JPH10332695A - 核酸，蛋白質等の検出方法 - Google Patents
核酸，蛋白質等の検出方法Info
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- JPH10332695A JPH10332695A JP15582597A JP15582597A JPH10332695A JP H10332695 A JPH10332695 A JP H10332695A JP 15582597 A JP15582597 A JP 15582597A JP 15582597 A JP15582597 A JP 15582597A JP H10332695 A JPH10332695 A JP H10332695A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高い蛍光強度を発し，かつ，優れた検出感度
が得られる核酸，蛋白質等の検出方法を提供する。 【解決手段】 複環式芳香族アミド酸又は複環式芳香族
マレイミドからなる蛍光物質と，反応基を有する，核
酸，蛋白質等の被検体とを結合させ，該被検体と結合し
てなる上記蛍光物質に励起光を照射し，それにより発す
る蛍光を検出する。被検体の反応基は，チオール基であ
ること，複環式芳香族アミド酸は，４−メチルクマリン
−７−アミド酸，１−ピレンアミド酸，又は２−フルオ
レンアミド酸のいずれかであること，複環式芳香族マレ
イミドは，４−メチルクマリン−７−マレイミド，１−
ピレンマレイミド，又は２−フルオレンマレイミドのい
ずれかであることが好ましい。
が得られる核酸，蛋白質等の検出方法を提供する。 【解決手段】 複環式芳香族アミド酸又は複環式芳香族
マレイミドからなる蛍光物質と，反応基を有する，核
酸，蛋白質等の被検体とを結合させ，該被検体と結合し
てなる上記蛍光物質に励起光を照射し，それにより発す
る蛍光を検出する。被検体の反応基は，チオール基であ
ること，複環式芳香族アミド酸は，４−メチルクマリン
−７−アミド酸，１−ピレンアミド酸，又は２−フルオ
レンアミド酸のいずれかであること，複環式芳香族マレ
イミドは，４−メチルクマリン−７−マレイミド，１−
ピレンマレイミド，又は２−フルオレンマレイミドのい
ずれかであることが好ましい。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は，蛍光物質を用いて核酸，蛋白質
等を検出する方法に関する。
等を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】免疫法は，蛋白質，レセプター，抗体，ホ
ルモン，ステロイド，甲状腺ホルモン，ペプチドホルモ
ン，薬剤，微生物等の，微量な生物活性化合物の検出に
有効であり，従来から，放射性同位元素を用いたラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）がよく用いられてきた。
ルモン，ステロイド，甲状腺ホルモン，ペプチドホルモ
ン，薬剤，微生物等の，微量な生物活性化合物の検出に
有効であり，従来から，放射性同位元素を用いたラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）がよく用いられてきた。
【０００３】ＲＩＡは，極めて高感度でしかも正確な測
定ができる反面，その被爆は健康上有害である。そのた
め，放射性物質の取り扱い，実験者の訓練及び廃棄物の
貯蔵等に特別の注意が必要である。更に，ＲＩキットの
有効寿命はその各種の半減期によって制約されるため，
測定に高価な装置と時間とを要する。そこで，ＲＩにか
わる標識法として，酵素，スピンラベル，ルミネセンス
化合物，金属，蛍光試薬等の標識化剤の開発がされてき
た。
定ができる反面，その被爆は健康上有害である。そのた
め，放射性物質の取り扱い，実験者の訓練及び廃棄物の
貯蔵等に特別の注意が必要である。更に，ＲＩキットの
有効寿命はその各種の半減期によって制約されるため，
測定に高価な装置と時間とを要する。そこで，ＲＩにか
わる標識法として，酵素，スピンラベル，ルミネセンス
化合物，金属，蛍光試薬等の標識化剤の開発がされてき
た。
【０００４】これらのうち，蛍光試薬を用いて蛍光標識
化免疫反応体を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）
は，臨床化学に急激に応用されてきた。最近では，１−
ピレンマレイミドを用いて分析基質の濃度を反応混合物
中で直接モニターできる迅速簡便なホモジニアスアッセ
イが開発されている（Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ．
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，３４０８，
１９６７．Ｌｉｂｕｒｄｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８，２３３，１９７９．Ｒｅ
ｚｉ−Ｐｏｏｒ−Ｋａｒｄｏｓｔ，Ｒ．，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９，１５９，１９
８１．）。
化免疫反応体を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）
は，臨床化学に急激に応用されてきた。最近では，１−
ピレンマレイミドを用いて分析基質の濃度を反応混合物
中で直接モニターできる迅速簡便なホモジニアスアッセ
イが開発されている（Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ．
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，３４０８，
１９６７．Ｌｉｂｕｒｄｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８，２３３，１９７９．Ｒｅ
ｚｉ−Ｐｏｏｒ−Ｋａｒｄｏｓｔ，Ｒ．，ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９，１５９，１９
８１．）。
【０００５】ピレン化合物は，π−電子雲が重くなりや
すく蛍光強度が増感しやすい化合物として知られている
（Ｔｏｎｇ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１１７，１２１５１，１９９５）。この
文献によると，π−電子雲の重なりによって，ピレン１
分子に対して約１０倍の増感が観察されている。
すく蛍光強度が増感しやすい化合物として知られている
（Ｔｏｎｇ．Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１１７，１２１５１，１９９５）。この
文献によると，π−電子雲の重なりによって，ピレン１
分子に対して約１０倍の増感が観察されている。
【０００６】
【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来の方
法では，ピレン分子を多数標識できないため，蛋白質の
検出においてピレン化合物本来の蛍光強度を発揮できな
い。そのため，ピレン化合物を用いた上記従来の検出感
度は低く，ＲＩＡの感度を超えていない。ピレン化合物
を用いて蛋白質の検出を行う場合には，特に検出感度が
低い。
法では，ピレン分子を多数標識できないため，蛋白質の
検出においてピレン化合物本来の蛍光強度を発揮できな
い。そのため，ピレン化合物を用いた上記従来の検出感
度は低く，ＲＩＡの感度を超えていない。ピレン化合物
を用いて蛋白質の検出を行う場合には，特に検出感度が
低い。
【０００７】本発明はかかる従来の問題点に鑑み，高い
蛍光強度を発し，かつ，優れた検出感度が得られる核
酸，蛋白質等の検出方法を提供しようとするものであ
る。
蛍光強度を発し，かつ，優れた検出感度が得られる核
酸，蛋白質等の検出方法を提供しようとするものであ
る。
【０００８】
【課題の解決手段】請求項１の発明は，複環式芳香族ア
ミド酸又は複環式芳香族マレイミドからなる蛍光物質
と，核酸，蛋白質等の被検体の反応基とを反応させ，該
被検体と結合してなる上記蛍光物質に励起光を照射し，
それにより発する蛍光を検出することを特徴とする核
酸，蛋白質等の検出方法である。
ミド酸又は複環式芳香族マレイミドからなる蛍光物質
と，核酸，蛋白質等の被検体の反応基とを反応させ，該
被検体と結合してなる上記蛍光物質に励起光を照射し，
それにより発する蛍光を検出することを特徴とする核
酸，蛋白質等の検出方法である。
【０００９】本発明の検出方法においては，蛍光物質
を，被検体の反応基に直接結合させている。そのため，
蛍光物質本来が持つ高い蛍光強度を十分に発揮できる。
また，蛍光物質として，複環式芳香族アミド酸又は複環
式芳香族マレイミドを用いている。これらの化合物は，
励起光の照射により強い蛍光を発する。そのため，この
蛍光物質を上記のように被検体の反応基に結合させるこ
とにより，蛍光物質の強い蛍光により，高い感度で被検
体を検出できる。それゆえ，微量の被検体を検出するこ
とができ，優れた検出感度を発揮できる。また，本発明
においては，蛍光物質を，被検体の反応基に直接結合さ
せているため，また，被検体の検出操作が簡便で，迅速
に測定できる。
を，被検体の反応基に直接結合させている。そのため，
蛍光物質本来が持つ高い蛍光強度を十分に発揮できる。
また，蛍光物質として，複環式芳香族アミド酸又は複環
式芳香族マレイミドを用いている。これらの化合物は，
励起光の照射により強い蛍光を発する。そのため，この
蛍光物質を上記のように被検体の反応基に結合させるこ
とにより，蛍光物質の強い蛍光により，高い感度で被検
体を検出できる。それゆえ，微量の被検体を検出するこ
とができ，優れた検出感度を発揮できる。また，本発明
においては，蛍光物質を，被検体の反応基に直接結合さ
せているため，また，被検体の検出操作が簡便で，迅速
に測定できる。
【００１０】被検体の反応基は，被検体自身がもつ官能
基であるか，または別物質を反応基として被検体に導入
したものである。前者を例示すれば，被検体がタンパク
質の場合には，アミノ酸の側鎖同士が結合してなるジス
ルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を解離させてチオール基
（−ＳＨ）とし，これを反応基として利用する。後者を
例示すれば，ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸の塩基部位に反応
基を導入する。
基であるか，または別物質を反応基として被検体に導入
したものである。前者を例示すれば，被検体がタンパク
質の場合には，アミノ酸の側鎖同士が結合してなるジス
ルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を解離させてチオール基
（−ＳＨ）とし，これを反応基として利用する。後者を
例示すれば，ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸の塩基部位に反応
基を導入する。
【００１１】請求項２の発明のように，上記被検体の反
応基は，チオール基であることが好ましい。これによ
り，被検体と蛍光物質との結合強度が高くなり，優れた
検出感度が得られる。被検体の反応基がチオール基（−
ＳＨ）である場合には，蛍光物質は，そのチオール基と
の酸化反応により，ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を
形成して，被検体と蛍光物質とが結合する。また，被検
体の反応基としては，上記のチオール基の他に，アミノ
基等がある。
応基は，チオール基であることが好ましい。これによ
り，被検体と蛍光物質との結合強度が高くなり，優れた
検出感度が得られる。被検体の反応基がチオール基（−
ＳＨ）である場合には，蛍光物質は，そのチオール基と
の酸化反応により，ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を
形成して，被検体と蛍光物質とが結合する。また，被検
体の反応基としては，上記のチオール基の他に，アミノ
基等がある。
【００１２】複環式芳香族アミド酸は，アミド酸と，２
以上の環構造とを有している。アミド酸は，一般に，ア
ミド結合部位（−ＮＨＣＯ−）と，カルボキシル基等を
含む有機酸とからなる。有機酸としては，例えば，マレ
インアミド酸等がある。２以上の環構造は，例えば，ク
マリン，ピレン，フルオレン，フオルオランセン，ロー
ダミン，フルオレセイン，シアニン等，又はこれらに側
鎖が結合したものなどがある。側鎖は，メチル基，エチ
ル基等のアルキル基，ヒドロキシル基等があるが，これ
らに限定されない。
以上の環構造とを有している。アミド酸は，一般に，ア
ミド結合部位（−ＮＨＣＯ−）と，カルボキシル基等を
含む有機酸とからなる。有機酸としては，例えば，マレ
インアミド酸等がある。２以上の環構造は，例えば，ク
マリン，ピレン，フルオレン，フオルオランセン，ロー
ダミン，フルオレセイン，シアニン等，又はこれらに側
鎖が結合したものなどがある。側鎖は，メチル基，エチ
ル基等のアルキル基，ヒドロキシル基等があるが，これ
らに限定されない。
【００１３】アミド酸は，例えば，アミド結合部位（−
ＮＨＣＯ−）において環構造部位と結合している。上記
複環式芳香族アミド酸は，被検体の反応基と，アミド酸
のオレフィンの部位において結合する。
ＮＨＣＯ−）において環構造部位と結合している。上記
複環式芳香族アミド酸は，被検体の反応基と，アミド酸
のオレフィンの部位において結合する。
【００１４】請求項３の発明のように，上記複環式芳香
族アミド酸は，４−メチルクマリン−７−アミド酸，１
−ピレンアミド酸，又は２−フルオレンアミド酸のいず
れかであることが好ましい。これにより，複環式芳香族
アミド酸が強い蛍光を発し，高い検出感度が得られる。
族アミド酸は，４−メチルクマリン−７−アミド酸，１
−ピレンアミド酸，又は２−フルオレンアミド酸のいず
れかであることが好ましい。これにより，複環式芳香族
アミド酸が強い蛍光を発し，高い検出感度が得られる。
【００１５】複環式芳香族マレイミドは，マレイミド
と，２以上の環構造を有している。複環式芳香族マレイ
ミドにおける２以上の環構造は，例えば，上記の複環式
芳香族アミド酸における環構造と同様である。マレイミ
ドと環構造部位とは，直接共有結合により結合している
場合もあるが，両者の間に炭素鎖等が介在して結合して
いる場合もある。上記複環式芳香族マレイミドは，被検
体の反応基と，マレイミドのオレフィンの部位において
結合する。
と，２以上の環構造を有している。複環式芳香族マレイ
ミドにおける２以上の環構造は，例えば，上記の複環式
芳香族アミド酸における環構造と同様である。マレイミ
ドと環構造部位とは，直接共有結合により結合している
場合もあるが，両者の間に炭素鎖等が介在して結合して
いる場合もある。上記複環式芳香族マレイミドは，被検
体の反応基と，マレイミドのオレフィンの部位において
結合する。
【００１６】請求項４の発明のように，上記複環式芳香
族マレイミドは，４−メチルクマリン−７−マレイミ
ド，１−ピレンマレイミド，又は２−フルオレンマレイ
ミドのいずれかであることが好ましい。これにより，複
環式芳香族マレイミドが強い蛍光を発し，高い検出感度
が得られる。
族マレイミドは，４−メチルクマリン−７−マレイミ
ド，１−ピレンマレイミド，又は２−フルオレンマレイ
ミドのいずれかであることが好ましい。これにより，複
環式芳香族マレイミドが強い蛍光を発し，高い検出感度
が得られる。
【００１７】励起光の照射は，ハロゲンランプ，キセノ
ンランプ等の手段により，励起光を蛍光物質に照射す
る。蛍光物質が発する蛍光を検出するにあたっては，最
大蛍光波長以下の短波長をカットするカットフィルター
を通した後，蛍光顕微鏡，溶射型蛍光検出器，トンラン
イルミネーター等の手段により行うことができる。
ンランプ等の手段により，励起光を蛍光物質に照射す
る。蛍光物質が発する蛍光を検出するにあたっては，最
大蛍光波長以下の短波長をカットするカットフィルター
を通した後，蛍光顕微鏡，溶射型蛍光検出器，トンラン
イルミネーター等の手段により行うことができる。
【００１８】本発明によれば，核酸，タンパク質に限ら
ず，生理活性物質，生体内物質等の様々な被検体の標
識，検定を行なうことができる。従って，本発明は，臨
床検査，医療診断，遺伝子学，生物学，医学，臨床学，
化学等の広い分野において，幅広く用いることができ
る。
ず，生理活性物質，生体内物質等の様々な被検体の標
識，検定を行なうことができる。従って，本発明は，臨
床検査，医療診断，遺伝子学，生物学，医学，臨床学，
化学等の広い分野において，幅広く用いることができ
る。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明の実施形態例にかかる核酸
等の検出方法は，図１〜図６に示すごとく，試料１〜６
の蛍光物質により核酸を標識し，励起光照射により発す
る蛍光を検出する方法である。本発明の検出方法を，比
較例である試料Ｃ１の蛍光物質を用いた検出方法ととも
に，説明する。
等の検出方法は，図１〜図６に示すごとく，試料１〜６
の蛍光物質により核酸を標識し，励起光照射により発す
る蛍光を検出する方法である。本発明の検出方法を，比
較例である試料Ｃ１の蛍光物質を用いた検出方法ととも
に，説明する。
【００２０】試料１の蛍光物質は，図１に示すごとく，
４−メチルクマリン−７−アミド酸である。これを製造
するに当たっては，まず，７−アミノ−４−メチルクマ
リン（１．０４４ｍｍｏｌ）を１．１当量の無水マレイ
ン酸とＴＨＦ（テトラヒドロフランを意味する。以下，
同様）１５ｍｌ中室温で３６時間反応させた。反応後黄
色の沈殿が得られたため，吸引ろ過し，この結晶をエー
テルで洗浄した。これにより，４−メチルクマリン−７
−アミド酸を収率８７％で得た。
４−メチルクマリン−７−アミド酸である。これを製造
するに当たっては，まず，７−アミノ−４−メチルクマ
リン（１．０４４ｍｍｏｌ）を１．１当量の無水マレイ
ン酸とＴＨＦ（テトラヒドロフランを意味する。以下，
同様）１５ｍｌ中室温で３６時間反応させた。反応後黄
色の沈殿が得られたため，吸引ろ過し，この結晶をエー
テルで洗浄した。これにより，４−メチルクマリン−７
−アミド酸を収率８７％で得た。
【００２１】試料２の蛍光物質は，図２に示すごとく，
４−メチルクマリン−７−マレイミドである。これを製
造するに当たっては，まず，４−メチルクマリン−７−
アミド酸（０．１３６ｍｍｏｌ）に対して１当量の臭化
亜鉛と１．５当量のＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン
を意味する。以下，同様）とを加え，ベンゼン中１．５
時間加熱還流した。反応後溶媒を流去し，クロロホルム
で抽出し，カラムクロマト精製（ヘキサン：酢酸エチル
＝８：２）を行った。これにより，４−メチルクマリン
−７−マレイミドを収率９７％で得た。
４−メチルクマリン−７−マレイミドである。これを製
造するに当たっては，まず，４−メチルクマリン−７−
アミド酸（０．１３６ｍｍｏｌ）に対して１当量の臭化
亜鉛と１．５当量のＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン
を意味する。以下，同様）とを加え，ベンゼン中１．５
時間加熱還流した。反応後溶媒を流去し，クロロホルム
で抽出し，カラムクロマト精製（ヘキサン：酢酸エチル
＝８：２）を行った。これにより，４−メチルクマリン
−７−マレイミドを収率９７％で得た。
【００２２】試料３の蛍光物質は，図３に示すごとく，
１−ピレンアミド酸である。これを製造するに当たって
は，まず，１−アミノピレン（０．５０５ｍｍｏｌ）を
１．１当量の無水マレイン酸とＴＨＦ５ｍｌ中室温で１
７時間反応させた。反応後黄色の沈殿が得られたため，
吸引ろ過し，この結晶をエーテルで洗浄した。これによ
り，１−ピレンアミド酸を収率９５％で得た。
１−ピレンアミド酸である。これを製造するに当たって
は，まず，１−アミノピレン（０．５０５ｍｍｏｌ）を
１．１当量の無水マレイン酸とＴＨＦ５ｍｌ中室温で１
７時間反応させた。反応後黄色の沈殿が得られたため，
吸引ろ過し，この結晶をエーテルで洗浄した。これによ
り，１−ピレンアミド酸を収率９５％で得た。
【００２３】試料４の蛍光物質は，図４に示すごとく，
１−ピレンマレイミドである。これを製造するに当たっ
ては，まず，１−ピレンアミド酸（０．２２７ｍｍｏ
ｌ）に対して１当量の臭化亜鉛と１．５当量のＨＭＤＳ
とを加え，ベンゼン中３０分間加熱還流した。反応後溶
媒を流去し，酢酸エチルで抽出し，カラムクロマト精製
（ヘキサン：酢酸エチル＝８：２）を行った。これによ
り，１−ピレンマレイミドを収率９８％で得た。
１−ピレンマレイミドである。これを製造するに当たっ
ては，まず，１−ピレンアミド酸（０．２２７ｍｍｏ
ｌ）に対して１当量の臭化亜鉛と１．５当量のＨＭＤＳ
とを加え，ベンゼン中３０分間加熱還流した。反応後溶
媒を流去し，酢酸エチルで抽出し，カラムクロマト精製
（ヘキサン：酢酸エチル＝８：２）を行った。これによ
り，１−ピレンマレイミドを収率９８％で得た。
【００２４】試料５の蛍光物質は，図５に示すごとく，
２−フルオレンアミド酸である。これを製造するに当た
っては，まず，２−アミノフルオレン（３．３１１ｍｍ
ｏｌ）を１当量の無水マレイン酸とエーテル３０ｍｌ中
室温で１．５時間反応させた。反応後黄色の沈殿が得ら
れたため，吸引ろ過し，この結晶をエーテルで洗浄し
た。これにより，２−フルオレンアミド酸を収率９４％
で得た。
２−フルオレンアミド酸である。これを製造するに当た
っては，まず，２−アミノフルオレン（３．３１１ｍｍ
ｏｌ）を１当量の無水マレイン酸とエーテル３０ｍｌ中
室温で１．５時間反応させた。反応後黄色の沈殿が得ら
れたため，吸引ろ過し，この結晶をエーテルで洗浄し
た。これにより，２−フルオレンアミド酸を収率９４％
で得た。
【００２５】試料６の蛍光物質は，図６に示すごとく，
２−フルオレンマレイミドである。これを製造するに当
たっては，まず，２−フルオレンアミド酸（０．４５１
ｍｍｏｌ）に対して１当量の臭化亜鉛と１．５当量のＨ
ＭＤＳとを加え，ベンゼン中３０分間加熱還流した。反
応後溶媒を流去し，酢酸エチルで抽出し，カラムクロマ
ト精製（ヘキサン：酢酸エチル＝８：２）を行った。こ
れにより，２−フルオレンマレイミドを収率９３％で得
た。上記の試料１〜６の蛍光物質の構造は，ＮＭＲ，Ｉ
Ｒ，ＭＡＳＳスペクトル及び元素分析により確認した。
２−フルオレンマレイミドである。これを製造するに当
たっては，まず，２−フルオレンアミド酸（０．４５１
ｍｍｏｌ）に対して１当量の臭化亜鉛と１．５当量のＨ
ＭＤＳとを加え，ベンゼン中３０分間加熱還流した。反
応後溶媒を流去し，酢酸エチルで抽出し，カラムクロマ
ト精製（ヘキサン：酢酸エチル＝８：２）を行った。こ
れにより，２−フルオレンマレイミドを収率９３％で得
た。上記の試料１〜６の蛍光物質の構造は，ＮＭＲ，Ｉ
Ｒ，ＭＡＳＳスペクトル及び元素分析により確認した。
【００２６】比較例としての試料Ｃ１の蛍光物質は，図
７に示すごとく，フルオレセインマレイミドである。
７に示すごとく，フルオレセインマレイミドである。
【００２７】次に，上記の蛍光物質を用いてλＤＮＡを
標識した。即ち，λＤＮＡをＥｃｏｔという制限酵素で
特異的に切断した。次いで，Ｆａｓｔ Ｔａｇ（ベクタ
ー社，商品名）を用いて，ＤＮＡ切断片にチオール基を
結合した。ＤＮＡ断片を１０ｎｇ／μｌになるようにバ
ッファーで希釈し，ナイロンメンブレンに１μｌスポッ
トした。次いで，チオール基を結合したＤＮＡ断片に，
上記の試料１〜６，Ｃ１の蛍光物質を室温で５分間反応
させた。
標識した。即ち，λＤＮＡをＥｃｏｔという制限酵素で
特異的に切断した。次いで，Ｆａｓｔ Ｔａｇ（ベクタ
ー社，商品名）を用いて，ＤＮＡ切断片にチオール基を
結合した。ＤＮＡ断片を１０ｎｇ／μｌになるようにバ
ッファーで希釈し，ナイロンメンブレンに１μｌスポッ
トした。次いで，チオール基を結合したＤＮＡ断片に，
上記の試料１〜６，Ｃ１の蛍光物質を室温で５分間反応
させた。
【００２８】次いで，Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｄｅｔｅｃｔｏｒであるＥｐｉ−ＬｉｇｈｔＵＶ Ｆ
Ａ−１１００（商品名，アイシンコスモス研究所製，３
０２ｍｎ，２ｍＷ／ｃｍ2 ）を用いて，ナイロンメンブ
レン上のＤＮＡ断片に結合した蛍光物質の蛍光強度を測
定した。その結果を，表１に示した。
ｄｅｔｅｃｔｏｒであるＥｐｉ−ＬｉｇｈｔＵＶ Ｆ
Ａ−１１００（商品名，アイシンコスモス研究所製，３
０２ｍｎ，２ｍＷ／ｃｍ2 ）を用いて，ナイロンメンブ
レン上のＤＮＡ断片に結合した蛍光物質の蛍光強度を測
定した。その結果を，表１に示した。
【００２９】同表より知られるように，試料１〜６のい
ずれの蛍光物質によりλＤＮＡを標識した場合にも，高
い蛍光強度が得られた。また，消光速度が遅く，検出す
るに十分な時間蛍光を発し続けた。一方，試料Ｃ１の蛍
光物質は，蛍光強度は高かったが，消光が早いため，検
出が困難であった。また試料Ｃ１は，取り扱い，品質に
も注意を要した。
ずれの蛍光物質によりλＤＮＡを標識した場合にも，高
い蛍光強度が得られた。また，消光速度が遅く，検出す
るに十分な時間蛍光を発し続けた。一方，試料Ｃ１の蛍
光物質は，蛍光強度は高かったが，消光が早いため，検
出が困難であった。また試料Ｃ１は，取り扱い，品質に
も注意を要した。
【００３０】試料１〜６，Ｃ１の蛍光物質は，チオール
基を結合させたＤＮＡ断片との反応前では励起光照射に
よる蛍光は認められず無蛍光の化合物であったが，反応
後は励起光照射により高い蛍光を発する蛍光体となっ
た。
基を結合させたＤＮＡ断片との反応前では励起光照射に
よる蛍光は認められず無蛍光の化合物であったが，反応
後は励起光照射により高い蛍光を発する蛍光体となっ
た。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば，高い蛍光強度を発し，
かつ，優れた検出感度が得られる核酸，蛋白質等の検出
方法を提供することができる。
かつ，優れた検出感度が得られる核酸，蛋白質等の検出
方法を提供することができる。
【図１】実施形態例における，試料１の蛍光物質（４−
メチルクマリン−７−アミド酸）の化学構造式を示す説
明図。
メチルクマリン−７−アミド酸）の化学構造式を示す説
明図。
【図２】実施形態例における，試料２の蛍光物質（４−
メチルクマリン−７−マレイミド）の化学構造式を示す
説明図。
メチルクマリン−７−マレイミド）の化学構造式を示す
説明図。
【図３】実施形態例における，試料３の蛍光物質（１−
ピレンアミド酸）の化学構造式を示す説明図。
ピレンアミド酸）の化学構造式を示す説明図。
【図４】実施形態例における，試料４の蛍光物質（１−
ピレンマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
ピレンマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
【図５】実施形態例における，試料５の蛍光物質（１−
フルオレンアミド酸）の化学構造式を示す説明図。
フルオレンアミド酸）の化学構造式を示す説明図。
【図６】実施形態例における，試料６の蛍光物質（１−
フルオレンマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
フルオレンマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
【図７】実施形態例における，試料Ｃ１の蛍光物質（フ
ルオレセインマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
ルオレセインマレイミド）の化学構造式を示す説明図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パイディ・イェラ・レディ 愛知県刈谷市八軒町５丁目50番地 株式会 社アイシン・コスモス研究所内 (72)発明者 融 健 愛知県愛知郡東郷町御岳２−18−19
Claims (4)
- 【請求項１】 複環式芳香族アミド酸又は複環式芳香族
マレイミドからなる蛍光物質と，核酸，蛋白質等の被検
体の反応基とを反応させ，該被検体と結合してなる上記
蛍光物質に励起光を照射し，それにより発する蛍光を検
出することを特徴とする核酸，蛋白質等の検出方法。 - 【請求項２】 請求項１において，上記被検体の反応基
は，チオール基であることを特徴とする核酸，蛋白質等
の検出方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２において，上記複環式芳
香族アミド酸は，４−メチルクマリン−７−アミド酸，
１−ピレンアミド酸，又は２−フルオレンアミド酸のい
ずれかであることを特徴とする核酸，蛋白質等の検出方
法。 - 【請求項４】 請求項１又は２において，上記複環式芳
香族マレイミドは，４−メチルクマリン−７−マレイミ
ド，１−ピレンマレイミド，又は２−フルオレンマレイ
ミドのいずれかであることを特徴とする核酸，蛋白質等
の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15582597A JPH10332695A (ja) | 1997-05-28 | 1997-05-28 | 核酸，蛋白質等の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15582597A JPH10332695A (ja) | 1997-05-28 | 1997-05-28 | 核酸，蛋白質等の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10332695A true JPH10332695A (ja) | 1998-12-18 |
Family
ID=15614322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15582597A Pending JPH10332695A (ja) | 1997-05-28 | 1997-05-28 | 核酸，蛋白質等の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10332695A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007032363A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | The University Of Tokyo | 新規マレイミド誘導体 |
| JP2007204452A (ja) * | 2006-02-06 | 2007-08-16 | Univ Of Tokyo | 新規クマリン誘導体 |
| JP2009221404A (ja) * | 2008-03-18 | 2009-10-01 | Seed Co Ltd | ピレン化合物及びこれを含む高分子化合物 |
| CN103788076A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 山西大学 | 一种检测半胱氨酸的试剂和方法 |
-
1997
- 1997-05-28 JP JP15582597A patent/JPH10332695A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007032363A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | The University Of Tokyo | 新規マレイミド誘導体 |
| JP5292570B2 (ja) * | 2005-09-13 | 2013-09-18 | 国立大学法人 東京大学 | 新規マレイミド誘導体 |
| JP2007204452A (ja) * | 2006-02-06 | 2007-08-16 | Univ Of Tokyo | 新規クマリン誘導体 |
| JP2009221404A (ja) * | 2008-03-18 | 2009-10-01 | Seed Co Ltd | ピレン化合物及びこれを含む高分子化合物 |
| CN103788076A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 山西大学 | 一种检测半胱氨酸的试剂和方法 |
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