FI87022C - Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar - Google Patents
Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar Download PDFInfo
- Publication number
- FI87022C FI87022C FI870716A FI870716A FI87022C FI 87022 C FI87022 C FI 87022C FI 870716 A FI870716 A FI 870716A FI 870716 A FI870716 A FI 870716A FI 87022 C FI87022 C FI 87022C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- condensation product
- diketone
- lanthanide metal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1 87022
Leimattuja ja leimautuvia reagensseja fluorometrisiä määrityksiä varten Tämä keksintö koskee ihmis- ja eläinkehossa ja 5 vastaavissa esiintyvien orgaanisten aineiden määrittämistä. Tarkemmin ottaen se koskee fluorometristä immunomää-ritystä ja tällaisessa määrityksessä leimattuina reagens-seina käyttökelpoisia aineita.
Nykyään tunnetaan joukko sovellutuksia, joissa 10 on tarpeen leimata vasta-aineita (tai muita orgaanisia aineita, esim. makromolekyylejä kuten proteiineja ja hap-teeneja) metalli-ioneilla, joko radioaktiivisilla metalli-ioneilla radioimmunomääritysten ja muiden ydinlääketie-teellisten tutkimusten yhteydessä tai lantanidimetalli-15 ioneilla fluorometristen immunomääritysten ja muiden fluoresenssiin pohjautuvien tutkimusten yhteydessä. Näihin tarkoituksiin orgaaniset aineet leimataan tavallisesti metalli-ioneilla kelatointiaineiden avulla. Tähän saakka kelaatit on modifioitu silloitusreagensseilla, 20 jotka muuttavat ne kaksifunktionaalisiksi reagensseiksi, jolloin niissä säilyy kelatointikyky ja samalla ne pystyvät helposti liittymään kovalenttisidoksella leimattavaan molekyyliin.
Eräs tässä tarkoituksessa käytetty kelatointi-25 aineryhmä muodostuu β-diketonien kuten trifluoriasetyy-liasetonin ja bentsoyyli- ja a- ja β-naftoyylitrifluori-asetonin ryhmästä ja kelaatit, jotka muodostuvat lanta-nidimetalli-ioneista ja tällaisista reagensseista, on kytketty vasta-aineisiin EDTA-analogien avulla (ks.EP-30 patenttihakemus nro 0 064 484). GB-patenttijulkaisussa nro 1 560 402 ehdotetaan myös P-diketoniligandin kuten tenoyylitrifluoriasetyyliasetonin modifioimista liittämällä siihen aminometyylisubstituentti sekä yhden modifioidun ligandimolekyylin ja kahden modifioimattoman ligan-35 dimolekyylin käyttämistä siter\ että muodostuu lantanidi- 2 87022 metalli-ionikompleksi, joka aminoryhmän isotiosyanaatti-ryhmäksi muuttamisen jälkeen kytkeytyy helposti vasta-aineeseen.
Mutta kaksifunktionaalisten kelatointiaineiden 5 syntetisointi on hankalaa ja monissa reaktioissa, joissa ligandimetalli-ionikompleksi sidotaan kovalentisti leimattavaan molekyyliin, halutun leimatun tuotteen saanto on pieni ja lisäksi voidaan leimattuun molekyyliin siirtää ei-toivottuja ominaisuuksia.
10 Käsiteltävänä oleva keksintö haluaa tarjota vaih toehtoisen menetelmän metalli-ionikompleksin liittämiseksi tyydyttävällä tavalla orgaaniseen molekyyliin siten, että leimatussa molekyylissä aikaansaadaan spesifinen toimivuus.
15 Käsiteltävänä olevan keksinnön menetelmälle NI^” pitoisen vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi siten, että se voidaan leimata lantanidi-metalli-ionilla, on tunnusomaista, että annetaan Nl^-pitoisen vasta-aineen tai antigeenin reagoida β-diketonin kanssa aldehydin läsnä 20 ollessa sykliseksi kondensointituotteeksi.
Keksinnössä käytetty Nl^-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine tai antigeeni tai N^-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
25 Keksintö tarjoaa myös menetelmän vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi siten, että se voidaan leimata lantanidi-metalli-ionilla. Menetelmälle on tunnusomaista, että annetaan N^-pitoisen yhdisteen, jossa on vasta-aineen tai antigeenin kanssa reagoiva aktiiviryhmä, reagoida β-30 diketonin kanssa aldehydin läsnä ollessa sykliseksi kondensointituotteeksi ja liitetään muodostunut tuote vasta-aineeseen tai antigeeniin aktiivisen ryhmän välityksellä.
Keksintö tarjoaa lisäksi aineen, joka voidaan leimata lantanidi-metalli-ionilla käytettäväksi fluorometri-35 sessä määritystekniikassa. Aineelle on tunnusomaista, että se käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu Nl^-pitoisesta makromolekyylistä, β-diketonista ja aldehy-distä, jolloin NH^-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine 3 87022 tai antigeeni tai Nl^-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
Keksintö tarjoaa myös leimatun reagenssin käytettäväksi fluorometrisessä määrityksessä. Reagenssille on tun-5 nusomaista, että se käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu aldehydistä, 3-diketonista ja N^-pitoisesta makromolekyylistä, joka on vasta-aine tai antigeeni tai Nl^-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin, ja että konden- 10 sointituote kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa kompleksiksi, joka voidaan määrittää fluorometrisesti.
Keksintö tarjoaa edelleen orgaanisen aineen fluoro-metrisen määritysmenetelmän, jossa käytetään tällaista leimattua reagenssia.
15 Piirustusten lyhyt kuvaus
Keksintöä selvennetään oheisilla piirustuksilla, jotka esittävät alfa-fetoproteiinin (valittu tyypillisenä Nl^-pitoisena vasta-aineena) määritykseen liittyviä käyriä alempana kuvatuissa esimerkeissä.
20 Kuvio 1 esittää kalibrointikäyrää, jossa on käy tetty kaniinin anti-alfafetoproteiinia (AFP) leimattuna suoraan trifluoriasetyyliasetonilla.
Kuvio 2 esittää kalibrointikäyrää, jossa anti-AFP on leimattu leimatulla polylysiinillä ja ' 25 kuvio 3 esittää kuvion 2 kalibrointikäyrää, kun
Eu(III):n fluoresenssi oli maksimaalinen.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus NH2-pitoisen aineen eli makromolekyylin (R^-NHj), 8-diketonin (R^COCI^COR3) ja aldehydin (R2-CHO) välinen 30 reaktio sykliseksi kondensointituotteeksi voidaan esittää seuraavan reaktiokaavion avulla: 1 O ° R -NH +R2CHO+2R3-C-CH.-C-R3 2 2 H Rz \ / 35 3 ?, /C\ 0 - R3-C-£X c-c-r3 * R3i i-„3 * 3H2° R1 4 87022
Symbolit R1, R2 ja R3 ovat mielivaltaisia symboleja, jotka riippuvat lähtöainesten luonteesta.
Keksinnön menetelmässä ei edellytetä β-diketonin modifioimista ennalta ja, koska menetelmä on riippuvai-5 nen vain β-diketonin emäsrakenteesta, eikä yhdenkään substituentin luonteesta, siinä voidaan käyttää lukuisia erilaisia β-diketoneja. Siten on mahdollista valita optimaalinen β-diketoni muiden kriteerien perusteella, joita ovat esim. liukoisten, tyydyttävän absorptiospekt-10 rin omaavien kompleksien muodostus- ja muodostumisvaki-ot metalli-ionille, joka liitetään toimimaan leimaajana ilman immunoreaktiivisuuden menettämistä tai liitetään haitallisten vaikutusten välttämiseksi. Menestyksellisesti käytettyihin 3-diketoneihin kuuluu sekä aromaattisia 15 että ei-aromaattisia lajeja ja valmistettaessa kompleksi, joka fluorometrista käyttöä varten leimataan lantanidi-metallilla, on suositeltavaa käyttää fluorilla substitu-oitua ainesta. Esimerkkejä sopivista β-diketoneista ovat trifluoriasetyyliasetoni, tenoyylitrifluoriasetoni, 20 4,4,4-trifluori-1,(2-furyyli)1,3-butaanidioni ja a- ja 3-naftoyylitrifluoriasetoni. Muita sopivia 3-diketoneja ovat sellaiset, jotka mainitaan artikkelissa Hemmilä et ai., Analytical Biochemistry, 137, 335-343 (1984) tai GB-patenttijulkaisussa nro 1 560 402 tai yllä mainitussa 25 EP-patenttihakemuksessa nro 0 064 484 tai EP-patenttiha-kemuksessa nro 0 002 963.
Saattaa olla eduksi käyttää β-diketonia metalli-pitoisten 3-diketonaatin muodossa, jolloin metallina on haluttu metalli tai muu metalli (esim. kupari) paran-30 tamaan lopputuotteen kelatointiominaisuuksia. Jos alku- · peräinen metalli ei ole haluttu, se voidaan korvata lantanidimetallilla, muodostamaan leimattu tuote.
Aldehydinä käytetään edullisesti formaldehydiä, kun aldehydin ei tarvitse omata spesifistä toimi- 5 87022 vuutta, esim. kelatoimiskykyä, mutta haluttaessa voidaan käyttää muitakin aldehydejä, esim. -C^-alkyylialdehy-dejä, joissa valinnaisesti on inerttejä substituentte-ja, mikä lisää mahdollisuuksia vaihdella muodostuneen 5 syklisen kondensointituotteen ominaisuuksia. Itse alde-hydillä voi olla kelatoivia ominaisuuksia, jotka on tarkoituksellisesti liitetty sen kemialliseen rakenteeseen ja jotka sitten helpottavat leimatun tuotteen metallin kelatoitumista.
10 Keksintöä voidaan käyttää leimattujen reagenssi- en ja niiden prekursorien aikaansaamiseksi orgaanisista aineista siitä riippumatta, sisältävätkö ne alkuaan riittävästi Nl^-ryhmiä syklisen kondensointituotteen muodostamiseksi vaiko ei. Jos orgaaninen aine alkuaan 15 ei sisällä lainkaan Nl^-ryhmiä tai sisältää niitä riittämättömästi, voidaan syklinen kondensointituote muodostaa siten, että ensin annetaan 3-diketonin ja aldehydin reagoida amiinin tai aminohapon tai muun Ni^-pitoisen yhdisteen, esim. NH2-pitoisen polymeerin (kuten polyly-20 siinin) läsnä ollessa, jossa on aktiivinen ryhmä, joka pystyy reagoimaan makromolekyylin kanssa. Muodostuneen syklisen kondensointituotteen annetaan sitten reagoida leimattavan orgaanisen aineen kanssa lievissä reaktio-olosuhteissa, joissa aktiiviryhmä voidaan liittää orgaa-25 niseen aineeseen. Tällaisen reaktion esimerkki on karbo-di-imidireaktio. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa aktiivi esteri, esim. poly-L-lysiinin aktiivi hydroksisuk-kiini-imidiesteri. On mahdollista käyttää polylysiinin asemasta lysiinipitoista kelaattia, joka sitten edistää 30 lopputuotteen metallin kelatoitumista. Tällaisen kelaa-tin esimerkki on siderofiliini (transferriini).
Keksintö mahdollistaa siis aktivoinnin, jonka avulla voidaan leimata lantanidi-metalli-ioneilla mitä erilaisimpia orgaanisia aineita, joita esiintyy luonnostaan ih-35 mis- ja eläinkehon nesteissä tai jotka saadaan viljelemällä 6 87022 tai keinotekoisesti, esim. antigeenejä, vasta-aineita, hormoneja (esim. T4), entsyymejä ja muita proteiineja ja hepteeneja ja kaikkien näiden aineiden katsotaan sisältyvän tässä käytettyyn termiin orgaaninen makromole-5 kyyli. Termi makromolekyyli edellyttää ko. aineilta mole-kyylipainoa yleensä yli 300, pienemmän molekyylipainon omaavat aineet eivät ole poissuljettuja. Makromolekyyliin liittyy yleensä alayksikköjä, esim. aminohappotähteitä, mutta tämä ei ole välttämätöntä.
10 Reaktio syklisen kondensointituotteen muodostami seksi suoritetaan edullisesti lievästi happamassa pH:ssa, esim. 5,5 - 6,5, joskin emäksinenkin pH on mahdollinen. Reaktio suoritetaan edullisesti lievästi kohotetussa lämpötilassa, esim. 30-50°C:ssa. Kondensointituotteen 15 valmistuksessa, jota aiotaan käyttää myöhemmässä määrityksessä, on vältettävä korkeita lämpötiloja, koska ne saattaisivat vaurioittaa N^-pitoista makromolekyyliä. Matalammat lämpötilat hidastavat reaktiota ja inkuboin-tiajan pidentäminen saattaa olla tarpeen.
20 Keksinnön mukaiset sykliset kondensointituotteet ovat stabiileja ja ne kelatoivat voimakkaasti metalli-ioneja kuten lantanidimetalli-ioneja. Niinpä ne voivat reagoida Eu(III):n tai muun fluoresoivia komplekseja muodostavan lantanidimetallin kuten Tb(III):n koraplek-25 siksi ja muodostunut kompleksi fluoresoi yleensä vesi- liuoksessa ilman ulkoa lisättyä β-diketonia. Reaktio voidaan suorittaa minkä tahansa tunnetun tai tavanomaisen menetelmän avulla, esim. dialysoimalla puskuria vastaan, joka sisältää liitettävän metallin ioneja.
30 Kelatoivien aldehydien avulla valmistetut konden sointituotteet tyydyttävät lantanidimetallien koordinaa-tiokapasiteetin täydellisemmin kuin muiden aldehydien avulla saatavat tuotteet. Niinpä tällaiset tuotteet kelatoivat paremmin metalleja ja ovat fluoresenssikykyi-35 sempiä ollessaan lantanidikelaattimuodossa.
7 87022
Kondensointituotteiden absorption maksimiaallon-pituudet ovat lähtöaineena käytetystä β-diketonista riippuen tavallisesti siirtyneet jompaankumpaan suuntaan β-diketonin maksimiaallonpituudesta. Tätä aallonpituuden 5 ja siten herätysmaksimin siirtymää voidaan pitää osoituk sena kondensointituotteen muodostumisesta.
Syklistä, lantanidimetalli-ionilla leimattua kondensointituotetta voidaankäyttää leimattuna reagens-sina mitä erilaisimpien aineiden fluorometrisessä määri-10 tyksessä, mutta se on ensisijaisesti tarkoitettu orgaanis ten makromolekyylien ja hapteenien määrittämiseen, joita esiintyy kehonnesteissä joko luonnostaan tai sairauden tai häiriötilan vuoksi tai sairauden tai häiriötilan hoidon seurauksena, esim. vasta-aineiden, antigeenien ja 15 muiden proteiinien, hormonien, entsyymien, lääkeainei den tai virushiukkasten määrittämiseen. Fluorometrinen määritys voidaan suorittaa minkä tahansa tunnetun tekniikan tai vakiotekniikan avulla. Esimerkkejä sopivista tekniikoista mainitaan yllä viitatuissa patenttijulkaisuissa 20 ja hakemusjulkaisuissa ja niissä mainituissa viitejulkai suissa. Ks. myös Dakubu S., Ekins R.P. et ai., "High-sen-sitity, pulsed light time-resolved fluoroimmunoassay" teoksessa Practical Immunoassay, W. Butt (toim., Marcel Dekker Inc., s. 71-101. Määritys voi olla kvalitatiivi-25 nen määritys, jota käytetään pelkästään mahdollisen vasta- aineen tai muun aineen toteamiseksi tai kvantitatiivinen määritys, jota käytetään määritettävän aineen konsentraa-tion mittaamiseksi.
Yhtenä suositeltavana määritysmenetelmänä on kak-30 sikohta(sandwich)menettely, jossa määritettävän aineen (esim. vasta-aineen tai antigeenin) annetaan ensin reagoida komplementtinsa (sitä vastaavan antigeenin tai sitä vastaavan vasta-aineen) kanssa, jolloin jälkimmäinen on sopivasti sidottuna kiinteään substraattiin, ja tuotteen 35 annetaan reagoida leimatun reagenssin kanssa, joka pystyy 8 87022 reagoimaan määritettävän, sitoutuneen aineen (esim. leimatun antigeenin tai leimatun vasta-aineen) kanssa.
Vaihtoehtoinen fluorimetrinen määritys muodostuu vakioradioimmunomääritystä muistuttavasta menettelystä, 5 jossa määritettävä aine (esim. antigeeni tai vasta-aine) ja leimattu reagenssi kilpailevat komplementissa (esim. vasta-aineessa tai antigeenissä) olevista reaktiivisista kohdista, jolloin komplementti on sopivasti sidottuna kiinteään substraattiin.
10 Käytettäessä fluorimetrisessä immunomäärityksessä syklistä kondensointituotetta on mahdollista mitata fluoresenssi lantanidimetalli-ionin (esim. Eu(III)) määrittämiseksi joko liuoksesta tai leimatusta molekyylistä, joka on sidottu kiinteään alustaan. Mitattaessa liuoksesta 15 lantanidimetalli-ioni voidaan uuttaa leimatusta kompleksista esim. antamalla reagoida lisätyn β-diketonin kanssa (jonka ei tarvitse olla sama kuin kompleksin muodostuksessa käytetty β-diketoni) . Lisätty β-diketoni komp-leksoi metalli-ionin ja syrjäyttää siten kondensointi-20 tuotteen ja muodostunut kompleksi voidaan erottaa konden-sointituotteesta. Mutta käsiteltävänä olevan keksinnön etuna on, että ei ole tarpeen käyttää tällaista intensi-fiointiliuosta fluoresenssin mittaamiseksi, vaan konden-sointituotteen ja lantanidimetalli-ionin muodostama kom-25 pieksi fluoresoi luontaisesti siten, että sen fluoresenssi voidaan mitata suoraan sen ollessa sitoutuneena reaktiotuotteeseen.
Määritettäessä fluoresenssin määrä kiintomuodos-ta tai liuoksesta voidaan tuloksia parantaa lisäämällä 30 trioktyylifosfiinioksidia (TOPO), kuten EP-patenttiha-kemuksessa 0 064 484 mainitaan. Tällöin leimatun makromolekyylin fluorimetrisessä määrityksessä konsentraation -10 toteamisraja on parempi kuin 10 M.
Syklinen kondensointituote,joka on sopivasti 35 puskuroidussa liuoksessa, voikin sisältyä pakkaukseen 9 87022 fluorimetristen määritysten suorittamiseksi, orgaaninen aine, joka muodostaa osan kondensointituotteesta (joko suoraan tai myöhemmän reaktion kautta varsinaisen osan muodostavan Nl^-pitoisen aineen aktiivin ryhmän kanssa), 5 valitaan asianmukaisesti määritettävästä aineesta riippuen siten, että se pystyy reagoimaan joko määritettävän aineen tai sen komplementin, esim. sopivan vasta-aineen tai antigeenin kanssa. Pakkaukseen sisältyy sopivasti lantanidimetalli-ionista kuten Eu(III) tai 10 Tb(III) ja kondensointituotteesta muodostuva valmiiksi kelatoitu kompleksi. Pakkaukseen voi myös sisältyä erillisenä komponenttina määritettävän aineen komplementti, joka on sidottu kiinteään kantajaan.
Keksinnön toteuttamistapoja 15 Seuraavia reagensseja käytettiin seuraavissa esi merkeissä, joiden tehtävänä on valaista keksintöä.
1) Kaupan oleva kaniinin anti-AFP-liuos, jossa pitoisuus on n. 1 mg/ml.
2) 1:10-laimennos formaldehydiliuoksesta, jonka 20 alkuperäinen formaldehydipitoisuus on 37-40 p/t-% eli -3 laimennoksen konsentraatio on n. 1,4 x 10 moolia/litra.
3) , Perusliuos, jossa on kuparitrifluoriasetyyli-asetonia (CuTFAA) metanolissa konsentraationa 160 mM.
Esimerkki 1 25 400,ui anti-AFP-liuosta (ts. 2,7 x 10 moolia
O
anti-AFP:tä) inkuboitiin tunti 37 C:ssa 200,ul:n kera -7' laimeta formaldehydiliuosta (ts. 2,7 x 10 moolia for- -7 maldehydiä) ja 4^ul:n kera CuTFAA-liuosta (ts. 5,4 x 10 moolia CuTFAA:ta) asetaattipuskurissa (0,2 M) pHtssa 5,7.
30 Reaktiotuote dialysoitiin ensin asetaattipuskuria vas- :’· taan reagoimatta jääneiden pienien molekyylien poistami seksi ja sitten asetaattipuskuria vastaan, jossa oli 10 ^ M Eu(III)-ioneja, muodostamaan kelatoitu tuote (leimattu vasta-aine), ja lopuksi asetaattipuskuria vastaan Eu(III):n 10 87022 ylimäärän poistamiseksi. Leimattu vasta-aine liuotettiin tris(hydroksimetyyli)aminometaani-keittosuola-atsidipus-kuriin (0,02 M) pH:ssa 7,6 (50 mM NaCl:ää) määrityksen suorittamiseksi. Vasta-aine olisi haluttaessa voitu puh-5 distaa edelleen kromatografroimalla.
Esimerkki 2
Toistettiin yllä kuvattu maiettely käyttäen kaniinin anti-AFP:n asemasta polylysiiniä, jonka molekyylipai-no oli 80 000. Muodostunut leimattu polylysiini kytket-10 tiin vasta-aineeseen 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)- karbodi-imidihydrokloridilla.
Esimerkkeissä 1 ja 2 saatuja leimattuja tuotteita käytettiin anti-AFP:n määrittämiseksi kaksikohta("sandwich" )vakiomääritysmenetelmän avulla.
Claims (9)
1. Aine, joka voidaan leimata lantanidimetalli-io-nilla käytettäväksi fluorometrisessä määritystekniikassa, 5 tunnettu siitä, että se käsittää syklisen kon-densointituotteen, joka muodostuu NH2-pitoisesta makromolekyylistä, β-diketonista ja aldehydistä, jolloin NH2-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine tai antigeeni tai NH2-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä 10 liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen aine, tunnettu siitä, että β-diketoni on fluorilla sub-stituoitu yhdiste ja/tai aldehydi on formaldehydi.
3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen ai-15 ne, tunnettu siitä, että joko β-diketonilla tai aldehydillä on kelatoivia ominaisuuksia.
4. Menetelmä NH2-pitoisen vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi lantanidimetalli-ionilla leimausta varten, tunnettu siitä, että annetaan NH2-pi- 20 toisen vasta-aineen tai antigeenin reagoida β-diketonin kanssa aldehydin läsnä ollessa sykliseksi kondensointi-tuotteeksi.
5. Menetelmä vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi lantanidimetalli-ionilla leimausta varten, 25 tunnettu siitä, että annetaan NH2-pitoisen yh disteen, jossa on vasta-aineen tai antigeenin kanssa reagoiva aktiiviryhmä, reagoida β-diketonin kanssa aldehydin läsnä ollessa sykliseksi kondensointituotteeksi ja liitetään muodostunut tuote vasta-aineeseen tai antigeeniin 30 aktiiviryhmän välityksellä.
6. Leimattu reagenssi käytettäväksi fluorometrisessä määrityksessä, tunnettu siitä, että se käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu aldehydistä, β-diketonista ja NH2-pitoisesta makromole- 35 kyylistä, joka on vasta-aine tai antigeeni tai NH2-pitoi- 12 87022 nen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin, ja että kondensointi-tuote kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa kompleksiksi, joka voidaan määrittää fluorometrisesti.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen leimattu rea- genssi, tunnettu siitä, että lantanidimetalli-ioni on europium(III) tai terbium(III).
8. Menetelmä orgaanisen aineen määrittämiseksi fluorometrisesti, tunnettu siitä, että käyte-10 tään patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaista leimattua rea-genssia, ja määritys suoritetaan mahdollisesti sandwich-tekniikalla, ja fluoresenssi mitataan joko a) lantanidimetalli-ionin vielä ollessa reaktiotuotteessa, joka muodostuu leimatusta reagenssista ja määritettävästä ainees-15 ta ja/tai sen komplementista, tai b) sen jälkeen kun lan-tanidimetalli-ioni on uutettu reaktiotuotteesta, joka muodostuu leimatusta reagenssista ja määritettävästä aineesta ja/tai sen komplementista.
9. Pakkaus vasta-aineen tai antigeenin määrittämi-20 seksi fluorometrisesti, tunnettu siitä, että se käsittää β-diketonin, aldehydin ja antigeenin tai vasta-aineen, joka pystyy reagoimaan joko määritettävän vasta-aineen tai antigeenin tai sen komplementin kanssa muodostaman syklisen kondensointituotteen puskuroidussa liuok-25 sessa, jolloin mainittu antigeeni tai vasta-aine muodostaa suoraan osan syklisestä kondensointituotteesta, jos antigeeni tai vasta-aine on NH2-pitoinen, tai on liitetty NH2-pitoiseen yhdisteeseen, joka muodostaa suoraan osan syklisestä kondensointituotteesta, ja kondensointituote 30 kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa leimatuksi rea-genssiksi. 87022
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8421318 | 1984-08-22 | ||
| GB848421318A GB8421318D0 (en) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Potentiating antibodies/other macro-molecules |
| GB8500377 | 1985-08-22 | ||
| PCT/GB1985/000377 WO1986001604A1 (en) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | Labelled and labellable reagents for fluorometric assays |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI870716A FI870716A (fi) | 1987-02-20 |
| FI870716A0 FI870716A0 (fi) | 1987-02-20 |
| FI87022B FI87022B (fi) | 1992-07-31 |
| FI87022C true FI87022C (fi) | 1992-11-10 |
Family
ID=10565671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI870716A FI87022C (fi) | 1984-08-22 | 1987-02-20 | Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4857475A (fi) |
| EP (1) | EP0222766B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0625765B2 (fi) |
| AU (1) | AU4724185A (fi) |
| DE (1) | DE3583507D1 (fi) |
| DK (1) | DK184586D0 (fi) |
| FI (1) | FI87022C (fi) |
| GB (1) | GB8421318D0 (fi) |
| NO (1) | NO861555L (fi) |
| WO (1) | WO1986001604A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886744A (en) * | 1985-04-25 | 1989-12-12 | Polaroid Corporation | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system |
| GB8602304D0 (en) * | 1986-01-30 | 1986-03-05 | Dakubu S | Dihydropyridine condensation products |
| GB8622855D0 (en) * | 1986-09-23 | 1986-10-29 | Ekins R P | Determining biological substance |
| JPS6447952A (en) * | 1987-05-06 | 1989-02-22 | Saibaafuruua Inc | Immunoassay, reagent used therefor and making thereof |
| GB8803000D0 (en) * | 1988-02-10 | 1988-03-09 | Ekins Roger Philip | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| SE8703682L (sv) * | 1987-09-24 | 1989-03-25 | Wallac Oy | Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| SE8801702D0 (sv) * | 1988-05-05 | 1988-05-05 | Pharmacia Ab | Sett vid bestemning av enzymatisk aktivitet |
| US5240867A (en) * | 1989-02-09 | 1993-08-31 | Fujitsu Limited | Semiconductor integrated circuit having interconnection with improved design flexibility, and method of production |
| FI88654C (fi) * | 1991-03-15 | 1993-06-10 | Datacity Center Oy | Fluorescenshoejningsmetod |
| US5312922A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-17 | Nordion International Inc. | Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays |
| GB0210535D0 (en) * | 2002-05-08 | 2002-06-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US7906343B2 (en) * | 2005-01-24 | 2011-03-15 | Sri International | Surface-enhanced lanthanide chelates |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3956341A (en) * | 1974-02-21 | 1976-05-11 | Smithkline Corporation | 1,3,5-Tricarbo-1,4-dihydropyridines |
| SE428332B (sv) * | 1979-03-08 | 1983-06-20 | Wallac Oy | Forfarande for fluorescensspektroskopisk bestemning av biologiskt aktivt emne, sasom hapten, antikropp eller antigen |
| US4352751A (en) * | 1979-09-10 | 1982-10-05 | Analytical Radiation Corporation | Species-linked diamine triacetic acids and their chelates |
-
1984
- 1984-08-22 GB GB848421318A patent/GB8421318D0/en active Pending
-
1985
- 1985-08-22 EP EP85904129A patent/EP0222766B1/en not_active Expired
- 1985-08-22 DE DE8585904129T patent/DE3583507D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-22 AU AU47241/85A patent/AU4724185A/en not_active Abandoned
- 1985-08-22 US US06/862,215 patent/US4857475A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-22 WO PCT/GB1985/000377 patent/WO1986001604A1/en active IP Right Grant
- 1985-08-22 JP JP60503723A patent/JPH0625765B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-04-18 NO NO861555A patent/NO861555L/no unknown
- 1986-04-22 DK DK184586A patent/DK184586D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-02-20 FI FI870716A patent/FI87022C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI87022B (fi) | 1992-07-31 |
| DE3583507D1 (de) | 1991-08-22 |
| EP0222766B1 (en) | 1991-07-17 |
| FI870716A (fi) | 1987-02-20 |
| GB8421318D0 (en) | 1984-09-26 |
| JPH0625765B2 (ja) | 1994-04-06 |
| FI870716A0 (fi) | 1987-02-20 |
| JPS62501442A (ja) | 1987-06-11 |
| EP0222766A1 (en) | 1987-05-27 |
| WO1986001604A1 (en) | 1986-03-13 |
| DK184586A (da) | 1986-04-22 |
| US4857475A (en) | 1989-08-15 |
| DK184586D0 (da) | 1986-04-22 |
| AU4724185A (en) | 1986-03-24 |
| NO861555L (no) | 1986-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7390778B2 (ja) | ポリマーｂｏｄｉｐｙ色素およびそれを使用する方法 | |
| KR101851797B1 (ko) | 용액상 균질 검정 | |
| Tan et al. | Development of functionalized fluorescent europium nanoparticles for biolabeling and time-resolved fluorometric applications | |
| EP1129092B1 (en) | Porphyrin compounds, their conjugates and assay methods based on the use of said conjugates | |
| US4352751A (en) | Species-linked diamine triacetic acids and their chelates | |
| US5512493A (en) | Method of amplifying the emission signal of a luminescent compound | |
| US4666862A (en) | Fluorescent energy transfer with phycobiliproteins | |
| US5464741A (en) | Palladium (II) octaethylporphine alpha-isothiocyanate as a phosphorescent label for immunoassays | |
| FI87022C (fi) | Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar | |
| US5457186A (en) | Luminescent lanthanide chelates with decreased non-radiative energy loss | |
| US20090197349A1 (en) | Electrochemiluminescence of rare earth metal chelates | |
| JPH01127957A (ja) | 生物特異的親和反応を利用する均一検定法 | |
| CN112955508A (zh) | 具有侧基窄发射受体的聚合物串联染料 | |
| Diamandis | Multiple labeling and time-resolvable fluorophores | |
| JPH04506403A (ja) | 標識技術を用いた複数分析物の検出または定量 | |
| US4965211A (en) | Fluorometric analysis method | |
| US20210395606A1 (en) | Chromophoric structures for macrocyclic lanthanide chelates | |
| CA2306752C (en) | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same | |
| O'Riordan et al. | Monofunctional derivatives of coproporphyrins for phosphorescent labeling of proteins and binding assays | |
| CN111675674A (zh) | 一种aie分子及其合成方法 | |
| JP2006503902A (ja) | 金属キレートおよび、時間分解蛍光測定におけるその使用方法 | |
| US11614445B2 (en) | Background blockers for binding assays | |
| Zheng et al. | Study of a Lanthanide Fluorescence System With a Coupled ReactionBased on Hemin Catalysis | |
| US6951760B2 (en) | Diagnostic neodymium(III), ytterbium(III), or erbium(III) ion-ligand complexes | |
| JPS61502681A (ja) | 化学発光性ラベル付有機試薬及び有機化合物の分析におけるそれらの利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: DAKUBU, SALIFU Owner name: EKINS, ROGER PHILIP |