FI87022B - Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar. - Google Patents
Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar. Download PDFInfo
- Publication number
- FI87022B FI87022B FI870716A FI870716A FI87022B FI 87022 B FI87022 B FI 87022B FI 870716 A FI870716 A FI 870716A FI 870716 A FI870716 A FI 870716A FI 87022 B FI87022 B FI 87022B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- condensation product
- metal ion
- diketone
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
1 87022
Leimattuja ja leimautuvia reagensseja fluorometrisiä määrityksiä varten Tämä keksintö koskee ihmis- ja eläinkehossa ja 5 vastaavissa esiintyvien orgaanisten aineiden määrittämistä. Tarkemmin ottaen se koskee fluorometristä immunomää-ritystä ja tällaisessa määrityksessä leimattuina reagens-seina käyttökelpoisia aineita.
Nykyään tunnetaan joukko sovellutuksia, joissa 10 on tarpeen leimata vasta-aineita (tai muita orgaanisia aineita, esim. makromolekyylejä kuten proteiineja ja hap-teeneja) metalli-ioneilla, joko radioaktiivisilla metalli-ioneilla radioimmunomääritysten ja muiden ydinlääketie-teellisten tutkimusten yhteydessä tai lantanidimetalli-15 ioneilla fluorometristen immunomääritysten ja muiden fluoresenssiin pohjautuvien tutkimusten yhteydessä. Näihin tarkoituksiin orgaaniset aineet leimataan tavallisesti metalli-ioneilla kelatointiainaiden avulla. Tähän saakka kelaatit on modifioitu silloitusreagensseilla, 20 jotka muuttavat ne kaksifunktionaalisiksi reagensseiksi, jolloin niissä säilyy kelatointikyky ja samalla ne pystyvät helposti liittymään kovalenttisidoksella leimatta-:: vaan molekyyliin.
·:··: Eräs tässä tarkoituksessa käytetty kelatointi- 25 aineryhmä muodostuu β-diketonien kuten trifluoriasetyy- • .·**. liasetonin ja bentsoyyli- ja a- ja S-naftoyylitrifluori- • t» ;·, asetonin ryhmästä ja kelaatit, jotka muodostuvat lanta-
• M
*. . nidimetalli-ioneista ja tällaisista reagensseista, on • · · ** kytketty vasta-aineisiin EDTA-analogien avulla (ks.EP- 30 patenttihakemus nro 0 064 484). GB-patenttijulkaisussa • · · ’· *: nro 1 560 402 ehdotetaan myös β-diketoniligandin kuten • · ♦ • · · ‘ tenoyylitrifluoriasetyyliasetonin modifioimista liittä- » ; mällä siihen aminometyylisubstituentti sekä yhden modifi- • · · .*·*. oidun ligandimolekyylin ja kahden modifioimattoman ligan- • · 9 9 * 35 dimolekyylin käyttämistä siterv että muodostuu lantanidi- v · · • · · • I· · 9 • · 2 87022 metalli-ionikompleksi, joka aminoryhmän isotiosyanaatti-ryhmäksi muuttamisen jälkeen kytkeytyy helposti vasta-aineeseen .
Mutta kaksifunktionaalisten kelatointiaineiden 5 syntetisointi on hankalaa ja monissa reaktioissa, joissa ligandimetalli-ionikompleksi sidotaan kovalentisti leimattavaan molekyyliin, halutun leimatun tuotteen saanto on pieni ja lisäksi voidaan leimattuun molekyyliin siirtää ei-toivottuja ominaisuuksia.
10 Käsiteltävänä oleva keksintö haluaa tarjota vaih toehtoisen menetelmän metalli-ionikompleksin liittämiseksi tyydyttävällä tavalla orgaaniseen molekyyliin siten, että leimatussa molekyylissä aikaansaadaan spesifinen toimivuus.
15 Käsiteltävänä olevan keksinnön menetelmälle NH^- pitoisen vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi siten, että se voidaan leimata lantanidi-metalli-ionilla, on tunnusomaista, että annetaan Ni^-pitoisen vasta-aineen tai antigeenin reagoida β-diketonin kanssa aldehydin läsnä 20 ollessa sykliseksi kondensointituotteeksi.
Keksinnössä käytetty Nt^-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine tai antigeeni tai Nl^-pitoinen yhdiste, joka on • · ·’·’ aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
: ** 25 Keksintö tarjoaa myös menetelmän vasta-aineen tai • · · antigeenin aktivoimiseksi siten, että se voidaan leimata : '.· lantanidi-metalli-ionilla. Menetelmälle on tunnusomaista, että annetaan NH_-pitoisen yhdisteen, jossa on vasta-aineen • * L· tai antigeenin kanssa reagoiva aktiiviryhmä, reagoida β- .·.: 30 diketonin kanssa aldehydin läsnä ollessa sykliseksi kon- * · · * · #·;·. densointituotteeksi ja liitetään muodostunut tuote vasta- • ♦ · aineeseen tai antigeeniin aktiivisen ryhmän välityksellä.
*
Keksintö tarjoaa lisäksi aineen, joka voidaan lei- t·» mata lantanidi-metalli-ionilla käytettäväksi fluorometri- : .·. 35 sessä määritystekniikassa. Aineelle on tunnusomaista, että • · · se käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu N^-pitoisesta makromolekyylistä, β-diketonista ja aldehy-distä, jolloin Ni^-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine • · 3 87022 tai antigeeni tai NH2-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
Keksintö tarjoaa myös leimatun reagenssin käytettäväksi fluorometrisessä määrityksessä. Reagenssill^ on tun-5 nusomaista, että se käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu aldehydistä, β-diketonista ja NH2~pitoisesta makromolekyylistä, joka on vasta-aine tai antigeeni tai NH2-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin, ja että konden-10 sointituote kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa kompleksiksi, joka voidaan määrittää fluorometrisesti.
Keksintö tarjoaa edelleen orgaanisen aineen fluoro-metrisen määritysmenetelmän, jossa käytetään tällaista leimattua reagenssia.
15 Piirustusten lyhyt kuvaus
Keksintöä selvennetään oheisilla piirustuksilla, jotka esittävät alfa-fetoproteiinin (valittu tyypillisenä NH2~pitoisena vasta-aineena) määritykseen liittyviä käyriä alempana kuvatuissa esimerkeissä.
20 Kuvio 1 esittää kalibrointikäyrää, jossa on käy tetty kaniinin anti-alfafetoproteiinia (AFP) leimattuna suoraan trifluoriasetyyliasetonilla.
*:**: Kuvio 2 esittää kalibrointikäyrää, jossa anti-AFP
on leimattu leimatulla polylysiinillä ja :“**25 kuvio 3 esittää kuvion 2 kalibrointikäyrää, kun • · ·
Eu(III):n fluoresenssi oli maksimaalinen.
• · ·
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus *·"·* 1 MH2~pitoisen aineen eli makromolekyylin (R -NH2), . . β-diketonin (R3COCH-COR3) ja aldehvdin (R^-CHO) välinen 30 reaktio sykliseksi kondensointituotteeksi voidaan esit- • » » ’·[ * tää seuraavan reaktiokaavion avulla: . .·. . o o R -NH2.R2CH0.2R3-C-CH,-C-R3
•f H
: .*. _ \ /
:·: : 35 , ° v O
-> R3-C 1*1 * 3H2° R1 4 87022 12 2
Symbolit R , R ja R ovat mielivaltaisia symboleja, jotka riippuvat lähtöainesten luonteesta.
Keksinnön menetelmässä ei edellytetä β-diketonin modifioimista ennalta ja, koska menetelmä on riippuvai-5 nen vain β-diketonin emäsrakenteesta, eikä yhdenkään substituentin luonteesta, siinä voidaan käyttää lukuisia erilaisia β-diketoneja. Siten on mahdollista valita optimaalinen β-diketoni muiden kriteerien perusteella, joita ovat esim. liukoisten, tyydyttävän absorptiospekt-10 rin omaavien kompleksien muodostus- ja muodostumisvaki-ot metalli-ionille, joka liitetään toimimaan leimaajana ilman immunoreaktiivisuuden menettämistä tai liitetään haitallisten vaikutusten välttämiseksi. Menestyksellisesti käytettyihin β-diketoneihin kuuluu sekä aromaattisia 15 että ei-aromaattisia lajeja ja valmistettaessa kompleksi, joka fluorometrista käyttöä varten leimataan lantanidi-metallilla, on suositeltavaa käyttää fluorilla substitu-oitua ainesta. Esimerkkejä sopivista β-diketoneista ovat trifluoriasetyyliasetoni, tenoyylitrifluoriasetoni, 20 4,4,4-trifluori-1,(2-furyyli)1,3-butaanidioni ja a- ja β-naftoyylitrifluoriasetoni. Muita sopivia β-diketoneja ovat sellaiset, jotka mainitaan artikkelissa Hemmilä et • · ···] ai., Analytical Biochemistry, 1 37, 335-343 (1984) tai ' 1 2 3 GB-patenttijulkaisussa nro 1 560 402 tai yllä mainitussa • · : 1·· 25 EP-patenttihakemuksessa nro 0 064 484 tai EP-patenttiha-• · · kemuksessa nro 0 002 963.
Saattaa olla eduksi käyttää β-diketonia metalli- • :V: pitoisten β-diketonaatin muodossa, jolloin metallina m · on haluttu metalli tai muu metalli (esim. kupari) paran- : 30 tamaan lopputuotteen kelatointiominaisuuksia. Jos alku-- ♦ · peräinen metalli ei ole haluttu, se voidaan korvata • · · lantanidimetallilla, muodostamaan leimattu tuote.
Aldehydinä käytetään edullisesti formaldehydiä, » · · : kun aldehydin ei tarvitse omata spesifistä toimi- • · 2 » · · « · · 3 ♦ 5 87022 vuutta, esim. kelatoimiskykyä, mutta haluttaessa voidaan käyttää muitakin aldehydejä, esim. -C^-alkyylialdehy-dejä, joissa valinnaisesti on inerttejä substituentte-ja, mikä lisää mahdollisuuksia vaihdella muodostuneen 5 syklisen kondensointituotteen ominaisuuksia. Itse alde-hydillä voi olla kelatoivia ominaisuuksia, jotka on tarkoituksellisesti liitetty sen kemialliseen rakenteeseen ja jotka sitten helpottavat leimatun tuotteen metallin kelatoitumista.
10 Keksintöä voidaan käyttää leimattujen reagenssi- en ja niiden prekursorien aikaansaamiseksi orgaanisista aineista siitä riippumatta, sisältävätkö ne alkuaan riittävästi Nl^-ryhmiä syklisen kondensointituotteen muodostamiseksi vaiko ei. Jos orgaaninen aine alkuaan 15 ei sisällä lainkaan N^-ryhmiä tai sisältää niitä riittämättömästi, voidaan syklinen kondensointituote muodostaa siten, että ensin annetaan β-diketonin ja aldehydin reagoida amiinin tai aminohapon tai muun Nl^-pitoisen yhdisteen, esim. Nl^-pitoisen polymeerin (kuten polyly-20 siinin) läsnä ollessa, jossa on aktiivinen ryhmä, joka pystyy reagoimaan makromolekyylin kanssa. Muodostuneen . syklisen kondensointituotteen annetaan sitten reagoida m · ···[ leimattavan orgaanisen aineen kanssa lievissä reaktio- olosuhteissa, joissa aktiiviryhmä voidaan liittää orgaa- • · : **' 25 niseen aineeseen. Tällaisen reaktion esimerkki on karbo- • · · di-imidireaktio. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa ak-: 1.. tiivi esteri, esim. poly-L-lysiinin aktiivi hydroksisuk- :Y: kiini-imidiesteri. On mahdollista käyttää polylysiinin asemasta lysiinipitoista kelaattia, joka sitten edistää : 30 lopputuotteen metallin kelatoitumista. Tällaisen kelaa- • · tin esimerkki on siderofiliini (transferriini) .
• · ·
Keksintö mahdollistaa siis aktivoinnin, jonka avul- ·.:.1 la voidaan leimata lantanidi-metalli-ioneilla mitä erilai- • · ♦ simpia orgaanisia aineita, joita esiintyy luonnostaan ih- : 35 mi s- ja eläinkehon nesteissä tai jotka saadaan viljelemällä • ♦ · • · 1 0 6 87022 tai keinotekoisesti, esim. antigeenejä, vasta-aineita, hormoneja (esim. T4), entsyymejä ja muita proteiineja ja hepteeneja ja kaikkien näiden aineiden katsotaan sisältyvän tässä käytettyyn termiin orgaaninen makromole-5 kyyli. Termi makromolekyyli edellyttää ko. aineilta mole-kyylipainoa yleensä yli 300, pienemmän molekyylipainon omaavat aineet eivät ole poissuljettuja. Makromolekyyliin liittyy yleensä alayksikköjä, esim. aminohappotähteitä, mutta tämä ei ole välttämätöntä.
10 Reaktio syklisen kondensointituotteen muodostami seksi suoritetaan edullisesti lievästi happamassa pH:ssa, esim. 5,5 - 6,5, joskin emäksinenkin pH on mahdollinen. Reaktio suoritetaan edullisesti lievästi kohotetussa lämpötilassa, esim. 30-50°C:ssa. Kondensointituotteen 15 valmistuksessa, jota aiotaan käyttää myöhemmässä määrityksessä, on vältettävä korkeita lämpötiloja, koska ne saattaisivat vaurioittaa NH2_pitoista makromolekyyliä. Matalammat lämpötilat hidastavat reaktiota ja inkuboin-tiajan pidentäminen saattaa olla tarpeen.
20 Keksinnön mukaiset sykliset kondensointituotteet ovat stabiileja ja ne kelatoivat voimakkaasti metalli-ioneja kuten lantanidimetalli-ioneja. Niinpä ne voivat • · reagoida Eu(III):n tai muun fluoresoivia komplekseja « ' ’ muodostavan lantanidimetallin kuten Tb(III):n komplek- • · ; *· 25 siksi ja muodostunut kompleksi fluoresoi yleensä vesi- • : liuoksessa ilman ulkoa lisättvä 3-diketonia. Reaktio voi- • · · ·* : ·.. daan suorittaa minkä tahansa tunnetun tai tavanomaisen 9 menetelmän avulla, esim. dialysoimalla puskuria vastaan, joka sisältää liitettävän metallin ioneja.
.·. ; 30 Kelatoivien aldehydien avulla valmistetut konden- sointituotteet tyydyttävät lantanidimetallien koordinaa- • · * tiokapasiteetin täydellisemmin kuin muiden aldehydien ·.*.· avulla saatavat tuotteet. Niinpä tällaiset tuotteet ke- ·»« latoivat paremmin metalleja ja ovat fluoresenssikykyi- * : 3^ sempiä ollessaan lantanidikelaattimuodossa.
• · · 7 87022
Kondensointituotteiden absorption maksimiaallon-pituudet ovat lähtöaineena käytetystä 0-diketonista riippuen tavallisesti siirtyneet jompaankumpaan suuntaan 0-diketonin maksimiaallonpituudesta. Tätä aallonpituuden 5 ja siten herätysmaksimin siirtymää voidaan pitää osoituk sena kondensointituotteen muodostumisesta.
Syklistä, lantanidimetalli-ionilla leimattua kondensointituotetta voidaankäyttää leimattuna reagens-sina mitä erilaisimpien aineiden fluorometrisessä määri-10 tyksessä, mutta se on ensisijaisesti tarkoitettu orgaanis ten makromolekyylien ja hapteenien määrittämiseen, joita esiintyy kehonnesteissä joko luonnostaan tai sairauden tai häiriötilan vuoksi tai sairauden tai häiriötilan hoidon seurauksena, esim. vasta-aineiden, antigeenien ja 15 muiden proteiinien, hormonien, entsyymien, lääkeainei den tai virushiukkasten määrittämiseen. Fluorometrinen määritys voidaan suorittaa minkä tahansa tunnetun tekniikan tai vakiotekniikan avulla. Esimerkkejä sopivista tekniikoista mainitaan yllä viitatuissa patenttijulkaisuissa 20 ja hakemusjulkaisuissa ja niissä mainituissa viitejulkai suissa. Ks. myös Dakubu S., Ekins R.P. et ai., "High-sen-sitity, pulsed light time-resolved fluoroimmunoassay" ’··* teoksessa Practical Immunoassay, W. Butt (toim., Marcel
Dekker Inc., s. 71-101. Määritys voi olla kvalitatiivi- ♦ *··25 nen määritys, jota käytetään pelkästään mahdollisen vasta- aineen tai muun aineen toteamiseksi tai kvantitatiivinen • · · määritys, jota käytetään määritettävän aineen konsentraa- .*.*. tion mittaamiseksi.
• · * * ·
Yhtenä suositeltavana määritysmenetelmänä on kak-;30 sikohta(sandwich)menettely, jossa määritettävän aineen (esim. vasta-aineen tai antigeenin) annetaan ensin reagoi- • · * » · · da komplementtinsa (sitä vastaavan antigeenin tai sitä vastaavan vasta-aineen) kanssa, jolloin jälkimmäinen on sopivasti sidottuna kiinteään substraattiin, ja tuotteen .’.#35 annetaan reagoida leimatun reagenssin kanssa, joka pystyy • · « • · ♦ · • · 8 87022 reagoimaan määritettävän, sitoutuneen aineen (esim. leimatun antigeenin tai leimatun vasta-aineen) kanssa.
Vaihtoehtoinen fluorimetrinen määritys muodostuu vakioradioimmunomääritystä muistuttavasta menettelystä, 5 jossa määritettävä aine (esim. antigeeni tai vasta-aine) ja leimattu reagenssi kilpailevat komplementissa (esim. vasta-aineessa tai antigeenissä) olevista reaktiivisista kohdista, jolloin komplementti on sopivasti sidottuna kiinteään substraattiin.
10 Käytettäessä fluorimetrisessä immunomäärityksessä syklistä kondensointituotetta on mahdollista mitata fluoresenssi lantanidimetalli-ionin (esim. Eu(III)) määrittämiseksi joko liuoksesta tai leimatusta molekyylistä, joka on sidottu kiinteään alustaan. Mitattaessa liuoksesta 15 lantanidimetalli-ioni voidaan uuttaa leimatusta kompleksista esim. antamalla reagoida lisätyn β-diketonin kanssa (jonka ei tarvitse olla sama kuin kompleksin muodostuksessa käytetty S-diketoni). Lisätty 3-diketoni komp-leksoi metalli-ionin ja syrjäyttää siten kondensointi-20 tuotteen ja muodostunut kompleksi voidaan erottaa kondensoint ituotteesta. Mutta käsiteltävänä olevan keksinnön etuna on, että ei ole tarpeen käyttää tällaista intensi-fiointiliuosta fluoresenssin mittaamiseksi, vaan konden- 9 ’T**: sointituotteen ja lantanidimetalli-ionin muodostama kom- 25 pieksi fluoresoi luontaisesti siten, että sen fluoresens- » .'**· si voidaan mitata suoraan sen ollessa sitoutuneena reak- % · • « · t iotuotteeseen.
* · · .·.·. Määritettäessä fluoresenssin määrä kiiniuauodos- • · · ta tai liuoksesta voidaan tuloksia parantaa lisäämällä . . 30 trioktyylifosfiinioksidia (TOPO), kuten EP-patenttiha- • * · kemuksessa 0 064 484 mainitaan. Tällöin leimatun makro- • · · *·[ * molekyylin fluorimetrisessä määrityksessä konsentraation : tot^amisraja on parempi kuin 10 ^M.
:***: Syklinen kondensointituote, joka on sopivasti • · · . 35 puskuroidussa liuoksessa, voikin sisältyä pakkaukseen • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 87022 fluorimetristen määritysten suorittamiseksi, orgaaninen aine, joka muodostaa osan kondensointituotteesta (joko suoraan tai myöhemmän reaktion kautta varsinaisen osan muodostavan Ni^-pitoisen aineen aktiivin ryhmän kanssa), 5 valitaan asianmukaisesti määritettävästä aineesta riip puen siten, että se pystyy reagoimaan joko määritettävän aineen tai sen komplementin, esim. sopivan vasta-aineen tai antigeenin kanssa. Pakkaukseen sisältyy sopivasti lantanidimetalli-ionista kuten Eu(III) tai 10 Tb(III) ja kondensointituotteesta muodostuva valmiiksi kelatoitu kompleksi. Pakkaukseen voi myös sisältyä erillisenä komponenttina määritettävän aineen komplementti, joka on sidottu kiinteään kantajaan.
Keksinnön toteuttamistapoja 15 Seuraavia reagensseja käytettiin seuraavissa esi merkeissä, joiden tehtävänä on valaista keksintöä.
1) Kaupan oleva kaniinin anti-AFP-liuos, jossa pitoisuus on n. 1 mg/ml.
2) 1:10-laimennos formaldehydiliuoksesta, jonka 20 alkuperäinen formaldehydipitoisuus on 37-40 p/t-% eli laimennoksen konsentraatio on n. 1,4 x 10 ^ moolia/litra.
.*. 3). Perusliuos, jossa on kuparitrifluoriasetyyli- » · * asetonia (CuTFAA) metanolissa konsentraationa 160 mM.
• · .· Esimerkki 1 : „ - _8 '... 25 400 ,ui anti-AFP-liuosta (ts. 2,7 x 10 moolia : : / o anti-AFP:tä) inkuboitiin tunti 37 C:ssa 200,ul:n kera t · ^7 / : ” laimeta formaldehydiliuosta (ts. 2,7 x 10 moolia for- -7 *·*.' maldehydiä) ja 4^ul:n kera CuTFAA-liuosta (ts. 5,4 x 10 moolia CuTFAArta) asetaattipuskurissa (0,2 M) pHrssa 5,7.
• · :Λ: 30 Reaktiotuote dialysoitiin ensin asetaattipuskuria vas- taan reagoimatta jääneiden pienien molekyylien poistami-^ seksi ja sitten asetaattipuskuria vastaan, jossa oli 10 ^ t · l',l M Eu(III)-ioneja, muodostamaan kelatoitu tuote (leimattu • · • » ’** vasta-aine), ja lopuksi asetaattipuskuria vastaan Eu(III):n • i • * · • · · tl· · m • · 10 87022 ylimäärän poistamiseksi. Leimattu vasta-aine liuotettiin tris(hydroksimetyyli)aminometaani-keittosuola-atsidipus-kuriin (0,02 M) pH:ssa 7,6 (50 mM NaCl:ää) määrityksen suorittamiseksi. Vasta-aine olisi haluttaessa voitu puh-5 distaa edelleen kromatografioimalla.
Esimerkki 2
Toistettiin yllä kuvattu maiettely käyttäen kaniinin anti-AVPcn asemasta polylysiiniä, jonka molekyylipai-no oli 80 000. Muodostunut leimattu polylysiini kytketti 0 tiin vasta-aineeseen 1-etvyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidihydrokloridilla.
Esimerkkeissä 1 ja 2 saatuja leimattuja tuotteita käytettiin anti-AFP:n määrittämiseksi kaksikohta{"sandwich" )vakiomääritysmenetelmän avulla.
• · • · ··· ψ 9 9 • * • 9 • · · • ·· • · • · ·· · • · • 99 m • · • 9 · • · · • · • · 9 9 9 • ·· • · • · · • · · • · · • • 9 9 9 9 · • · · 999 • · • · ··· 9 • 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9
Claims (9)
1. Aine, joka voidaan leimata lantanidimetalli-io-nilla käytettäväksi fluo7*ometrisessä määritystekniikassa, 5 tunnettu siitä, että se käsittää syklisen kon-densointituotteen, joka muodostuu NH2-pitoisesta makromolekyylistä, β-diketonista ja aldehydistä, jolloin NH2-pitoinen makromolekyyli on vasta-aine tai antigeeni tai NH2-pitoinen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä 10 liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin.
2. Patenttivaatimuksen l mukainen aine, tunnettu siitä, että β-diketoni on fluorilla sub-stituoitu yhdiste ja/tai 9ldehydi on formaldehydi.
3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen ai-15 ne, tunnettu siitä, että joko β-diketonilla tai aldehydillä on kelatoivia ominaisuuksia.
4. Menetelmä NH2-pitoisen vasta-aineen tai antigeenin aktivoimiseksi lantanidimetalli-ionilla leimausta varten, tunnettu siitä, että annetaan NH2-pi- 20 toisen vasta-aineen tai antigeenin reagoida β-diketonin kanssa aldehydin läsnä ollessa sykliseksi kondensointi-.·.· tuotteeksi.
*:··: 5. Menetelmä vasta-aineen tai antigeenin aktivoi- miseksi lantanidimetalli-ionilla leimausta varten, .**·. 25 tunnettu siitä, että annetaan NH2-pitoisen yh- ··· :·. disteen, jossa on vasta-aineen tai antigeenin kanssa rea- • ·· ]·.·, goiva aktiiviryhmä, reagoida β-diketonin kanssa aldehydin • · · läsnä ollessa sykliseksi kondensointituotteeksi ja liite- . . tään muodostunut tuote vasta-aineeseen tai antigeeniin • · · 'l'm· 30 aktiiviryhmän välityksellä.
» · * ’ 6. Leimattu reagenssi käytettäväksi fluorometri- : sessä määrityksessä, tunnettu siitä, että se • · · .***. käsittää syklisen kondensointituotteen, joka muodostuu aldehydistä, β-diketonista ja NH2-pitoisesta makromole- ’·· | 35 kyylistä, joka on vasta-aine tai antigeeni tai NH2-pitoi-* · 12 87022 nen yhdiste, joka on aktiiviryhmän välityksellä liitetty vasta-aineeseen tai antigeeniin, ja että kondensointi-tuote kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa kompleksiksi, joka voidaan määrittää fluorometrisesti.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen leimattu rea- genssi, tunnettu siitä, että lantanidimetalli-ioni on europium(III) tai terbium(III).
8. Menetelmä orgaanisen aineen määrittämiseksi fluorometrisesti, tunnettu siitä, että käyte- 10 tään patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaista leimattua rea-genssia, ja määritys suoritetaan mahdollisesti sandwich-tekniikalla, ja fluoresenssi mitataan joko a) lantanidimetalli-ionin vielä ollessa reaktiotuotteessa, joka muodostuu leimatusta reagenssista ja määritettävästä ainees-15 ta ja/tai sen komplementista, t?J. b) sen jälkeen kun lan-tanidimetalli-ioni on uutettu reaktiotuotteesta, joka muodostuu leimatusta reagenssista ja määritettävästä aineesta ja/tai sen komplementista.
9. Pakkaus vasta-aineen tai antigeenin määrittämi-20 seksi fluorometrisesti, tunnettu siitä, että se käsittää β-diketonin, aldehydin ja antigeenin tai vasta-aineen, joka pystyy reagoimaan joko määritettävän vasta- ·· · aineen tai antigeenin tai sen komplementin kanssa muodos- tämän syklisen kondensointituotteen puskuroidussa liuok- ’···. 25 sessa, jolloin mainittu antigeeni tai vasta-aine muodos- » · .'** taa suoraan osan syklisestä kondensointituotteesta, jos • ·· \ . antigeeni tai vasta-aine on ΝΗ,-pitoinen, tai on liitetty • · ♦ £ ***** NH2-pitoiseen yhdisteeseen, joka muodostaa suoraan osan syklisestä kondensointituotteesta, ja kondensointituote *.**: 30 kelatoidaan lantanidimetalli-ionin kanssa leimatuksi rea^ ·«· :.! · genssiksi. » · · * · · • 1 · 1 · • · 0 9 90· 9 9 · 9 9 9 0 9 9 9 99 9 9 9 9 S7022
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8421318 | 1984-08-22 | ||
| GB848421318A GB8421318D0 (en) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Potentiating antibodies/other macro-molecules |
| PCT/GB1985/000377 WO1986001604A1 (en) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | Labelled and labellable reagents for fluorometric assays |
| GB8500377 | 1985-08-22 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI870716A FI870716A (fi) | 1987-02-20 |
| FI870716A0 FI870716A0 (fi) | 1987-02-20 |
| FI87022B true FI87022B (fi) | 1992-07-31 |
| FI87022C FI87022C (fi) | 1992-11-10 |
Family
ID=10565671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI870716A FI87022C (fi) | 1984-08-22 | 1987-02-20 | Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4857475A (fi) |
| EP (1) | EP0222766B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0625765B2 (fi) |
| AU (1) | AU4724185A (fi) |
| DE (1) | DE3583507D1 (fi) |
| DK (1) | DK184586D0 (fi) |
| FI (1) | FI87022C (fi) |
| GB (1) | GB8421318D0 (fi) |
| NO (1) | NO861555L (fi) |
| WO (1) | WO1986001604A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886744A (en) * | 1985-04-25 | 1989-12-12 | Polaroid Corporation | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system |
| GB8602304D0 (en) * | 1986-01-30 | 1986-03-05 | Dakubu S | Dihydropyridine condensation products |
| GB8622855D0 (en) * | 1986-09-23 | 1986-10-29 | Ekins R P | Determining biological substance |
| US5089423A (en) * | 1987-05-06 | 1992-02-18 | Cyberfluor Inc. | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter |
| GB8803000D0 (en) * | 1988-02-10 | 1988-03-09 | Ekins Roger Philip | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| SE8703682L (sv) * | 1987-09-24 | 1989-03-25 | Wallac Oy | Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| SE8801702D0 (sv) * | 1988-05-05 | 1988-05-05 | Pharmacia Ab | Sett vid bestemning av enzymatisk aktivitet |
| US5240867A (en) * | 1989-02-09 | 1993-08-31 | Fujitsu Limited | Semiconductor integrated circuit having interconnection with improved design flexibility, and method of production |
| FI88654C (fi) * | 1991-03-15 | 1993-06-10 | Datacity Center Oy | Fluorescenshoejningsmetod |
| US5312922A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-17 | Nordion International Inc. | Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays |
| GB0210535D0 (en) * | 2002-05-08 | 2002-06-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2007084141A2 (en) * | 2005-01-24 | 2007-07-26 | Sri International | Surface-enhanced lanthanide chelates |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3956341A (en) * | 1974-02-21 | 1976-05-11 | Smithkline Corporation | 1,3,5-Tricarbo-1,4-dihydropyridines |
| SE428332B (sv) * | 1979-03-08 | 1983-06-20 | Wallac Oy | Forfarande for fluorescensspektroskopisk bestemning av biologiskt aktivt emne, sasom hapten, antikropp eller antigen |
| US4352751A (en) * | 1979-09-10 | 1982-10-05 | Analytical Radiation Corporation | Species-linked diamine triacetic acids and their chelates |
-
1984
- 1984-08-22 GB GB848421318A patent/GB8421318D0/en active Pending
-
1985
- 1985-08-22 DE DE8585904129T patent/DE3583507D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-22 JP JP60503723A patent/JPH0625765B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-22 EP EP85904129A patent/EP0222766B1/en not_active Expired
- 1985-08-22 WO PCT/GB1985/000377 patent/WO1986001604A1/en active IP Right Grant
- 1985-08-22 AU AU47241/85A patent/AU4724185A/en not_active Abandoned
- 1985-08-22 US US06/862,215 patent/US4857475A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-04-18 NO NO861555A patent/NO861555L/no unknown
- 1986-04-22 DK DK184586A patent/DK184586D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-02-20 FI FI870716A patent/FI87022C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0222766B1 (en) | 1991-07-17 |
| DK184586A (da) | 1986-04-22 |
| FI870716A (fi) | 1987-02-20 |
| FI870716A0 (fi) | 1987-02-20 |
| US4857475A (en) | 1989-08-15 |
| DE3583507D1 (de) | 1991-08-22 |
| GB8421318D0 (en) | 1984-09-26 |
| JPH0625765B2 (ja) | 1994-04-06 |
| WO1986001604A1 (en) | 1986-03-13 |
| AU4724185A (en) | 1986-03-24 |
| NO861555L (no) | 1986-04-18 |
| FI87022C (fi) | 1992-11-10 |
| JPS62501442A (ja) | 1987-06-11 |
| EP0222766A1 (en) | 1987-05-27 |
| DK184586D0 (da) | 1986-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hamd-Ghadareh et al. | An amplified comparative fluorescence resonance energy transfer immunosensing of CA125 tumor marker and ovarian cancer cells using green and economic carbon dots for bio-applications in labeling, imaging and sensing | |
| JP7390778B2 (ja) | ポリマーｂｏｄｉｐｙ色素およびそれを使用する方法 | |
| KR101851797B1 (ko) | 용액상 균질 검정 | |
| FI87022B (fi) | Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar. | |
| Sun et al. | Advances in the study of luminescence probes for proteins | |
| EP1129092B1 (en) | Porphyrin compounds, their conjugates and assay methods based on the use of said conjugates | |
| US7494820B2 (en) | Electrochemiluminescence of rare earth metal chelates | |
| Tan et al. | Development of functionalized fluorescent europium nanoparticles for biolabeling and time-resolved fluorometric applications | |
| EP2839283B1 (en) | Wide range luminescent immunoassays | |
| US20090263914A1 (en) | Bioanalytical assay | |
| EP2699906B1 (en) | Luminescent polymer cyclic amplification | |
| JPS60243052A (ja) | 種結合ジアミン三酢酸の金属キレ−ト | |
| US20050221390A1 (en) | High quantum yield acridinium compounds and their uses in improving assay sensitivity | |
| Diamandis | Multiple labeling and time-resolvable fluorophores | |
| US20210395606A1 (en) | Chromophoric structures for macrocyclic lanthanide chelates | |
| CA2306752C (en) | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same | |
| EP3341726B1 (en) | Immunoassay with enhanced sensitivity | |
| Scorilas et al. | Polyvinylamine-streptavidin complexes labeled with a europium chelator: a universal detection reagent for solid-phase time resolved fluorometric applications | |
| CN112300779A (zh) | 一种聚合增强电化学发光探针及其制备方法和应用 | |
| CA2477385C (en) | Dissociative fluorescence enhancement assay | |
| US11614445B2 (en) | Background blockers for binding assays | |
| Lin et al. | Double-codified nanogold particles based automated flow-through CLEIA for 2, 4-dinitrotoluene | |
| Wu et al. | Lanthanide complex-polyethylenimine Conjugate: A Highly Luminescent Probe for Time-resolved Fluorescence analysis | |
| Hempen | Detection Strategies for Bioassays Based on Liquid Chromatography, Fluorescence Spectroscopy and Mass Spectrometry | |
| JPH0454455A (ja) | 多座配位蛍光キレートで標識した生物物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: DAKUBU, SALIFU Owner name: EKINS, ROGER PHILIP |