場合は任意のフ
ラツダーと反応し、種結合ジアミントリ酸の量の正確な
測定を訪問の分離を行う任意の方法で行うことができる
。
物（は、種結合物質と分離される。この過剰の無水物の
除去は無水物の酸への加水分解前または後に最も便宜的
であるように行うことができる。過剰量の無水物が除去
されなりと、金属イオンおよび存在する場合は任意のフ
ラツダーと反応し、種結合ジアミントリ酸の量の正確な
測定を訪問の分離を行う任意の方法で行うことができる
。
、２つの種は大きさが異なるので、クロマトグラフィー
技術たとえばゲル透過クロマトグラフィー、高圧液体ク
ロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー（たとえ
ばシリカゲル基材を使用する）または薄層クロマトグラ
フィーを使用することができる。透析および限外濾過を
含む膜技術を用いてこの分離を行うこともできる。多く
の場合、結合物質は、非結合無水物、あるいは駿とある
物性たとえば電荷または溶解度が異なる。そのような特
性の相違を分離本道として使用してたとえば選択的抽出
または電気泳動を行うことができる。本発明においては
クロマトグラフィー分離が使用されかつ一般に好ましｂ
が、使用される正確な方法は問題の実際の物質および分
離に基いて決定されるべきである。過剰の無水物まだは
酸を含まない重結合ジアミントリ酸は次いで金属錯体に
形成される。
技術たとえばゲル透過クロマトグラフィー、高圧液体ク
ロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー（たとえ
ばシリカゲル基材を使用する）または薄層クロマトグラ
フィーを使用することができる。透析および限外濾過を
含む膜技術を用いてこの分離を行うこともできる。多く
の場合、結合物質は、非結合無水物、あるいは駿とある
物性たとえば電荷または溶解度が異なる。そのような特
性の相違を分離本道として使用してたとえば選択的抽出
または電気泳動を行うことができる。本発明においては
クロマトグラフィー分離が使用されかつ一般に好ましｂ
が、使用される正確な方法は問題の実際の物質および分
離に基いて決定されるべきである。過剰の無水物まだは
酸を含まない重結合ジアミントリ酸は次いで金属錯体に
形成される。
加水分解により式Ｉの所望の種結合ジアミントリ酸が生
成されるＪｏこれらは、トリ酸を所Δの金属イオンと接
触させる′ことにより式■の金属配位化合物に変換する
ことができる。この接触は一般に溶液中で行われる。金
属イオンの使用量は、トリ酸１モル当り約１モルのイオ
ンであることが必要である。金、＠イオンとトリ酸の錯
体け、大きな安定度定数を有する強す錯体である。これ
は、錯体形成反応を押し進めるのに大過剰量の金属イオ
ンを使用することが必要でなくかつ過剰のイオン（はお
る場合には後の螢光測定の精度を妨害し得るこ七を意味
する。
成されるＪｏこれらは、トリ酸を所Δの金属イオンと接
触させる′ことにより式■の金属配位化合物に変換する
ことができる。この接触は一般に溶液中で行われる。金
属イオンの使用量は、トリ酸１モル当り約１モルのイオ
ンであることが必要である。金、＠イオンとトリ酸の錯
体け、大きな安定度定数を有する強す錯体である。これ
は、錯体形成反応を押し進めるのに大過剰量の金属イオ
ンを使用することが必要でなくかつ過剰のイオン（はお
る場合には後の螢光測定の精度を妨害し得るこ七を意味
する。
金属錯体形成工程は、一般に水性反応媒体中で行われる
。所望なら、水含有加水分解反応媒体を適当に使用する
ことができる。これは、金属イオンが一般と水溶性塩た
とえばハロゲン化物、硝酸塩、酢酸塩等として適当だ添
加されることを意味する。
。所望なら、水含有加水分解反応媒体を適当に使用する
ことができる。これは、金属イオンが一般と水溶性塩た
とえばハロゲン化物、硝酸塩、酢酸塩等として適当だ添
加されることを意味する。
金属イオンの添加は、周囲条件で行うのが適当である。
錯体形成には、高い温度は有利でなく、また相当に低い
温度は何ら利点をもたらさない。
温度は何ら利点をもたらさない。
５〜約４０℃の温度範囲が便宜上一般に好ましい。
螢光分析技術に対しての希土類金属イオン錯体の場合「
フラツダー」を金、鷺イオン錯体に添加することがしげ
しげ望ましい。このフラッダー添加は、一般て、螢光測
定直前に行われる。それは。
フラツダー」を金、鷺イオン錯体に添加することがしげ
しげ望ましい。このフラッダー添加は、一般て、螢光測
定直前に行われる。それは。
過剰のフラツダーを金属イオン錯体の溶液に添加するこ
とにより行われる。この添加は穏やかな条件たとえば５
〜４０℃の温度で行われる。
とにより行われる。この添加は穏やかな条件たとえば５
〜４０℃の温度で行われる。
種分子
本発明の′・重結合ジアミン） ＩＪ酸物質および錯体
に共有結合的に混入することができる種分子は、前記米
国特許第４．１５０２９５号明細書および４ 、０５８
。
に共有結合的に混入することができる種分子は、前記米
国特許第４．１５０２９５号明細書および４ 、０５８
。
７３２号明細書（参考として本発明に引用）に記載され
ているような「ターゲット分子」、「ターゲット分子」
と本質的に同一の分子および「ターゲット分子Ｈｃｌ異
の抗体から選ばれる有機分子である。これらの種分子は
、第一アミン、第二アミン、チオール、またはヒドロキ
シル基の少なくとも１１固を含有する。これらの活性基
は、種分子上に本来的に存在することができ、あるいは
種分子に共有結合された「スペーサー（５ｐａｃｅｒ
） Ｊユニ ″シト上に存在することができる。スペー
サーは、どアミントリ酸基と種分子自身間の妨害の可能
性を最小限くするのに有効である。そのような妨害は、
ある場合、たとえば種分子が免、疫反応ｐＨ：を示さな
ければならない場合またはある他の基質認識工程に関与
しなければならない時に有害であり得る。「スペーサー
」は必要なアミン、チオールまたはヒドロキシル活性基
を提供するために使用することもできる。「種」とは、
スペーサーが添加されたおよび適加されない物質を包含
する。
ているような「ターゲット分子」、「ターゲット分子」
と本質的に同一の分子および「ターゲット分子Ｈｃｌ異
の抗体から選ばれる有機分子である。これらの種分子は
、第一アミン、第二アミン、チオール、またはヒドロキ
シル基の少なくとも１１固を含有する。これらの活性基
は、種分子上に本来的に存在することができ、あるいは
種分子に共有結合された「スペーサー（５ｐａｃｅｒ
） Ｊユニ ″シト上に存在することができる。スペー
サーは、どアミントリ酸基と種分子自身間の妨害の可能
性を最小限くするのに有効である。そのような妨害は、
ある場合、たとえば種分子が免、疫反応ｐＨ：を示さな
ければならない場合またはある他の基質認識工程に関与
しなければならない時に有害であり得る。「スペーサー
」は必要なアミン、チオールまたはヒドロキシル活性基
を提供するために使用することもできる。「種」とは、
スペーサーが添加されたおよび適加されない物質を包含
する。
活性分子を非活性基たとえば基質に結合させるためにス
ペーサーまたは「ブリッジ」分子を使用することは酵素
固定化、クロマトグラフィー等の分野で開発されてきた
。たとえば、米国特許第３，２７８，３９２および第３
，８７３，５１４号各明細書およびＷｉｌｃｈｅ、 Ｆ
ＥＢＳ ＬＥＴＴ、 ３３ （１） ７０−７２ ’ｅ
参照。これらの技術は本発明において関与する正確な系
を述べてハな１ハけれども、広範囲の試剤およびスペー
サーの筒用により導かれる利点を開示している。
ペーサーまたは「ブリッジ」分子を使用することは酵素
固定化、クロマトグラフィー等の分野で開発されてきた
。たとえば、米国特許第３，２７８，３９２および第３
，８７３，５１４号各明細書およびＷｉｌｃｈｅ、 Ｆ
ＥＢＳ ＬＥＴＴ、 ３３ （１） ７０−７２ ’ｅ
参照。これらの技術は本発明において関与する正確な系
を述べてハな１ハけれども、広範囲の試剤およびスペー
サーの筒用により導かれる利点を開示している。
本発明は、本来的にまたはスペーサーの使用を介して所
要のアミン、チオールまたはヒドロキシル基を含有する
いかなる種分子についても実施することができるけれど
も、治療薬、酵素、ホルモン、ペプチド、蛋白質および
脂質を含む巨大分子、ハブテン、抗原等を含む生物学的
活性ターゲット分子に特に有利に利用できる。そのよう
な分子は普通所要の活性基を少なくとも１個有し、生物
学的系で存在し得る微小量のために分析または検出がし
ばしば困雅かまたは不可能でさえある。
要のアミン、チオールまたはヒドロキシル基を含有する
いかなる種分子についても実施することができるけれど
も、治療薬、酵素、ホルモン、ペプチド、蛋白質および
脂質を含む巨大分子、ハブテン、抗原等を含む生物学的
活性ターゲット分子に特に有利に利用できる。そのよう
な分子は普通所要の活性基を少なくとも１個有し、生物
学的系で存在し得る微小量のために分析または検出がし
ばしば困雅かまたは不可能でさえある。
よって種分子の例は、所要の官能基を有する簡単な有機
ターゲット分子たとえば低級アルカノール−メタノール
、エタノール、ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキ
サノール等ｉ低級芳香族ヒドロキシ化合物−フェノール
、λ、４ｔ−ジニトロフェノールおよびクレゾール；低
級アルキルおよび芳香族アミン−エチルアミン、ジエチ
ルアミン、ブチルアミン、およびインプロピルアミン；
低級チオール−プロパンチオールおよびブタンチオール
カラ、ホルモンチロキシン、トリョートチロニン、人間
成長ホルモンゴナドトロピン、胃腸ホルモン、インシュ
リン等；治療医薬たとえばジゴキシン、モルホン、プロ
力インアミド等；蛋白質、抗体等を含むよシ複雑な医薬
および生物学的分子に至るターゲットにまた７３；るこ
とか出来る。大分子たとえば蛋白質および抗体の場合、
各種分子上に所要の官能場所が７個以上（大きな数でさ
え）存在することが出来、その結果各種分子はそこに共
有結合された１個以上のジアミントリ酸基を有すること
が出来る。この可能な種分子のリストは、本発明によシ
ジアミントリ酸に結合出来る広範囲のターゲットを証明
するためである。それは、本発明の範囲を限定するもの
ではない。
ターゲット分子たとえば低級アルカノール−メタノール
、エタノール、ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキ
サノール等ｉ低級芳香族ヒドロキシ化合物−フェノール
、λ、４ｔ−ジニトロフェノールおよびクレゾール；低
級アルキルおよび芳香族アミン−エチルアミン、ジエチ
ルアミン、ブチルアミン、およびインプロピルアミン；
低級チオール−プロパンチオールおよびブタンチオール
カラ、ホルモンチロキシン、トリョートチロニン、人間
成長ホルモンゴナドトロピン、胃腸ホルモン、インシュ
リン等；治療医薬たとえばジゴキシン、モルホン、プロ
力インアミド等；蛋白質、抗体等を含むよシ複雑な医薬
および生物学的分子に至るターゲットにまた７３；るこ
とか出来る。大分子たとえば蛋白質および抗体の場合、
各種分子上に所要の官能場所が７個以上（大きな数でさ
え）存在することが出来、その結果各種分子はそこに共
有結合された１個以上のジアミントリ酸基を有すること
が出来る。この可能な種分子のリストは、本発明によシ
ジアミントリ酸に結合出来る広範囲のターゲットを証明
するためである。それは、本発明の範囲を限定するもの
ではない。
分析技術
すでに述べたように、本発明は、金属イオンの錯体が種
分子または種分子の抗体に共有結合することを可能にす
る。これら金属イオンの当業界で知られている方法によ
る検出を用いて、種分子の存在または量を測定すること
が出来る。またすでに述べたように、配合される金属イ
オンが放射性ヌクレオチドである場合、放射能分析技術
を用いて雅の存在量を測定することが出来る。別法とし
て、原子吸収技術を用いて金属の量およびそれ故ターゲ
ットの量を測定することが出来る。
分子または種分子の抗体に共有結合することを可能にす
る。これら金属イオンの当業界で知られている方法によ
る検出を用いて、種分子の存在または量を測定すること
が出来る。またすでに述べたように、配合される金属イ
オンが放射性ヌクレオチドである場合、放射能分析技術
を用いて雅の存在量を測定することが出来る。別法とし
て、原子吸収技術を用いて金属の量およびそれ故ターゲ
ットの量を測定することが出来る。
１つの好ましい実施態様では、金属は希土類であシ、生
成キレートは、フラツダーまたは他の手段により活性化
されて螢光を発生せしめられる。
成キレートは、フラツダーまたは他の手段により活性化
されて螢光を発生せしめられる。
放射線免疫分析分野で展開された多数の技術を一般に螢
光免疫分析に適用゛することが出来る。これらの技術と
して、培養技術、競合的結合方法および結合したおよび
遊離のラベル付ターゲットの分離が挙げられる。たとえ
ば、 ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＡＮＤ ＲＥＬＡ
ＴＥＤＴＥＣＨＮＩ ＱＵＥＳ （Ｊ、 １． Ｔｈｏ
ｒｅｕらによる。 ｃ、ｖ。
光免疫分析に適用゛することが出来る。これらの技術と
して、培養技術、競合的結合方法および結合したおよび
遊離のラベル付ターゲットの分離が挙げられる。たとえ
ば、 ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＡＮＤ ＲＥＬＡ
ＴＥＤＴＥＣＨＮＩ ＱＵＥＳ （Ｊ、 １． Ｔｈｏ
ｒｅｕらによる。 ｃ、ｖ。
’Ｍｏ５ｂｙ Ｃｏ、、 Ｓｔ、 Ｌｏｕｔｓ、 Ｍｉ
ｓｓｏｕｒｉ 、 （／２７ｒ））およびＲＡＤＩＯＩ
ＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ／ＩＮＣＬ４ＮＩＣＡＬＢＩＯＣ
ＨＥＭＩＳＴＲＹ （編集Ｃ，Ａ、 Ｐａ５ｔｅｒｎａ
ｃｋ、 Ｈｅｙ−ｄｅｎ、 Ｌｏｎｄｏｎ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、 Ｒｈｅｉｎｅ 、 （／り７よ））を参嬰
・ 放射能免疫分析と螢光免疫分析間の主な差は、最終の読
みの段階である。前者の場合、放射性壊変が計算され、
後者の場合、螢光が励起されそして測定される。
ｓｓｏｕｒｉ 、 （／２７ｒ））およびＲＡＤＩＯＩ
ＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ／ＩＮＣＬ４ＮＩＣＡＬＢＩＯＣ
ＨＥＭＩＳＴＲＹ （編集Ｃ，Ａ、 Ｐａ５ｔｅｒｎａ
ｃｋ、 Ｈｅｙ−ｄｅｎ、 Ｌｏｎｄｏｎ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、 Ｒｈｅｉｎｅ 、 （／り７よ））を参嬰
・ 放射能免疫分析と螢光免疫分析間の主な差は、最終の読
みの段階である。前者の場合、放射性壊変が計算され、
後者の場合、螢光が励起されそして測定される。
米国特許第≠、／！０．．２り５号および第≠ρ！？、
７３．２号明細書に開示されているタイムゲート螢光技
術は実質的に高められた感度を達成出来るので使用する
のに好ましい技術である。
７３．２号明細書に開示されているタイムゲート螢光技
術は実質的に高められた感度を達成出来るので使用する
のに好ましい技術である。
本発明の希土類キレートがタッグされた螢光抗体の場合
、それらは、体液中の遊離ターゲットの分析に使用する
ととが出来または他の好ましい用途では、表面に独特な
ターゲットまたはターゲツト群を有する限り生物光学的
細胞またはバクテリアの特定種類の存在を検出する（か
あるいは量をはかる）のに使用することが出来る。
、それらは、体液中の遊離ターゲットの分析に使用する
ととが出来または他の好ましい用途では、表面に独特な
ターゲットまたはターゲツト群を有する限り生物光学的
細胞またはバクテリアの特定種類の存在を検出する（か
あるいは量をはかる）のに使用することが出来る。
本発明を下記の調製例および例でさらに説明する。これ
らは本発明を例示するものであシ、本発明の範囲を限定
するものではない。
らは本発明を例示するものであシ、本発明の範囲を限定
するものではない。
３月りのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｒｔｏ
ｇの無水酢酸およびｔ ｏｏ、ｌｉｔのピリジンの混合
物を６５″Ｃに加熱し、その温度で２ｑ時間保持する。
ｇの無水酢酸およびｔ ｏｏ、ｌｉｔのピリジンの混合
物を６５″Ｃに加熱し、その温度で２ｑ時間保持する。
次に、この混合物を冷却し、グローブボックス中で瀘過
する。取得された固体をジエチルエーテルで洗浄し、乾
燥する。それは、ＥＤＴＡ二無水物の理論重量のりＪ％
に達する。元素分析により、この二無水物は得られた生
成物であることか確認される。
する。取得された固体をジエチルエーテルで洗浄し、乾
燥する。それは、ＥＤＴＡ二無水物の理論重量のりＪ％
に達する。元素分析により、この二無水物は得られた生
成物であることか確認される。
（ｂ） プロピレンジアミン四 酸二無７物米国特許第
３．Ａ ｔ Ｏ，Ｊざｔ号明細書に記載の方法によシ、
り２Ｉｉの／、Ｊ−プロピレンジアミン四酢酸、ｉｔ２
ｇの無水酢酸および／１３Ｉｉのピリジンを４ｊ”Ｑで
評時間攪拌する。反応生成物を真空下で蒸発乾固する。
３．Ａ ｔ Ｏ，Ｊざｔ号明細書に記載の方法によシ、
り２Ｉｉの／、Ｊ−プロピレンジアミン四酢酸、ｉｔ２
ｇの無水酢酸および／１３Ｉｉのピリジンを４ｊ”Ｑで
評時間攪拌する。反応生成物を真空下で蒸発乾固する。
残渣を回収し、ジエチルエーテルで３回すすぎ、Ｉ００
’Ｑの真空オープンで乾燥する。乾燥生成物は所望の二
無水物である。
’Ｑの真空オープンで乾燥する。乾燥生成物は所望の二
無水物である。
（ｃ） フェニレン／、２−ジアミン四酢酸二無水物米
国特許第３．ｎｏ、、ｉｔｇ号明細書に記載の方法によ
り、ｘｔｉｉの／、！−フェニレンジアミン四酢酸、７
２ｇの無水酢酸および３９１のピリジンをＡＪ’Ｑで３
時間攪拌する。この混合物を冷却し、流過する。分離し
た固体をベンゼンで洗浄し、乾燥する。それは、所望の
二無水物である。
国特許第３．ｎｏ、、ｉｔｇ号明細書に記載の方法によ
り、ｘｔｉｉの／、！−フェニレンジアミン四酢酸、７
２ｇの無水酢酸および３９１のピリジンをＡＪ’Ｑで３
時間攪拌する。この混合物を冷却し、流過する。分離し
た固体をベンゼンで洗浄し、乾燥する。それは、所望の
二無水物である。
遭ム
Ａ、チロキシンをＥＤＴＡ二無水物に結合１０ｏｍｌの
フラスコを真空にし、炎乾燥し、次いで３サイクルの真
空および乾燥アルゴンの充填を行う。フラスコを冷却し
、」［毀で製造したＥＤＴＡ二無水物４４３３ｑ！およ
び３００１１５１）Ｌ −ｆ Ｃｌキシンナトリウム塩
五水化物を充填する。この甲状腺ホルモンは正常の成長
および代謝に基本的に重要なものであシ、市販されてい
る。二無水物：ホルモンのモル比は、Ｊ−：ｌである。
フラスコを真空にし、炎乾燥し、次いで３サイクルの真
空および乾燥アルゴンの充填を行う。フラスコを冷却し
、」［毀で製造したＥＤＴＡ二無水物４４３３ｑ！およ
び３００１１５１）Ｌ −ｆ Ｃｌキシンナトリウム塩
五水化物を充填する。この甲状腺ホルモンは正常の成長
および代謝に基本的に重要なものであシ、市販されてい
る。二無水物：ホルモンのモル比は、Ｊ−：ｌである。
ｔｏｔｎｌのＤＭＦを添加すると、淡黄色溶液か得られ
る。フラスコに箔の蓋をし、見°Ｃに９時間加温する。
る。フラスコに箔の蓋をし、見°Ｃに９時間加温する。
スポットテストによシ、ホルモンのすべてが二無水物と
反応して下記生成物を与えることが分る。
反応して下記生成物を与えることが分る。
（ト）
生成物（５）を単離しない。その代シ、弘ｄの蒸留水を
フラスコに添加し、さらに１．５時間加熱を続ける。こ
れにより、残留無本物基は加水分解されてチロキシン結
合エチレンジアミン三酢酸が生成する。生成するトリ酸
およびＥＤＴＡを適当なデ過法によりＦ液として回収す
る。
フラスコに添加し、さらに１．５時間加熱を続ける。こ
れにより、残留無本物基は加水分解されてチロキシン結
合エチレンジアミン三酢酸が生成する。生成するトリ酸
およびＥＤＴＡを適当なデ過法によりＦ液として回収す
る。
Ｃ，ＥＤＴＡとトリ酸の分
上記Ｂの粗生成物を、充填シリカゲルカラムを介して溶
離剤としてエタノール：水（り１ｊ）を使用し、次いで
ｔｏ：ｘｔりＪ−％水性エタノール：３ｏ％水性アンモ
ニアを用いて溶離する。トリ酸、は、水性エタノール：
水性アンモニアで溶離され、ＴＬＣによシ純粋化合物と
して集められる。
離剤としてエタノール：水（り１ｊ）を使用し、次いで
ｔｏ：ｘｔりＪ−％水性エタノール：３ｏ％水性アンモ
ニアを用いて溶離する。トリ酸、は、水性エタノール：
水性アンモニアで溶離され、ＴＬＣによシ純粋化合物と
して集められる。
Ｎ ＭＲ１元素分析およびＩＲ走査により、回収生成物
はアンモニウム塩として所望のチロキシン結合トリ酸（
Ｃ）であり、収率は５９％であること方証明される。
はアンモニウム塩として所望のチロキシン結合トリ酸（
Ｃ）であり、収率は５９％であること方証明される。
Ｄ、Ｃと希土類イオンの錯体の形成
上記のＣで回収されたチロキシン結合ジアミン三酢酸の
公知量を秤り取シ、数ｍｌのｏ、／Ｎ ＮａＯＨ・に溶
解する。数分以内に、化学量論酌量の希土類ハライド（
特にこの例では塩化テルビウム）を添加し、混合して所
望の希土類（テルビラム）イオントチロキシン結合ジア
ミン三酢酸ｌ：ｌ錯体（Ｄ）および妨害要因でない塩化
す（・リウムを含有する均質溶液を形成する。
公知量を秤り取シ、数ｍｌのｏ、／Ｎ ＮａＯＨ・に溶
解する。数分以内に、化学量論酌量の希土類ハライド（
特にこの例では塩化テルビウム）を添加し、混合して所
望の希土類（テルビラム）イオントチロキシン結合ジア
ミン三酢酸ｌ：ｌ錯体（Ｄ）および妨害要因でない塩化
す（・リウムを含有する均質溶液を形成する。
Ｅ、Ｄとフラッダーとの三成分錯体の形成上記のＤのテ
ルビウム錯体の部分標本を１０ｒｎｌの水に導入し、約
１０−８モル濃度とする。ｌｏ−２モル濃度の！−スル
ホサリチル酸を添加してテルビウム：チロキシン結合ジ
アミントリ酸＝７ラツダー錯体を形成する。約３３００
Ｘで励起すると、この錯体は、！≠ｒｏＬで検出出来る
強い螢光を呈する。この螢光特性のチロキシンの分析へ
の応用を以下に示す。
ルビウム錯体の部分標本を１０ｒｎｌの水に導入し、約
１０−８モル濃度とする。ｌｏ−２モル濃度の！−スル
ホサリチル酸を添加してテルビウム：チロキシン結合ジ
アミントリ酸＝７ラツダー錯体を形成する。約３３００
Ｘで励起すると、この錯体は、！≠ｒｏＬで検出出来る
強い螢光を呈する。この螢光特性のチロキシンの分析へ
の応用を以下に示す。
例２
例１の調製を２つの変更を加えて繰り返えす。
工程りで塩化テルビウムの代シに、塩化ユウロピウムを
使用する。フェナントロリンをｊ、ＳＳＡの代シに７ラ
ツダーとして使用する。この結果、ユウロピウムキレー
トおよび例１で生成するテルビウム錯体に相当する三成
分錯体が生成する。ユウロピウム錯体は、フエナントロ
リンフラッダーと共に使用すると螢光性になり、以下に
示す方法によシ溶液中に存在するチロキシンの量の測定
が可能になる。
使用する。フェナントロリンをｊ、ＳＳＡの代シに７ラ
ツダーとして使用する。この結果、ユウロピウムキレー
トおよび例１で生成するテルビウム錯体に相当する三成
分錯体が生成する。ユウロピウム錯体は、フエナントロ
リンフラッダーと共に使用すると螢光性になり、以下に
示す方法によシ溶液中に存在するチロキシンの量の測定
が可能になる。
例３
Ａ、ＥＤＴＡ二無水物へコレステロールを結合子加水分
解 １０ｍ１丸底フラスコを炎加熱により乾燥し、次いでア
ルゴンを充填する。次に、２００ｑ （Ｏ，！２ｍｍｏ
ｌ）の再結晶コレステロールおよびｔｔ、２’ｍｊ）（
２３りｍｍｏｌ ）の調製ａ）の二無水物を仕込む。フ
゛ラスコを真空下で動労放置し、次いで、３ｍ７！の乾
燥ＤＭＦを添加し、混合物をりＯ′Ｃで３６時間保持す
る。この期間中混合物は本質的に均質で無色の状態であ
る。それを室温に冷却し、３ｍｌの脱イオン水をさらに
冷却しながら添加する。沈殿が生成し、不均一混合物を
１０時間攪拌する。
解 １０ｍ１丸底フラスコを炎加熱により乾燥し、次いでア
ルゴンを充填する。次に、２００ｑ （Ｏ，！２ｍｍｏ
ｌ）の再結晶コレステロールおよびｔｔ、２’ｍｊ）（
２３りｍｍｏｌ ）の調製ａ）の二無水物を仕込む。フ
゛ラスコを真空下で動労放置し、次いで、３ｍ７！の乾
燥ＤＭＦを添加し、混合物をりＯ′Ｃで３６時間保持す
る。この期間中混合物は本質的に均質で無色の状態であ
る。それを室温に冷却し、３ｍｌの脱イオン水をさらに
冷却しながら添加する。沈殿が生成し、不均一混合物を
１０時間攪拌する。
この混合物を、ｌｌ０ｍ１のジエチルエーテル−アセト
ン（ｌ：４ｔ）で希釈すると、さらに沈殿が生成する。
ン（ｌ：４ｔ）で希釈すると、さらに沈殿が生成する。
この混合物を濾過し、固体を１０ｍ１のエーテル−アセ
トン混合物で洗浄する。戸液を集め、蒸発させ、追加の
エタノールで希釈シ、さらに固体を生成させる。これを
集め、前に集めた固体に添加する。乾燥後、３２コグ（
理論量のｇ、ｒ％）の所望のＮ−（エタノール−〇−コ
レステロール）エチレンジアミン三酢酸が得られる。Ｎ
ＭＲおよびＴＬＣで分析すると、生成物は非常に純粋で
ああことが分る。元素分析は所望の化合物と一致する。
トン混合物で洗浄する。戸液を集め、蒸発させ、追加の
エタノールで希釈シ、さらに固体を生成させる。これを
集め、前に集めた固体に添加する。乾燥後、３２コグ（
理論量のｇ、ｒ％）の所望のＮ−（エタノール−〇−コ
レステロール）エチレンジアミン三酢酸が得られる。Ｎ
ＭＲおよびＴＬＣで分析すると、生成物は非常に純粋で
ああことが分る。元素分析は所望の化合物と一致する。
′Ｂ、金属イオン錯体の形成
上記のＡの物質（３０ｖ）を３ｙｎｌの０． ／ Ｎ
ＮａＯＨに溶解する。希土類金属イオン（テルビウムま
たはジスプロシウム）をほぼ化学量論的量（Ａの化合物
１モル当ｐ ／、００．−１−０６モル）で添加する。
ＮａＯＨに溶解する。希土類金属イオン（テルビウムま
たはジスプロシウム）をほぼ化学量論的量（Ａの化合物
１モル当ｐ ／、００．−１−０６モル）で添加する。
これにより、Ａの物質の希土類金属イオン錯体が生成す
る。この物質は過剰のフラッダーの添加により促進する
と、螢光分析法に有効な螢光特性を示す。このフラッダ
ーの添加は例１と同様にして行われる。
る。この物質は過剰のフラッダーの添加により促進する
と、螢光分析法に有効な螢光特性を示す。このフラッダ
ーの添加は例１と同様にして行われる。
旦
イソプロパツール（／ｍｍｏｌ ）を１０ｍ１の乾燥Ｄ
ＭＦと例３の方法によシ混合する。Ｊ’ｚｎｍｏｌの調
製ａ）の二無水物を添加し、混合物をり０℃で２’１時
間保持する。この結果、アルカノールのヒドロキシル基
は無水物と反応し、アルカノールはエステル形で結合さ
れる。このエステルは無水物単位の加水分解の前または
後で残留無水物と分離することが出来る。錯体はエステ
ルを所望の金属イオンと混合することにより形成するこ
とが出来る。
ＭＦと例３の方法によシ混合する。Ｊ’ｚｎｍｏｌの調
製ａ）の二無水物を添加し、混合物をり０℃で２’１時
間保持する。この結果、アルカノールのヒドロキシル基
は無水物と反応し、アルカノールはエステル形で結合さ
れる。このエステルは無水物単位の加水分解の前または
後で残留無水物と分離することが出来る。錯体はエステ
ルを所望の金属イオンと混合することにより形成するこ
とが出来る。
氾
単なアミンの結ム
例グの手順を２つの変更を行って繰り返見す。
まず、イソプロパツールの代りにエチルアミンを等モル
基準そ使用する。第二に、反応条件の強さを軽減し、３
３℃の温度を使用する。エチルアミンは二無水物にアミ
ド形で付加する。
基準そ使用する。第二に、反応条件の強さを軽減し、３
３℃の温度を使用する。エチルアミンは二無水物にアミ
ド形で付加する。
例ｔ−ｇ
他の 単な基の結合
例≠で使用したインプロパツールのａＫ、フェノール、
エチルチオールおよびジエチルアミンを用いて例弘の結
合を繰シ返えす。ジエチルアミンの場合、より低い温度
（３５℃〕が使用される。
エチルチオールおよびジエチルアミンを用いて例弘の結
合を繰シ返えす。ジエチルアミンの場合、より低い温度
（３５℃〕が使用される。
これらの繰シ返えしにより、新しい出発物質の各々に基
づく結合生成物が生じる◇所望なら、これらの生成物を
さらに処理して金属イーオン錯体を形成することが出来
る。
づく結合生成物が生じる◇所望なら、これらの生成物を
さらに処理して金属イーオン錯体を形成することが出来
る。
例り
水性環境中でアミンの結合
２つの追加の変更を加えて例ｊのカップリングを繰り返
えす。ＤＭＦ溶剤の代りに、水を使用し、３３″Ｃユを
時間の代シに、３０℃、？Ａ時間を使用する＠とれらの
穏やかな条件で、より活性なアミン基が反応し、アミン
が二無水物に優先的に結合して所望のトリ酸が生成する
。この反応は、水性環境におけるアミンと無水酢酸との
優先的反応と同じである（ Ｃａｌｄｗｅｌｌらによる
ＪＡＣ８，４４，ＩＡ？！、（１９１Ａ２）参照）。こ
れはトリ酸を蛋白質および抗体に結合させるのに好まし
い方法である０例１０ 乾燥フラスコに、調製で製造したＰＤＴＡ二無水物Ａ
ｍｍｏｌおよび市販の供給原から得られる必須アミノ酸
チロニン／ ｍｍｏｌを仕込む。二無水物：チロニンの
モル比はＡ二ｌである。ＳＯ４量のＤＭＦを添加し、生
成する溶液を３Ｓ℃に加温し、その温度で３０時間保持
する。この混合物をＴＢＧ板でスポットテストし、未反
応チロニンが存在せずかつ所望のチロニン結合プロピレ
ンジアミン三酢酸無水物を含有することが判明する＠ Ｂ、加水分解、分離および錯化 例１に示す一般的方法によシ、への無水物を現場で加水
分解し、生成する過剰のＰＤＴＡとカラムクロマトグラ
フィーにより分離する。これによシ、所望のチロニン結
合三酢酸が得られる。
えす。ＤＭＦ溶剤の代りに、水を使用し、３３″Ｃユを
時間の代シに、３０℃、？Ａ時間を使用する＠とれらの
穏やかな条件で、より活性なアミン基が反応し、アミン
が二無水物に優先的に結合して所望のトリ酸が生成する
。この反応は、水性環境におけるアミンと無水酢酸との
優先的反応と同じである（ Ｃａｌｄｗｅｌｌらによる
ＪＡＣ８，４４，ＩＡ？！、（１９１Ａ２）参照）。こ
れはトリ酸を蛋白質および抗体に結合させるのに好まし
い方法である０例１０ 乾燥フラスコに、調製で製造したＰＤＴＡ二無水物Ａ
ｍｍｏｌおよび市販の供給原から得られる必須アミノ酸
チロニン／ ｍｍｏｌを仕込む。二無水物：チロニンの
モル比はＡ二ｌである。ＳＯ４量のＤＭＦを添加し、生
成する溶液を３Ｓ℃に加温し、その温度で３０時間保持
する。この混合物をＴＢＧ板でスポットテストし、未反
応チロニンが存在せずかつ所望のチロニン結合プロピレ
ンジアミン三酢酸無水物を含有することが判明する＠ Ｂ、加水分解、分離および錯化 例１に示す一般的方法によシ、への無水物を現場で加水
分解し、生成する過剰のＰＤＴＡとカラムクロマトグラ
フィーにより分離する。これによシ、所望のチロニン結
合三酢酸が得られる。
所望のトリ酸の溶液を３一つの等しい部分に分割する。
最初の部分（約Ｏ，−２ｍｍｏｌのトリ酸を含有すると
推定される〕を水溶液としての／ −２ｍｍｏｌｅの塩
化コバルトと混合する。この結果。
推定される〕を水溶液としての／ −２ｍｍｏｌｅの塩
化コバルトと混合する。この結果。
チロニン結合三酢酸のコバルトキレートが生成する。第
二の部分を具化テルビウムの溶液としての０．２ ｍｍ
ｏｌのテルビウムと接触させる。この結果、トリ酸のテ
ルビウムキレートが生成スる０例１の方法によシ、／
Ｘ１０ ｍｍｏｌｅ の７ラワダーであるφ−アミノサ
リチル酸を添加して／ ：／ ：／テルビウム／トリ酸
／７ラツダー錯体を形成する。第三部分を塩化物として
の１ｎ１１１／−２ｍｍｏｌに注意深く接触させる・こ
れによ、す、チロニン結合トリ酸のＩｎ 錯体が生成す
る０ 例１／ 例ｊの調製を１つの変更を加えて繰シ返えす。
二の部分を具化テルビウムの溶液としての０．２ ｍｍ
ｏｌのテルビウムと接触させる。この結果、トリ酸のテ
ルビウムキレートが生成スる０例１の方法によシ、／
Ｘ１０ ｍｍｏｌｅ の７ラワダーであるφ−アミノサ
リチル酸を添加して／ ：／ ：／テルビウム／トリ酸
／７ラツダー錯体を形成する。第三部分を塩化物として
の１ｎ１１１／−２ｍｍｏｌに注意深く接触させる・こ
れによ、す、チロニン結合トリ酸のＩｎ 錯体が生成す
る０ 例１／ 例ｊの調製を１つの変更を加えて繰シ返えす。
ＥＤＴＡ二無水物の代シに、シクロヘキシレン−７゜２
−ジアミン四酢酸二無水物を使用する。この結果、エチ
ルアミン結合三酢酸が生成する。この化合物 をユウロピウムイオンと接触させてユウロピウム錯体を
生成し、次いでこのものを、１０ モル過剰のフラッグ
−である炭酸カリウムを添加して螢光的に活性な錯体に
変換する。この錯体は螢光技術により検出することが出
来る◇ 第一工程として、種結合ジアミン） ＩＪ酸−希土類金
属イオン錯体の螢光は、錯体の濃度に関連するという事
実を証明する。
−ジアミン四酢酸二無水物を使用する。この結果、エチ
ルアミン結合三酢酸が生成する。この化合物 をユウロピウムイオンと接触させてユウロピウム錯体を
生成し、次いでこのものを、１０ モル過剰のフラッグ
−である炭酸カリウムを添加して螢光的に活性な錯体に
変換する。この錯体は螢光技術により検出することが出
来る◇ 第一工程として、種結合ジアミン） ＩＪ酸−希土類金
属イオン錯体の螢光は、錯体の濃度に関連するという事
実を証明する。
チロキシン結合ジアミン三酢酸錯体の溶液のテルビウム
（例／のＤと同様にして調製）による連続的希釈を＋
１０−６〜２．６ Ｘ１０−” モルノチｏ ＃ ’／
ン濃度で行う。フラッダーを添加する（ｌｏ−２モルの
！−スルホサリチル酸）、６約／／、！の…寅で、各サ
ンプルの螢光を、ＩＭＭＵＮＯＦＬ、ＵＯＲＥＳＣＥＮ
ＣＥ ＡＮＤＲＥＬＡＴＥＤ ５ＴＡＩＮＩＮＧ ＴＥ
ＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｋｎａｐｐ らの編集、６７−ざ０
． Ｅｌｒｅｖｉｅｒ ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ
Ｂ ｔｏ −ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ 、 Ａｍ
ｓｔｅｒｄａｍ 、 ／り７ｇに記載されているタイム
ゲート螢光計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ ） および測
定技術を用いて測定する。信号を対数一対数紙にプロブ
トし、この範囲で直線であることが分る。
（例／のＤと同様にして調製）による連続的希釈を＋
１０−６〜２．６ Ｘ１０−” モルノチｏ ＃ ’／
ン濃度で行う。フラッダーを添加する（ｌｏ−２モルの
！−スルホサリチル酸）、６約／／、！の…寅で、各サ
ンプルの螢光を、ＩＭＭＵＮＯＦＬ、ＵＯＲＥＳＣＥＮ
ＣＥ ＡＮＤＲＥＬＡＴＥＤ ５ＴＡＩＮＩＮＧ ＴＥ
ＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｋｎａｐｐ らの編集、６７−ざ０
． Ｅｌｒｅｖｉｅｒ ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ
Ｂ ｔｏ −ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ 、 Ａｍ
ｓｔｅｒｄａｍ 、 ／り７ｇに記載されているタイム
ゲート螢光計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ ） および測
定技術を用いて測定する。信号を対数一対数紙にプロブ
トし、この範囲で直線であることが分る。
曲線は限界検出値として約／（ｆ１２モルまで外挿する
ことが出来ろ。検出限界は、螢光信号がブランクサンプ
ルからの信号変動に丁度等しくなる濃度である。ブラン
クサンプルからの信号は、光倍率器暗ノイズおよびサン
プル容器、溶剤、緩衝液等からの残留背景信号を包含す
る。直線プロブトが得られるという事実は、タッグ種の
濃度をその螢光を測定することにより測定出来るという
ことを示す０ この発見は、血漿中の未知濃度サンプルのチロオキシ濃
度を測定することにより実用化される。
ことが出来ろ。検出限界は、螢光信号がブランクサンプ
ルからの信号変動に丁度等しくなる濃度である。ブラン
クサンプルからの信号は、光倍率器暗ノイズおよびサン
プル容器、溶剤、緩衝液等からの残留背景信号を包含す
る。直線プロブトが得られるという事実は、タッグ種の
濃度をその螢光を測定することにより測定出来るという
ことを示す０ この発見は、血漿中の未知濃度サンプルのチロオキシ濃
度を測定することにより実用化される。
第一に、放射能免疫分析の場合のようにラインに沿って
標準曲線をつくる。非種結合チロキシンの連続希釈物を
チロキシン不含血漿で調製する。チロキシン不含血漿は
全チロキシン結合血漿蛋白質の変性を含む当業界で公知
の技術によりつくる。
標準曲線をつくる。非種結合チロキシンの連続希釈物を
チロキシン不含血漿で調製する。チロキシン不含血漿は
全チロキシン結合血漿蛋白質の変性を含む当業界で公知
の技術によりつくる。
濃度は／、２、≠、ｇおよび／ＡＰｇ／ｄ６であるａ
ｐｌｙ＜を調節し、一定量の錯体結合チロキシン（例１
のＤ）を、チロキシンに対する一定量９抗体と共に各希
釈物に添加する。この混合物を通常の競争的結合条件で
培養する。次いで抗体結合チロキシンおよび遊離チロキ
シンを、硫酸アンモニウム沈殿、二重抗体沈殿、ポリエ
チレングリコール沈殿、デキストラン−木炭沈殿、カラ
ム分離等の当業界で公知の分離工程を用いて分離する。
ｐｌｙ＜を調節し、一定量の錯体結合チロキシン（例１
のＤ）を、チロキシンに対する一定量９抗体と共に各希
釈物に添加する。この混合物を通常の競争的結合条件で
培養する。次いで抗体結合チロキシンおよび遊離チロキ
シンを、硫酸アンモニウム沈殿、二重抗体沈殿、ポリエ
チレングリコール沈殿、デキストラン−木炭沈殿、カラ
ム分離等の当業界で公知の分離工程を用いて分離する。
次に、結合分別を緩衝液に懸濁させ、フラッダーを添加
し、前述したタイムゲート法を用いて螢光を測定する。
し、前述したタイムゲート法を用いて螢光を測定する。
観察されに螢光を、゛標準サンプル中の未結合チロキシ
ンの濃度に対してプロブトする。曲線をつくると、未結
合チロキシンのより大きい濃度では、結合物質は抗体場
所への競合能力が低く、観察される螢光はより低いこと
が確認される。次に、つくった曲線を用いて未知サンプ
ル中のチロキシン濃度を測定する。
ンの濃度に対してプロブトする。曲線をつくると、未結
合チロキシンのより大きい濃度では、結合物質は抗体場
所への競合能力が低く、観察される螢光はより低いこと
が確認される。次に、つくった曲線を用いて未知サンプ
ル中のチロキシン濃度を測定する。
未知量のチロキシンを含有する血清サンプルの全チロキ
シンを分析するロー！ず、サンプルを酸性化して結合蛋
白質を変性し、チロキシンを結合から遊離させる。次に
、ｐ可調節後、サンプルを標準曲線の形成の際行ったよ
うに、例／−１）部のチロキシン結合ジアミントリ酸金
属錯体の標準量および標準量のチロキシン濃度で処理す
る０この混合物を前記と同様にして培養する０結合およ
び未結合物質を分離する。７ラツダーを添加し、螢光を
測定する。未知サンプル中のチロキシン濃度を。
シンを分析するロー！ず、サンプルを酸性化して結合蛋
白質を変性し、チロキシンを結合から遊離させる。次に
、ｐ可調節後、サンプルを標準曲線の形成の際行ったよ
うに、例／−１）部のチロキシン結合ジアミントリ酸金
属錯体の標準量および標準量のチロキシン濃度で処理す
る０この混合物を前記と同様にして培養する０結合およ
び未結合物質を分離する。７ラツダーを添加し、螢光を
測定する。未知サンプル中のチロキシン濃度を。
観察された螢光に基いて標準曲線から読む０ある場合に
は、ターゲ・ブト分子（検出すべきまたは測定すべき分
子）は、抗体である。たとえば、アレルギーにかってい
る人間の患者の免疫グｏピジン（ＩｇＥ）抗体の範囲を
測定するととは医学的に重要であり得るａ患者は、種々
のアレルゲンに対して異なる量のＩｇＥ抗体を有するこ
とが出来、適当な治療のためには、この分布を知ること
は重要である。血液または他の体液中のＩｇＢ抗体量を
測定するために、問題のアレルゲンは公知技術を用いて
固相基質に共有結合され、基質は患者の体液にさらされ
る。適当な条件下で適当な培養期間後、基質は取り出さ
れそして洗浄される。固体基質上のアレルゲンに特異の
ＩｇＥ抗体の代表的量が基質上に存在し、アレルゲンに
結合される。基質を、人間のＩｇＥに対スるテルビウム
キＶ−トジアミントリ酸結合抗体にさらす。この抗Ｉｇ
Ｅ抗体は一般に含まれるアレルゲンとは無関係に人間の
ＩｇＥの全サブクラス（５ｕｂ−ｃｌａｓｓｅｓ ）に
特異である。再び適当な条件下で第二の暴露後、固体基
質を再び洗浄シ、フラツダーたとえばタングステン酸ナ
トリウムにさらす。次に、好ましくは前述したタイムゲ
ートフルロオマイド（ｆｌｕｏｒｏｍｉｄｅ ）を用い
て螢光を測定する。公知量のＩｇＥを有する各アレｌル
ゲンに対して公知技術法を用いて標漁曲線をつくること
が出来、かくして、標準曲線との比較によシ人間すンプ
ル中の未知量のｒｇＢを測定することが出来るＯ Ｂ、細胞またはバクテリアに対する分析細胞またはバク
テリアはその表面に種々の分子マーカーを有することが
出来る０これらのマーカーはある場合には、確認、単離
または精製することが出来、そしてマーカーに特異の抗
体をつくるために使用することが出来る。そのような抗
体は、本発明のジアミントリ酸金属錯体に結合されると
、表面にマーカーを有するある細胞またはバクテリアを
確認するために使用するととが出来る。細胞またはバク
テリアは、ジアミントリ酸金属結合抗体にさらされ、マ
ーカーが存在する場合、比較的高濃度の結合抗体が表面
に結合される。これらの細胞は、次に、・螢光顕微鏡ま
たは螢光細胞流動系で調らべられ、そして螢光細胞また
はバクテリアがある一定の容積に対して計算され、かく
して細胞またはバクテリアの存在が定量的にまたは定性
的に判明する〇 これらは、本発明の種結合ジアミン三酢酸錯体を用いて
行うことが出来る多くの可能な分析の２つの例に過ぎな
い＠他の等価の方法を同様に使用することが出来る。
は、ターゲ・ブト分子（検出すべきまたは測定すべき分
子）は、抗体である。たとえば、アレルギーにかってい
る人間の患者の免疫グｏピジン（ＩｇＥ）抗体の範囲を
測定するととは医学的に重要であり得るａ患者は、種々
のアレルゲンに対して異なる量のＩｇＥ抗体を有するこ
とが出来、適当な治療のためには、この分布を知ること
は重要である。血液または他の体液中のＩｇＢ抗体量を
測定するために、問題のアレルゲンは公知技術を用いて
固相基質に共有結合され、基質は患者の体液にさらされ
る。適当な条件下で適当な培養期間後、基質は取り出さ
れそして洗浄される。固体基質上のアレルゲンに特異の
ＩｇＥ抗体の代表的量が基質上に存在し、アレルゲンに
結合される。基質を、人間のＩｇＥに対スるテルビウム
キＶ−トジアミントリ酸結合抗体にさらす。この抗Ｉｇ
Ｅ抗体は一般に含まれるアレルゲンとは無関係に人間の
ＩｇＥの全サブクラス（５ｕｂ−ｃｌａｓｓｅｓ ）に
特異である。再び適当な条件下で第二の暴露後、固体基
質を再び洗浄シ、フラツダーたとえばタングステン酸ナ
トリウムにさらす。次に、好ましくは前述したタイムゲ
ートフルロオマイド（ｆｌｕｏｒｏｍｉｄｅ ）を用い
て螢光を測定する。公知量のＩｇＥを有する各アレｌル
ゲンに対して公知技術法を用いて標漁曲線をつくること
が出来、かくして、標準曲線との比較によシ人間すンプ
ル中の未知量のｒｇＢを測定することが出来るＯ Ｂ、細胞またはバクテリアに対する分析細胞またはバク
テリアはその表面に種々の分子マーカーを有することが
出来る０これらのマーカーはある場合には、確認、単離
または精製することが出来、そしてマーカーに特異の抗
体をつくるために使用することが出来る。そのような抗
体は、本発明のジアミントリ酸金属錯体に結合されると
、表面にマーカーを有するある細胞またはバクテリアを
確認するために使用するととが出来る。細胞またはバク
テリアは、ジアミントリ酸金属結合抗体にさらされ、マ
ーカーが存在する場合、比較的高濃度の結合抗体が表面
に結合される。これらの細胞は、次に、・螢光顕微鏡ま
たは螢光細胞流動系で調らべられ、そして螢光細胞また
はバクテリアがある一定の容積に対して計算され、かく
して細胞またはバクテリアの存在が定量的にまたは定性
的に判明する〇 これらは、本発明の種結合ジアミン三酢酸錯体を用いて
行うことが出来る多くの可能な分析の２つの例に過ぎな
い＠他の等価の方法を同様に使用することが出来る。
出願人代理人 猪 股 清
第１頁の続き
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下式を有する種結合ジアミン三酢酸と本質的に１：
１モルキｖ−）錯体にある金属イオンを含むことを特徴
とする金属キＶ−ト。 〔式中、Ｒは２閏またはそれ以上の原子長共有を 結合ブリッジ、Ｔけ−Ｎ７Ｈ，−Ｎ−Ｈ，−０−Ｈおよ
び−８−Ｈから選ばれる官能基を有する有機棟分子、Ｌ
はジアミン三酢酸のカルボニル炭素へＴを共有結合させ
る脱プロトン形の上記官能基である〕。 ２、金属イオンが、種結合ジアミン三酢酸と螢光錯体を
形成し得る希土類金属イオンである、特許請求の範囲第
１項に記載の金属キレート。 ３、金属イオンが、テルビウム、ジスプロシウム、ユウ
ロピウム、サマリウムおよびネオジムから選ばれる希土
類金属のイオンで必る、特許請求の範囲第２項に記載の
金属キレート。 ４、 Ｌが、種が抗体である釉Ｔ上に存在する第一アミ
ンから誘導される第一アきド結合である、特許請求の範
囲第１項〜第３項のいずれか一項に記載の金属キＬ／−
）。 ５、 Ｌが、種がチロキシンでるるａＴ上に存在する第
一アミンから誘導される第一アミド結合である、特許請
求の範囲第１項〜第３項のいずれか一項に記載の金叫キ
ｖ−）。 ６、金属イオンが、テルビウムおよびユウロピウムのイ
オンから選ばれる、特許請求の範囲第４項または第５項
に記載の金属キレート。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73728 | 1979-09-10 | ||
| US06/073,728 US4352751A (en) | 1979-09-10 | 1979-09-10 | Species-linked diamine triacetic acids and their chelates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60243052A true JPS60243052A (ja) | 1985-12-03 |
Family
ID=22115445
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12585780A Pending JPS5659741A (en) | 1979-09-10 | 1980-09-10 | Seed bonding diamine triacetic acid and its chelate |
| JP60040241A Pending JPS60252684A (ja) | 1979-09-10 | 1985-02-28 | 螢光組合せ体 |
| JP60040240A Pending JPS60243052A (ja) | 1979-09-10 | 1985-02-28 | 種結合ジアミン三酢酸の金属キレ−ト |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12585780A Pending JPS5659741A (en) | 1979-09-10 | 1980-09-10 | Seed bonding diamine triacetic acid and its chelate |
| JP60040241A Pending JPS60252684A (ja) | 1979-09-10 | 1985-02-28 | 螢光組合せ体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4352751A (ja) |
| JP (3) | JPS5659741A (ja) |
| DE (1) | DE3033691A1 (ja) |
| FR (1) | FR2469416A1 (ja) |
| GB (1) | GB2060623B (ja) |
Families Citing this family (111)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3100062A1 (de) * | 1981-01-02 | 1982-08-05 | Hans A. Dipl.-Chem. Dr. 8000 München Thoma | Homogenes verfahren zur bestimmung von liganden |
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| US4794191A (en) * | 1981-07-01 | 1988-12-27 | Eastman Kodak Company | Fluorescent chelates |
| US4637988A (en) * | 1981-07-01 | 1987-01-20 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels for immunoassay |
| US4670572A (en) * | 1981-07-01 | 1987-06-02 | Eastman Kodak Company | Phenolic fluorescent labels |
| CA1205028A (en) * | 1981-07-01 | 1986-05-27 | Jerald C. Hinshaw | Fluorescent chelates and labeled specific binding reagents prepared therefrom |
| US4837169A (en) * | 1981-07-01 | 1989-06-06 | Eastman Kodak Company | Polypyridine Fluorescent labels for immunoassay |
| US4859777A (en) * | 1981-07-01 | 1989-08-22 | Eastman Kodak Company | Terpyridine chelating agents |
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| EP0073865B1 (en) * | 1981-09-11 | 1986-01-29 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Derivatives of iodothyronine compounds and their use in an assay for the free iodothyronine compounds |
| JPS5859954A (ja) * | 1981-09-16 | 1983-04-09 | アメルシャム・インタ−ナショナル・パブリック・リミテッド・コムパニ− | ヨ−ドチロニン化合物の誘導体および遊離ヨ−ドチロニン化合物の分析におけるそれらの使用 |
| US4430319A (en) | 1982-05-21 | 1984-02-07 | State University Of New York | Radioactive iodine labeled phenolic amines |
| US4472509A (en) * | 1982-06-07 | 1984-09-18 | Gansow Otto A | Metal chelate conjugated monoclonal antibodies |
| FR2537326A1 (fr) * | 1982-12-01 | 1984-06-08 | Commissariat Energie Atomique | Procede de recuperation des actinides et/ou des lanthanides presents a l'etat trivalent dans une solution aqueuse acide |
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| SE8301395L (sv) * | 1983-03-15 | 1984-09-16 | Wallac Oy | Kelatiserande foreningar med funktionella grupper vilka tillater kovalent koppling till bio-organiska molekyler |
| US4758682A (en) * | 1983-03-17 | 1988-07-19 | California Institute Of Technology | Homogeneous coordination compounds as oxidation catalysts |
| US4615876A (en) * | 1983-04-25 | 1986-10-07 | Curators Of The University Of Missouri | Macrocyclic complexes of technetium-99m for use as diagnostic radionuclides |
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| DE3324235A1 (de) * | 1983-07-01 | 1985-01-10 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Neue komplexbildner, komplexe und komplexsalze |
| US4615879A (en) * | 1983-11-14 | 1986-10-07 | Vanderbilt University | Particulate NMR contrast agents for gastrointestinal application |
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