JPH0454455A - 多座配位蛍光キレートで標識した生物物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新しい測定試薬を用いる時間分解蛍光分析法
に関する。

本発明は、蛍光物質として１個の希土類金属イオンに対
して実質的に１分子の配位子によりキレートを構成しう
るような多座配位のキレート化剤と希土類金属イオンと
により構成される蛍光希土類金属キレートを利用した測
定試薬及びそれを用いた時間分解蛍光測定法に関する。

さらに本発明は、生物学的反応体と該生物学的反応体と
結合した蛍光希土類金属キレートとからなる蛍光生物学
的反応体において、該蛍光希土類金属キレートが、　１
個の希土類金属イオンに対して実質的に１分子で配位で
きる多座配位のキレート化剤と希土類金属イオンにより
構成され、さらに競合する未標識の周囲物質の蛍光崩壊
寿命に比較して長い蛍光崩壊寿命を有する蛍光生物学的
反応体、および該反応体で標的物質を標識し、次いで該
反応体からの蛍光を検知することにより標的物質を測定
する方法に関する。

（従来技術） 現在、免疫測定法や核酸測定法に代表される生物学的親
和性に基礎をおいた測定法は、疾病等の診断その他にお
いて欠くべからざる手段となっている。該測定方法にお
いては、従来＋２５工、ｔ２ｐ、　　Ｉ％Ｓ等の放射性
同位元素によるｆｆ１ｌを用いた免疫測定法（ＲＩＡ）
に代表される方法が用いられてきた。ＲＩＡは、標識を
賦された物質の変化が少ないこと、徴Ｉの物質の測定が
可能なこと等においては優れているが、放射性同位体を
使用することによる人体・環境に及ぼす危険性、または
標識剤自体が不安定であることが大きな問題になってい
る。また使用に当たっては、アイソトープ処理施設等の
特別の設備が必要であることから設備等に費用がかさむ
ことも欠点である。このような欠点を克服すべく、酵＊
［ｌＩによる開業免疫測定法（ＥＸＡ）、蛍光標識によ
る蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等、またはそれら標識を使
用した核酸測定方法が考案された。

最近では、ＥＩＡに代表される酵素ｆｌｉｔを用いた測
定法が広く応用されている。ＥＩＡは、標識に用いた酵
素の活性を指標として定量するもので、ＲＩＡに匹敵す
る感度を有している。　しかしながら、標識酵素の性質
の変化や安定性に問題があり、また、測定条件、特に温
度変化により結果が大きく影響されてしまう、加えてＲ
ＩＡに比べると測定に要する工程が煩雑であり、また、
使用する酵素が高価であるため費用がかかる等の問題を
抱えている。

ＦＩＡは、標識剤として蛍光物質を用い、その蛍光物質
に由来する蛍光強度の変化を指標とするものであり、標
識体の安定性、掃作性、費用等の点でＲＩＡ、ＥＩＡに
比して優っている。しかしながら、実際には以下のよう
な理由で前二者に比べて測定感度が低いという重大な問
題点を有している。

蛍光現象は、ある励起光の照射により、その化合物の電
子準位に基く固有の放射光を発する現象であるが、励起
光を必要とするため、そのレイリー散乱によりバックグ
ラウンドノイズが発生してしまう、また、血清及び蛋白
中に存在する種々の蛍光物質に由来する多くの蛍光によ
り、ｗｍ剤由来の蛍光の検出が大きく妨害されてしまう
、これらの原因とじては、一般に、蛍光物質のストーク
スシフトが小さい、他のパックグラウンド蛍光から標識
剤の蛍光を区別するための特別な性質が標識に存在しな
いこと等があげられる。

このような問題を解決する手法として時間分解蛍光測定
に基いた分析法の応用が提案された。このような測定原
理に基く方法としては、米国特許第４　、０５８　、７
３２号及び米国特許第４．３４１，９５７号に記載の方
法があげられる。　しかし、ここで示されている蛍光キ
レート化合物は、錯体としての安定度が低く金属保持能
力が悪いという欠点を有している。

このような問題を解決する手段として、米国特許第４，
５６５，７９０号では金属キレート化合物でａｍされた
試薬を標的物質と反応させた後、その反応生成物から抽
出などの挿作を施して金属イオンのみを分離し、次にこ
のようにして分離された金属イオンに別のキレート化剤
等を反応させて新たに蛍光性キレート化合物を作製し、
その蛍光を測定するという煩難な方法を採用している。

しかし、この方法は、生物学的な反応を行わせる工程と
、金属イオンを反応系力）ら分離する工程と、蛍光検出
のための新たな蛍光キレートを作製する工程の三つの段
階を含むため操作性に難があると共に、金属イオンを反
応系から分離する工程を含むため、自然界に存在する金
属イオンによる汚染を受け、結果として測定精度が確保
できないという重大な欠点がある。

（１１！［の解決） このような従来の方法の問題点を解決すべく鋭意研究の
結果、１個の希土類金属イオンに対して、実質的に１分
子の配位子によりキレートを構成しつる多座配位のキレ
ート化剤を用いることにより、安定な蛍光希土類金属キ
レートが得られ、こうして得られた該蛍光希土類金属キ
レートを標識剤として用いると、優れた蛍光特性が得ら
れることを見いだし、本発明を完成した。

（課題を解決するための手段） 本発明は、希土類金属イオン１個に対して、実質的に１
分子の配位子によりキレートを楕成しうるような多座配
位のキレート化剤と希土類金属イオンにより構成される
キレートで標識化した生物学的反応体に関する。

さらに本発明は、上記蛍光希土類金属キレートで標識化
した生物学的反応体を使用して標的物質を処理し、得ら
れた標識化生物学的反応体−標的物質結合物を利用し、
該結合物からの蛍光を時間分解測定することにより櫻的
物質を検知する分析法に関する。

本発明でキレート化剤として使用される典型的な配位子
化合物としては、カゴ型化合物として知られるものがあ
げられる。このようなものとしては、　クリプタンド類
、大環状ポリアミン類、大環状ポリエーテル類、　シク
ロファン類などがあげられる。これら配位子化合物とし
ては、希土類金属イオンをカゴの中に取り込めるもので
あれば特に限定なく使用することができる。

クリプタンド類の基本的な骨格は、 または を有するものがあげられる。このほかクソブの式を有す
る単位が任意に組み合わされて重合されたものがあげら
れる。　（上式中、ＸおよびＹは０、Ｎ、Ｓから独立に
任意に選択されたもので、Ｚは炭化水素環、芳香族環、
複索環で、Ｗは複素環であり、それらＺおよびＷとして
は、例えばベンゼン、フラン、チオフェン、イミダゾー
ル、ピラゾール、ピリジン、キノキサリン、ピリミジン
、チアゾールまたはオキサゾールがあげられる。） クラウン化合物としては、 タンド類として、代表的なものとしては、（上式中、Ｙ
は自由にＯ，Ｓ、　　Ｎ、　　Ｐの中から組み合わせて
選ぶことができ、またＹ＝ＣＨ２の場合も存在していて
よい、ｎは、　３〜１２から選択することができる。Ｔ
は存在していても存在していなくてもよく、脂環式基、
芳香族基、またはＯ，Ｅｉ、　　Ｎを一個以上の任意の
数含有する複素環式基であってよい、）なお、　これら
の配位子化合物の構造は、希土類金属イオンとキレート
を形成したときに、励起光を吸収し、励起状態となった
配位子化合物が、希土類金属イオンに動車よくエネルギ
ーが移動しつるように、構造中にジピリジン、あるいは
フェナントロリンなどのような光吸収性の化学基（ｌｉ
ｇｈｔ　ａｂｓｏｒｂｅｒｓ）を含んでいるとさらに好
ましい形態となる。

また、これらの配位子化合物としては、生物学的反応体
を安定に標識化できる部分を有するものが好ましく、こ
のような部分としては、共有結合を形成しうるような部
分であることが特に好ましい０例えば、蛋白質等に存在
する一Ｎ　Ｈ２基と反応するＣ　Ｉ　Ｓ　０２−基、−
Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基、−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル基などがあげられる。上記の他にも、適当な公知の化
合物の修飾法を利用して、官能基を導入することもでき
る。

上記配位子化合物と生物学的反応体との結合は公知の方
法を用いて行うことができる。

このような方法としては、グルタルアルデヒド法、　過
ヨウ素酸法、　マレイミド法、　ｐ−ニトロベンゾイル
クロライド法、　トリアジン法、とリジンスルフィド法
、　ジアゾ法、　イソシアネート法、カルボジイミド法
、混合酸無水物法等の方法及びそれらの方法を適宜組み
合わせた方法があげられる。　このような方法は、例え
ば有機合成化生協会誌、第４２巻、第４号。

ｐ２８３〜２９２　（１９８４）に記載の方法の中から
選んで、適宜必要な改良を加えて行うことができる。

ここで、配位子化合物と１：１で結合して蛍光希土類金
属キレートを形成しつる希土類金属イオンとしては、時
間分解蛍光測定を実施しつるに十分な蛍光特性を有する
ものであれば特に限定されない、これら希土類金属イオ
ンとしてはＥ　ｕ　”、Ｔｂ’・、Ｎｄ”・、Ｐｍ”Ｓ
ｍ”・　Ｇｄ’・　Ｄｙ２・、Ｅｒ２・があげられるが
、　Ｅ　ｕ　”、　Ｔｂ”が特に好ましい。

本発明において対象とする標的物質としては、血液、体
液、尿、工業用水などに存在する様々な薬物、代紺物買
、生理活性物質、天然物質、抗生物質、遺伝物質があげ
られる。

これら標的物質の代表的なものとしては、抗体、抗原、
核酸、細胞、ポリヌクレオチド、ホルモン、ウィルス、
細菌、原虫、ハブテン、ポリペプチド、アレルゲンなど
があげられる。

本発明で使用することのできる生物学的反応体とは、標
的物質を特異的に認識して反応する物質のことであり、
このような物質として、抗体、抗原、ハブテン、ホルモ
ン、蛋白質、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド
などがあげられる。

標的物質と生物学的反応体の組合せとしては、抗原と抗
体、互いに相補的な核酸、　ビオチンとアビジンあるい
はストレプトアビジン、生体内レセプターとアクセプタ
ーなどがあげられる。

生物学的反応体と標的物質の組合せについてさらに具体
的に説明すると、標的物質が抗原又はハブテンの場合に
は、生物学的反応体としては抗原またはハブテンに対す
る特異抗体、すなわち多価抗体あるいは酵素的に処理し
て得られた抗体断片、例えばＦａｂ、あるいはＦ　（ａ
ｂ’　）ｐなどがあげられる。このような抗体としては
各種ホルモンに対する抗体、各種癌抗原に対する抗体、
各種組織レセプターに対する抗体、各種細菌あるいはウ
ィルスの表面抗原などに対する抗体などがあげられるが
、それらはポリクローナル抗体であってもモノクローナ
ル抗体であってもよい。

また、標的物質が抗体である場合は、生物学的反応体と
しては、その抗体が特異的に認識して反応するような抗
原、ハブテン、あるいは多価抗原のほか、その抗体を特
異的に認識する抗体およびその誘導体があげられる。

さらにまた、標的物質が遺伝子、核酸、ｍＲＮＡ、オリ
ゴヌクレオチドなどの場合、生物学的反応体としては、
それらと相補鎖を形成しつる遺伝子、　核酸、　ＤＮＡ
分子、　ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドなどがあげら
れる。

このような遺伝子または核酸等は、遺伝子組み換え技術
を使用したり化学的な合成法によったり、あるいは生体
試料から抽出により得られたものであってよい、使用目
的の点から例示すると、通常の遺伝病の鱈断に使用する
もの、発癌遺伝子を分析するために使用されるもの等が
あげられる。

本発明において、生物学的反応体と標的物質との相互作
用は必ずしも直接的でなくともよく、生物学的反応体と
標的物質の中間にその相互作用を仲介するようなものを
含んでいてもよい０例えば、生物学的反応体とストレプ
トアビジンを結合せしめ、仲介体としてビオチンで標識
した特異抗体を用いるようなものである０本発明に従え
ば、上記のようにして得られる生物学的反応体と蛍光希
土類金属キレートとよりなる蛍光標識生物学的反応体を
含むｔｔ薬を、　まず血液、血清、体液、尿といった標
的物質を有する検体と反応させる。

この拶的物貿と本発明の試薬との反応にあたっては、当
該分野で従来知られた方法、例えば競合法によっても非
競合法によってもよい。

本発明によれば、使用される希土類金属イオンは、蛍光
希土類金属キレートとして安定にキレート中に保持され
る。それｌ二加えて、該蛍光希土類金属キレートの蛍光
特性は、生物学的反応体に結合した状態においても未結
合状態に比べ低下せず、なお安定な蛍光希土類金属キレ
ートとして存在することができる。

本発明によれば、　１分子の配位子すなわちキレート化
剤は、　１個の希土類金属イオンに安定に配位すること
ができ、金属イオン保持力の高い安定なキレートを形成
することができる。その佐賀は、該配位子を生物学的反
応体に結合した状態においても低下しない、また本Ｒ明
によれば、生物学的活性物質をａｌｌｉ！する場合にそ
のキレート化剤と希土類金属イオンのモル比を工：１と
することが可能であるため、導入された蛍光標識量の予
測が容易にできる。

次に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：　ユウロピウムキレート標識抗ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンαサブユニ ット（ｈＣＧ−α）モノクローナ ル抗体の作製 Ｃ１ｎｑｕｉｎｉ　Ｍ、らの方法（Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｃｈｅ
＋＋、Ｃｏｍｍ、。

ｐ３９３１９７５）に従って得られるクリプタンド誘導
体とユウロピウムにより錯体を形成させ、側鎖を置換す
ることにより化合物Ａを得た。

５０ｍＭリン酸カリウム＆ｌ衝液（ｐＨ７，２）に溶解
した１、０ｇ／−の抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体溶
液１．０艷に、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，２）に溶解した１００＆Ｉｇ／−の化合物Ａ溶液を１
−添加し、室温で１時間撹拌した０反応後の溶液を０．
１χ塩化ナトリウム、０．０５χアジ化ナトリウムを含
む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，７５にて平衡化さ
れたセファデックスＧ−５０（φ２ｃｍｘ　４５Ｃ１１
１）カラムにアプライし、ゲル濾過を行い、同緩衝液で
溶出した。溶出した蛋白質のピークを吸光度２８０ｎｍ
で測定し、櫻識抗体のフラクションを分取した。得られ
たフラクションをさらにセントリカット（分画分子量１
万、倉敷紡績株式会社）にて１．２艷に漬縮した。この
標識抗体溶液からの蛍光を、励起ｆ１１１１２ＢＯｒｍ
、蛍光波長８２０ｎｍという条件下、時間分解蛍光光度
計（１！場製作所、ＮＡＥＳ−１１ＣＭ）、浜松ホトニ
クスフォトンカウンティングシステム）により測定した
。測定した蛍光強度から、キレートによる抗体の標識率
を計算したところ、ユウロピウムイオン：抗体の比率は
８：１であった。

実施例２：Ｍ毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定 抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体１００ｇｆをプラスチ
ック製キュベツトに添加し、プレートを４℃で一晩処理
することで、抗体を固相に結合させた。ついでキュベツ
トをイオン交検水にて洗浄した後、０．５％ＢＳＡ含有
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を５００ノ添加し
ブロッキングした。測定に際し、さらにキュベツトを洗
浄した後、　ｈＣＧ標準溶液（ｈＣＧ漬度二〇、１１０
、１００．１０００　ｍｌ（１／ｄ　）　１００Ｊ、お
よび０．５％Ｅ　Ｓ　Ａ　、０．０１％）ウィーン２０
．　０．９％塩化ナトリウム含有５０＋ａＭリン駿緩衝
液（ｐＨ７，２）　（以下、　アッセイ緩衝液）２０（
１４Ｊｆｉ加し、室温で２時間反応させた。２時間後、
キュベツトを洗浄し。

面相化抗体に未結合の抗原を除去した６次に、希釈調製
した実施例１に記載のユウロピウムキレートｍｍ抗ｈＣ
Ｇ−ａモノクローナル抗体溶液１００−１およびアッセ
イ緩衝液２００−を添加し、さらに２時間反応させた１
反応後、未結合のユウロピウムキレート標識抗ｈＣＧ−
αモノクローナル抗体を洗浄により除去し、励起波Ｊｊ
２８０ｎｍ、蛍光波長６２０ｎｍにおける蛍光強度を時
間分解蛍光光度計（塀場製作所、ＮＡＥＳ−Ｉｎ）、　
　浜松ホトニクスフォトンカウンティングシステム）に
より測定した。測定結果を表１に示した。測定された蛍
光強度は検体中のｈＣＧ漬度に比例した。

表　　　１ ｈＣＧ漬度（ｍｌＬＩ／ｄ） 蛍光強度（ｃｐｓ） １　　Ｂ４４３

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的反応体と該生物学的反応体と結合した蛍
   光希土類金属キレートとからなり、該蛍光希土類金属キ
   レートは１個のイオンに対して実質的に１分子の配位子
   によりキレートを構成しうるような多座配位キレート化
   剤と希土類金属イオンにより構成され、該蛍光希土類金
   属キレートが競合する未標識の周囲物質の蛍光崩壊寿命
   に比較して長い蛍光崩壊寿命を有することを特徴とする
   蛍光生物学的反応体。
2. （２）生物学的反応体と該生物学的反応体と結合した蛍
   光希土類金属キレートとからなり、該蛍光希土類金属キ
   レートは１個のイオンに対して実質的に１分子の配位子
   によりキレートを構成しうるような多座配位キレート化
   剤と希土類金属イオンにより構成され、該蛍光希土類キ
   レートが競合する未標識の周囲物質の蛍光崩壊寿命に比
   較して長い蛍光崩壊寿命を有するものである蛍光生物学
   的反応体で標的物質を標識し、蛍光生物学的反応体−標
   的物質結合物からの蛍光を検出することにより該標的物
   質を測定する方法。