JP3021038B2 - 標識技術を用いた複数分析物の検出または定量 - Google Patents
標識技術を用いた複数分析物の検出または定量Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、複数の対象物質（“分析物”）をケミルミ
ネサンス反応に関与できる別の分子または分子類と連結
させ（“標識して”）、試料中の、各物質のそれぞれを
アッセイ、検出、定量、局在または分析する方法、およ
びそのための試薬（類）に関する。
ネサンス反応に関与できる別の分子または分子類と連結
させ（“標識して”）、試料中の、各物質のそれぞれを
アッセイ、検出、定量、局在または分析する方法、およ
びそのための試薬（類）に関する。
本明細書において、ケミルミネサンス反応は、電磁放
射線の放出をもたらす化学反応を伴うものとして定義さ
れる。このルミネサンスは、蛍光およびりん光と明確に
識別される。さらに正確にはケミルミネサンスとは、生
体反応（バイオルミネサンス反応）による光放出も包含
する。
射線の放出をもたらす化学反応を伴うものとして定義さ
れる。このルミネサンスは、蛍光およびりん光と明確に
識別される。さらに正確にはケミルミネサンスとは、生
体反応（バイオルミネサンス反応）による光放出も包含
する。
ルミネサンス反応は、通常、他の試薬類、補因子類、
または触媒（Ｄ）の存在下または不存在下で、または物
理的トリガー（惹起剤）の作用によって、少なくとも２
分子（ＳおよびＬ）間に起る反応である。Ｌは、ルミノ
ールのような、光を発する物質である。Ｓは、例えば酸
素または過酸化水素のように、Ｌと反応して励起をひき
おこす物質である。（もし存在するならば）Ｄは、酵
素、ルシフェラーゼ、またはフェリシアン化カリウムの
ような補因子、および／または触媒またはトリガー（惹
起剤）である。ＬとＳとの反応はＬの励起分子Ｌ＊への
変換をもたらし、およびこの励起分子の非励起状態への
復帰は光子の放出をもたらす。ＬとＳとの反応、および
Ｌ＊の非励起状態への復帰は自然に起きるか、または、
補因子または触媒Ｄの存在、または温度のような物理的
トリガーを必要とする。このような反応の例として、ル
ミノールのH2Oによる酸化がある。触媒および補因子類
は本文におけるように無機化合物類であることが多い
が、ルミノールが関与するルミネサンス反応を触媒する
酵素パーオキシダーゼのように、生体材料から抽出され
たものであってもよい。
または触媒（Ｄ）の存在下または不存在下で、または物
理的トリガー（惹起剤）の作用によって、少なくとも２
分子（ＳおよびＬ）間に起る反応である。Ｌは、ルミノ
ールのような、光を発する物質である。Ｓは、例えば酸
素または過酸化水素のように、Ｌと反応して励起をひき
おこす物質である。（もし存在するならば）Ｄは、酵
素、ルシフェラーゼ、またはフェリシアン化カリウムの
ような補因子、および／または触媒またはトリガー（惹
起剤）である。ＬとＳとの反応はＬの励起分子Ｌ＊への
変換をもたらし、およびこの励起分子の非励起状態への
復帰は光子の放出をもたらす。ＬとＳとの反応、および
Ｌ＊の非励起状態への復帰は自然に起きるか、または、
補因子または触媒Ｄの存在、または温度のような物理的
トリガーを必要とする。このような反応の例として、ル
ミノールのH2Oによる酸化がある。触媒および補因子類
は本文におけるように無機化合物類であることが多い
が、ルミノールが関与するルミネサンス反応を触媒する
酵素パーオキシダーゼのように、生体材料から抽出され
たものであってもよい。
上記に述べたこれらの方法および試薬類はイムアッセ
イ、タンパク質結合アッセイ、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ、細胞レセプター結合アッセイおよび特定
の結合相手または試薬との目的物質の結合を伴う他の同
様の技術のような広範囲の技術において使用できる。こ
れらの連結型は、本文で“結合または連結”と称する。
イ、タンパク質結合アッセイ、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ、細胞レセプター結合アッセイおよび特定
の結合相手または試薬との目的物質の結合を伴う他の同
様の技術のような広範囲の技術において使用できる。こ
れらの連結型は、本文で“結合または連結”と称する。
対象の物質類は、ペプチド類、タンパク質類、ポリペ
プチド類、核酸類および生体関連の他の物質類であるこ
ともできる。
プチド類、核酸類および生体関連の他の物質類であるこ
ともできる。
結合アッセイは、生体関連の分子類の定量に多年にわ
たり使用されてきた。結合段階が免疫反応、タンパク質
結合反応、細胞レセプターとの反応または相補性の核酸
ハイブリダイゼーション反応である数多くの例が示され
てきた。これらの反応に基づく感度の良いアッセイで
は、結合度したがって反応の別の成分−対象物質−の濃
度または質量が測定できるように、このような反応の結
合相手のひとつに付着するかまたは取り込まれる標識の
使用を必要としている。前記基本的結合反応の多くのバ
リエーションが記載されてきており、かつ、放射性同位
体類、酵素類、蛍光分子類およびケミルミネサンス分子
類を含む多くの異なる標識類が使用されてきた。
たり使用されてきた。結合段階が免疫反応、タンパク質
結合反応、細胞レセプターとの反応または相補性の核酸
ハイブリダイゼーション反応である数多くの例が示され
てきた。これらの反応に基づく感度の良いアッセイで
は、結合度したがって反応の別の成分−対象物質−の濃
度または質量が測定できるように、このような反応の結
合相手のひとつに付着するかまたは取り込まれる標識の
使用を必要としている。前記基本的結合反応の多くのバ
リエーションが記載されてきており、かつ、放射性同位
体類、酵素類、蛍光分子類およびケミルミネサンス分子
類を含む多くの異なる標識類が使用されてきた。
これらのさまざまな組み合わせが、ホルモン類および
薬物類のような小分子類からヌクレオチド類のような大
分子類にわたる広範囲の分析物類の検出および定量のた
めに次から次へと使用されてきた。
薬物類のような小分子類からヌクレオチド類のような大
分子類にわたる広範囲の分析物類の検出および定量のた
めに次から次へと使用されてきた。
一般的に述べれば、これらの技術は１試験反応におけ
る単一分析物の探索に応用されてきたに過ぎず、本質的
に単一の試験操作によって２分析物を分析してきた例の
数は限られている。これらの内で最も公知であるのは、
ビタミンB12と葉酸およびチロキシンおよび甲状腺刺激
ホルモン放出ホルモンのための同時イムノアッセイおよ
び／またはタンパク質結合アッセイであった。これらの
場合においては、前記２種の異なる反応類を、それぞれ
について異なる放射性同位元素を使用して別々にモニタ
ーする。ここでは、適当なガンマカウンターを用いて放
射線の放出が識別可能であるコバルト−57およびヨウ素
−125が用いられる。類似の手段が、ルトロピンおよび
フォリトロピン同時測定にも使用できる。
る単一分析物の探索に応用されてきたに過ぎず、本質的
に単一の試験操作によって２分析物を分析してきた例の
数は限られている。これらの内で最も公知であるのは、
ビタミンB12と葉酸およびチロキシンおよび甲状腺刺激
ホルモン放出ホルモンのための同時イムノアッセイおよ
び／またはタンパク質結合アッセイであった。これらの
場合においては、前記２種の異なる反応類を、それぞれ
について異なる放射性同位元素を使用して別々にモニタ
ーする。ここでは、適当なガンマカウンターを用いて放
射線の放出が識別可能であるコバルト−57およびヨウ素
−125が用いられる。類似の手段が、ルトロピンおよび
フォリトロピン同時測定にも使用できる。
放射性試薬類は、３つの大きな欠点を有している。ま
ず第１に、標識の方法が高放射性であって潜在的に危険
な試薬類の使用を伴う。第２に、標識された放射性物質
の保存寿命が、まさにその本来の性質によって、放出性
同位元素が間断なく崩壊することばかりでなく、また、
放射性標識タンパク質類がしばしば不安定であるという
ことのために、実質的にしばしば短いことである。第３
に、感度よくかつ迅速に検出可能な試薬を提供するほど
十分にタンパク質類を標識することがしばしば困難であ
る。ルミネサンスの測定は高感度でかつ極めて迅速であ
り、測定時間は、通常放射能の測定に要する数分という
よりもどちらかといえば秒の単位である。ルミネサンス
反応に通常は関与できない物質類にルミネサンス反応に
関与可能な物質を共有結合または非有結合することで、
極めて少量で迅速に測定できる試薬を提供する。
ず第１に、標識の方法が高放射性であって潜在的に危険
な試薬類の使用を伴う。第２に、標識された放射性物質
の保存寿命が、まさにその本来の性質によって、放出性
同位元素が間断なく崩壊することばかりでなく、また、
放射性標識タンパク質類がしばしば不安定であるという
ことのために、実質的にしばしば短いことである。第３
に、感度よくかつ迅速に検出可能な試薬を提供するほど
十分にタンパク質類を標識することがしばしば困難であ
る。ルミネサンスの測定は高感度でかつ極めて迅速であ
り、測定時間は、通常放射能の測定に要する数分という
よりもどちらかといえば秒の単位である。ルミネサンス
反応に通常は関与できない物質類にルミネサンス反応に
関与可能な物質を共有結合または非有結合することで、
極めて少量で迅速に測定できる試薬を提供する。
いわゆる“二重標識”系類において異なる蛍光分子類
の使用に関する研究が報告されている。しかし、蛍光標
識系類は、通常、物質類の総体的な分析しか可能でな
く、かつ、高感度分析には一般には適していない。ま
た、蛍光系では、試料をU.V.で照射してその蛍光を測定
し、このことは、退色という問題を引き起こす。発蛍光
団を利用した複数分析物イムノアッセイが報告されてお
り、その中で使用した異なる標識類は、異なる波長で発
光する異なるランタナイド金属のキレート類であった。
使用したある発蛍光団で低量子収率を有していることお
よびこれらの材料類に基づく通常全てのアッセイが高レ
ベルの挙動を達成するために複雑な機器および化学を必
要としていることのために、ここで限界が生じるが、こ
のことは多くのケミルミネサンス系類の特徴である（参
考文献１）。
の使用に関する研究が報告されている。しかし、蛍光標
識系類は、通常、物質類の総体的な分析しか可能でな
く、かつ、高感度分析には一般には適していない。ま
た、蛍光系では、試料をU.V.で照射してその蛍光を測定
し、このことは、退色という問題を引き起こす。発蛍光
団を利用した複数分析物イムノアッセイが報告されてお
り、その中で使用した異なる標識類は、異なる波長で発
光する異なるランタナイド金属のキレート類であった。
使用したある発蛍光団で低量子収率を有していることお
よびこれらの材料類に基づく通常全てのアッセイが高レ
ベルの挙動を達成するために複雑な機器および化学を必
要としていることのために、ここで限界が生じるが、こ
のことは多くのケミルミネサンス系類の特徴である（参
考文献１）。
大まかに述べれば、本発明の１態様によれば、試料に
含有された複数の分析対象物質類のそれぞれのアッセ
イ、検出、定量、位置決定または分析のための方法が提
供され、これは、１種以上のそれぞれ識別可能なケミル
ミネサンス反応に関与は可能な成分類で前記物質類のそ
れぞれを標識することからなる。
含有された複数の分析対象物質類のそれぞれのアッセ
イ、検出、定量、位置決定または分析のための方法が提
供され、これは、１種以上のそれぞれ識別可能なケミル
ミネサンス反応に関与は可能な成分類で前記物質類のそ
れぞれを標識することからなる。
もうひとつの態様では、本発明は、少なくとも２種の
対象の物質類を含有する試料のアッセイ、検出、定量、
位置決定または分析とのための方法を提供し、これは、
（１）前記試料を処理し少なくとも第１および第２の複
合体類を形成し、前記第１の複合体は、第１のケミルミ
ネサンス反応に関与可能な第１試薬に結合または連結し
た前記物質類のひとつ、またはそれぞれの関連物質であ
り、前記第２の複合体は、前記第１のケミルミネサンス
反応のそれとは識別可能な発光特性を有している第２の
ケミルミネサンス反応に関与可能な第２試薬に結合また
はそうでなければ連結した前記物質類のひとつ、または
それぞれの関連物質から作製されていること、 （２）その後、前記第１および第２複合体類を含有する
試料を処理し、前記第１のおよび第２のケミルミネサン
ス反応を起こさせること、および （３）前記複数のケミルミネサンス反応のそれぞれの発
光を観察し、検出し、測定しおよび／または記録するこ
と−からなる。
対象の物質類を含有する試料のアッセイ、検出、定量、
位置決定または分析とのための方法を提供し、これは、
（１）前記試料を処理し少なくとも第１および第２の複
合体類を形成し、前記第１の複合体は、第１のケミルミ
ネサンス反応に関与可能な第１試薬に結合または連結し
た前記物質類のひとつ、またはそれぞれの関連物質であ
り、前記第２の複合体は、前記第１のケミルミネサンス
反応のそれとは識別可能な発光特性を有している第２の
ケミルミネサンス反応に関与可能な第２試薬に結合また
はそうでなければ連結した前記物質類のひとつ、または
それぞれの関連物質から作製されていること、 （２）その後、前記第１および第２複合体類を含有する
試料を処理し、前記第１のおよび第２のケミルミネサン
ス反応を起こさせること、および （３）前記複数のケミルミネサンス反応のそれぞれの発
光を観察し、検出し、測定しおよび／または記録するこ
と−からなる。
さらにもう一つの態様では、本発明はルミネサンス試
薬を提供し、この試薬は、それぞれ異なる結合相手に結
合可能またはそうでなければ連結可能な少なくとも２つ
の物質類の混合物からなり、前記物質類のひとつはそれ
ぞれ１種のケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上
の成分類で標識化されており、かつ、前記物質類のもう
ひとつは、発光特性が前記１種のケミルミネサンス反応
と識別可能なそれぞれ他のケミルミネサンス反応に関与
可能な１個以上の成分類で標識化されている。
薬を提供し、この試薬は、それぞれ異なる結合相手に結
合可能またはそうでなければ連結可能な少なくとも２つ
の物質類の混合物からなり、前記物質類のひとつはそれ
ぞれ１種のケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上
の成分類で標識化されており、かつ、前記物質類のもう
ひとつは、発光特性が前記１種のケミルミネサンス反応
と識別可能なそれぞれ他のケミルミネサンス反応に関与
可能な１個以上の成分類で標識化されている。
我々は、適切な化学操作によって発光の速度および発
光の波長の観点から異なる特性を有している異なるケミ
ルミネサンス標識が産生できること、およびこれらの異
なる標識類は分析物結合系において有効に使用でき１回
の試験操作内で２個以上の異なる分析物を実質的に同時
に定量可能であることを発見した。
光の波長の観点から異なる特性を有している異なるケミ
ルミネサンス標識が産生できること、およびこれらの異
なる標識類は分析物結合系において有効に使用でき１回
の試験操作内で２個以上の異なる分析物を実質的に同時
に定量可能であることを発見した。
ケミルミネサンス分子類の構造におけるある変化が放
出される光のスペクトルに変化を引き起こすことが公知
である。最近、光放出末端による従来の酵素イムノアッ
セイが複数成分のアッセイに使用できることが示唆され
た（参考文献２）が、但し、これがどのようにして達成
できるかは教示されていないし、または、このようなア
ッセイがどのようにして行われるのかも自明ではない。
また、この示唆を裏付けるいかなるデータもない。ルミ
ネサンス末端酵素イムノアッセイを使用することとは異
なり、発光分子類そのものが生体関連物質類に連結する
状況について相当するような示唆が全くなされていな
い。酵素変調（モジュレーション）に対してこのような
直接標識法を使用することの利点は十分に確立されてお
り、簡便性、堅固性および感度の観点から有利である。
このような系の利点がいかにして複数分析物アッセイ用
に応用されることができるのかに関する教示は全くない
し、または、このようなアッセイを行うためにどんな機
器が必要であるかなどについて自明でもない。さらに最
近になって、遺伝子操作によるバイオルミネサンス反応
のルシフェラーゼ成分の修飾（参考文献３）が、対応す
るルシフェリンの化学構造を修飾する代替えとしてこの
ような反応による発光の波長を修飾する付加的手段を構
成することが示された。
出される光のスペクトルに変化を引き起こすことが公知
である。最近、光放出末端による従来の酵素イムノアッ
セイが複数成分のアッセイに使用できることが示唆され
た（参考文献２）が、但し、これがどのようにして達成
できるかは教示されていないし、または、このようなア
ッセイがどのようにして行われるのかも自明ではない。
また、この示唆を裏付けるいかなるデータもない。ルミ
ネサンス末端酵素イムノアッセイを使用することとは異
なり、発光分子類そのものが生体関連物質類に連結する
状況について相当するような示唆が全くなされていな
い。酵素変調（モジュレーション）に対してこのような
直接標識法を使用することの利点は十分に確立されてお
り、簡便性、堅固性および感度の観点から有利である。
このような系の利点がいかにして複数分析物アッセイ用
に応用されることができるのかに関する教示は全くない
し、または、このようなアッセイを行うためにどんな機
器が必要であるかなどについて自明でもない。さらに最
近になって、遺伝子操作によるバイオルミネサンス反応
のルシフェラーゼ成分の修飾（参考文献３）が、対応す
るルシフェリンの化学構造を修飾する代替えとしてこの
ような反応による発光の波長を修飾する付加的手段を構
成することが示された。
また別の面では、一般に、化学反応条件における変化
または反応分子それ自体の構造的変化がそれらのさまざ
まな可能は反応の速度に影響を及ぼすことが公知であ
る。同様に、さらに詳細には、ケミルミネサンス反応の
キネティックスがしばしばケミルミネサンス分子によっ
て影響を受ける。例えば（参考文献4,5）、アクリジニ
ウム塩類のケミルミネサンス反応の速度はある構造的特
徴に依存することが示唆されている。同様に、酵素駆動
によるケミルミネサンス反応類は基質類の構造によって
影響を受けるらしいことが報告されている（参考文献
６）。このようなキネティックス上の相異にもとづく複
数成分アッセイの開発にこれらのキネティックス上の効
果が利用できることは教示されてもいず、また、このよ
うなアッセイがどのように構成されかつ利用されるのか
はいかなる関連技術からも自明ではない。
または反応分子それ自体の構造的変化がそれらのさまざ
まな可能は反応の速度に影響を及ぼすことが公知であ
る。同様に、さらに詳細には、ケミルミネサンス反応の
キネティックスがしばしばケミルミネサンス分子によっ
て影響を受ける。例えば（参考文献4,5）、アクリジニ
ウム塩類のケミルミネサンス反応の速度はある構造的特
徴に依存することが示唆されている。同様に、酵素駆動
によるケミルミネサンス反応類は基質類の構造によって
影響を受けるらしいことが報告されている（参考文献
６）。このようなキネティックス上の相異にもとづく複
数成分アッセイの開発にこれらのキネティックス上の効
果が利用できることは教示されてもいず、また、このよ
うなアッセイがどのように構成されかつ利用されるのか
はいかなる関連技術からも自明ではない。
本発明の非限定的態様が、アッセイ操作の具体的実施
例とともに以下に示され、添付図面を用いて説明を行
う： 図１は、本発明による典型的試験操作の発光強度対時
間を示した略グラフであり；および 図２は、ヒト性腺刺激ホルモンおよびα−フェトプロ
テインのイムノケミルミネサンスアッセイのための本発
明による操作実施例における発光強度対時間の示した略
グラフである。
例とともに以下に示され、添付図面を用いて説明を行
う： 図１は、本発明による典型的試験操作の発光強度対時
間を示した略グラフであり；および 図２は、ヒト性腺刺激ホルモンおよびα−フェトプロ
テインのイムノケミルミネサンスアッセイのための本発
明による操作実施例における発光強度対時間の示した略
グラフである。
全体的構成 ＡおよびＢは対象とする分析物でありかつそれぞれが
１個を超える抗体に結合可能であり、その結果、複数の
２サイト並発イムノアッセイが設定できる。ＡまたはＢ
と結合可能な抗体類の混合物は、試験管壁上に塗布され
る。未知量のＡおよびＢを含有する分析試料を、Ａまた
はＢの他の部位に結合可能な可溶性相補性の抗体類の混
合物ともに試験管に添加する。ＡまたはＢに特異的な可
溶性抗体類は、例えば迅速および遅延発光のように識別
可能な特徴を示すケミルミネサンス分子類で標識されて
いる。適切なインキュベーション時間後、２サイト免疫
複合体が試験管側面に形成され、この免疫複合体形成の
度合いは、存在するＡおよびＢの量に依存する。試験管
の可溶性内容物の未結合物質類を吸引で除去後、残存す
るケミルミネサンス発光を惹起させ次いでルミノメータ
で測定される。放出される光子の総数は、存在するＡお
よびＢの総数に比例する。しかし、本実施例では、Ａに
特異的な標識抗体類によるケミルミネサンス発光は１秒
以内と迅速に完了し、一方、Ｂに特異的な標識抗体類に
よる発光は、はるかに遅くかつ開始後次の19秒の間にピ
ークを経て減衰する（図１参照）。したがって、総測定
時間20秒間内における１および19秒の２つの別々の時間
帯に放出された光子の測定によって、系のキャリブレー
ションにもとづきＡおよびＢの別個の定量が可能とな
る。
１個を超える抗体に結合可能であり、その結果、複数の
２サイト並発イムノアッセイが設定できる。ＡまたはＢ
と結合可能な抗体類の混合物は、試験管壁上に塗布され
る。未知量のＡおよびＢを含有する分析試料を、Ａまた
はＢの他の部位に結合可能な可溶性相補性の抗体類の混
合物ともに試験管に添加する。ＡまたはＢに特異的な可
溶性抗体類は、例えば迅速および遅延発光のように識別
可能な特徴を示すケミルミネサンス分子類で標識されて
いる。適切なインキュベーション時間後、２サイト免疫
複合体が試験管側面に形成され、この免疫複合体形成の
度合いは、存在するＡおよびＢの量に依存する。試験管
の可溶性内容物の未結合物質類を吸引で除去後、残存す
るケミルミネサンス発光を惹起させ次いでルミノメータ
で測定される。放出される光子の総数は、存在するＡお
よびＢの総数に比例する。しかし、本実施例では、Ａに
特異的な標識抗体類によるケミルミネサンス発光は１秒
以内と迅速に完了し、一方、Ｂに特異的な標識抗体類に
よる発光は、はるかに遅くかつ開始後次の19秒の間にピ
ークを経て減衰する（図１参照）。したがって、総測定
時間20秒間内における１および19秒の２つの別々の時間
帯に放出された光子の測定によって、系のキャリブレー
ションにもとづきＡおよびＢの別個の定量が可能とな
る。
アッセイ技術および分析物 本発明による方法は、単一分析物定量技術を用いて識
別可能な生体関連の化学種を定量できる。下記の例は、
使用した結合反応の種類に関しての手引きとともに示さ
れている。このリストは例示のためにのみ示されてお
り、本発明を限定することを全く意味していない： 1.イムノアッセイ： 薬物類、、ビタミン類、ステロイド類、甲状腺ホルモ
ン類、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類、イ
ムノグロブリン類、ウィルス類、細菌類、原生動物類。
別可能な生体関連の化学種を定量できる。下記の例は、
使用した結合反応の種類に関しての手引きとともに示さ
れている。このリストは例示のためにのみ示されてお
り、本発明を限定することを全く意味していない： 1.イムノアッセイ： 薬物類、、ビタミン類、ステロイド類、甲状腺ホルモ
ン類、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類、イ
ムノグロブリン類、ウィルス類、細菌類、原生動物類。
2.タンパク質結合アッセイ： ビタミン類、補因子類、酵素阻害剤類。
3.核酸ハイブリダイゼーションアッセイ類： オリゴヌクレオチド類、ポリヌクレオチド類、DNA、R
NA、癌遺伝子類、微生物類。
NA、癌遺伝子類、微生物類。
4.レセプター結合アッセイ： プロゲストゲンレセプター類、エストロゲンレセプタ
ー類、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ
ン）レセプター類、甲状腺ホルモンレセプター類。
ー類、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ
ン）レセプター類、甲状腺ホルモンレセプター類。
ある対の分析物群がしばしば測定され、生体系のより
完全な像を得、または生体系の試験の効率を向上させ
る。このような場合、本発明によって提供される同時、
複数分析物測定が利用可能であることは、独自の利点を
有している。このような分析物群の例を下記に示した
が、しかし、本発明の限定を意味していない。
完全な像を得、または生体系の試験の効率を向上させ
る。このような場合、本発明によって提供される同時、
複数分析物測定が利用可能であることは、独自の利点を
有している。このような分析物群の例を下記に示した
が、しかし、本発明の限定を意味していない。
1.ホルモン類： チロキシン／チロトロピン、ルトロピン／フォリトロ
ピン、アドレノコルチコトロピン／コルチゾール。
ピン、アドレノコルチコトロピン／コルチゾール。
2.ビタミン類および補因子類： ビタミンB12/葉酸、1,25−ジヒドロキシコリカルシフ
ェロール/25−ヒドロキシコレカルシフェロール。
ェロール/25−ヒドロキシコレカルシフェロール。
3.核酸類（ウィルス類および微生物類由来）： ナイセリア・ゴノルホエア（Neisseria Gonorrhoea）
／クラミジア・トラコマティス（Chlamydia Trachomati
s）。
／クラミジア・トラコマティス（Chlamydia Trachomati
s）。
4.腫瘍マーカー類： 前立腺特異的抗原／前立腺酸ホスファターゼ、α−フ
ェトプロティン／癌胎児性抗原／絨毛性ゴナドトロピ
ン。
ェトプロティン／癌胎児性抗原／絨毛性ゴナドトロピ
ン。
標識類 ケミルミネサンス活性を適切な結合反応と連関させる
好適な方法は、ケミルミネサンス反応に関与できるケミ
ルミネサンス分子のような成分を、特異的標識試薬を産
生するためにその結合反応の成分類のひとつに化学的ま
たは物理的に結合させることである。本発明によるこの
ルミネサンス試薬類は、したがって、それぞれがキネテ
ィックス上および／または分光学的特性の観点から異な
る特性の標識を有する上記の標識試薬類を２個以上含有
している。これらの標識試薬類のそれぞれは、目的の結
合反応に関与するために特別の特異性を有しており、し
たがって、たとえ上記反応の２個以上が同時に起こって
いても各の目的の結合反応が別個にモニターできる。し
たがって、これらの並行結合反応類に関与する分析物を
独立してかつ同時に定量することができる。
好適な方法は、ケミルミネサンス反応に関与できるケミ
ルミネサンス分子のような成分を、特異的標識試薬を産
生するためにその結合反応の成分類のひとつに化学的ま
たは物理的に結合させることである。本発明によるこの
ルミネサンス試薬類は、したがって、それぞれがキネテ
ィックス上および／または分光学的特性の観点から異な
る特性の標識を有する上記の標識試薬類を２個以上含有
している。これらの標識試薬類のそれぞれは、目的の結
合反応に関与するために特別の特異性を有しており、し
たがって、たとえ上記反応の２個以上が同時に起こって
いても各の目的の結合反応が別個にモニターできる。し
たがって、これらの並行結合反応類に関与する分析物を
独立してかつ同時に定量することができる。
いくつかの群のケミルミネサンス分子類の異なる分子
は、キネティックスおよび／または分光学的特性の差異
を示すことができ、したがって、本発明に使用可能であ
り、アクリジニウムおよび関連化合物類類（例 フェナ
ンスリジニウム化合物類）、フタールヒドラジド類およ
び関連化合物（例ナフタールヒドラジド類）、オキザレ
ートエステル類および関連化合物類およびまた安定化ジ
オキセタン類およびジオキセタノン類を含む。このよう
な群内の化合物類のバリエーション類については平均的
に当技術者に周知であり、同様に、それらのケミルミネ
サンス反応量子収量、キネティックスおよび発光波長が
それらの構造によって影響を受けることが公知である
（上記および同様に参考文献７−11参照）。したがっ
て、本発明における使用に適し、キネティックスまたは
発光波長パラメータ類が異なる複数の化合物類の構造
は、当技術者によってそれぞれ容易に着想される。
は、キネティックスおよび／または分光学的特性の差異
を示すことができ、したがって、本発明に使用可能であ
り、アクリジニウムおよび関連化合物類類（例 フェナ
ンスリジニウム化合物類）、フタールヒドラジド類およ
び関連化合物（例ナフタールヒドラジド類）、オキザレ
ートエステル類および関連化合物類およびまた安定化ジ
オキセタン類およびジオキセタノン類を含む。このよう
な群内の化合物類のバリエーション類については平均的
に当技術者に周知であり、同様に、それらのケミルミネ
サンス反応量子収量、キネティックスおよび発光波長が
それらの構造によって影響を受けることが公知である
（上記および同様に参考文献７−11参照）。したがっ
て、本発明における使用に適し、キネティックスまたは
発光波長パラメータ類が異なる複数の化合物類の構造
は、当技術者によってそれぞれ容易に着想される。
当業者は、例えば既知の文献から、これらの化合物類
の検出の分別効率を最大にするために、高量子収率の化
合物から選択することおよび互いに対してそれらの反応
速度またはそれらの発光波長において実質的差異を有し
ている化合物類を選択することを知るであろう。アリー
ルアクリジニウムエステル類は、適切な化学修飾を行う
ことにより所望のキネティックスおよび分光学的パラメ
ータ類をもたらすための標識類として使用できる。この
ような化合物類のいくつかの例を下記に示してあり、そ
して、本発明のいかなる限定も意味していない。
の検出の分別効率を最大にするために、高量子収率の化
合物から選択することおよび互いに対してそれらの反応
速度またはそれらの発光波長において実質的差異を有し
ている化合物類を選択することを知るであろう。アリー
ルアクリジニウムエステル類は、適切な化学修飾を行う
ことにより所望のキネティックスおよび分光学的パラメ
ータ類をもたらすための標識類として使用できる。この
ような化合物類のいくつかの例を下記に示してあり、そ
して、本発明のいかなる限定も意味していない。
1.キネティックスバリエーション a.標準条件における光放出の継続＝0.8秒 b.標準条件における光放出の継続＝60秒 1a.のアクリジニウムフェニルエステルにおいて、フ
ェニル部分は電子吸引性であるＦ基によって置換されて
おり、それによって、アクリジニウムフェニルエステル
を修飾し、その結果、光の放出は、比較的に短時間に起
こる。1bのアクリジニウムフェニルエステルにおいて、
フェニル部分は電子供与性であるCH3基によって置換さ
れており、その結果、光の放出は、比較的に長時間にわ
たり起こる。他の電子供与性および吸引性基も使用でき
る。
ェニル部分は電子吸引性であるＦ基によって置換されて
おり、それによって、アクリジニウムフェニルエステル
を修飾し、その結果、光の放出は、比較的に短時間に起
こる。1bのアクリジニウムフェニルエステルにおいて、
フェニル部分は電子供与性であるCH3基によって置換さ
れており、その結果、光の放出は、比較的に長時間にわ
たり起こる。他の電子供与性および吸引性基も使用でき
る。
c.標準条件における光放出の継続（9,10−ジフェニルア
ントラセン蛍光アクセプター）＝30分 d.標準条件における光放出の継続（9,10−ジフェニルア
ントラセン蛍光）＝２分 表１は、群 の例をさらに示している。
ントラセン蛍光アクセプター）＝30分 d.標準条件における光放出の継続（9,10−ジフェニルア
ントラセン蛍光）＝２分 表１は、群 の例をさらに示している。
2.分光学的バリエーション a.発光λmax〜400nm b.発光λmax〜510nm c.発光λmax〜430nm d.発光λmax〜520nm e.発光λmax〜430nm f.発光λmax〜512nm 2bにおいて、核の電子的共役が増加して、その結果、
放出された放射線が比較的に長波長である。
放出された放射線が比較的に長波長である。
上記の例示したアクリジニウム化合物類のそれぞれに
おいて、Ｒは、適切な結合反応の成分に対する共有結合
を可能とするために選択される。適切な結合基について
はよく記載されているが、本実施例においてな分子キネ
ティックス上および／または分光学的特性の所望の特性
が維持されるようにおよびまた最終標識試薬がその結合
反応への関与能力という観点からしてまで活性であるよ
うに、選択される。このような基には、Ｎ−ヒドロキシ
サクシイミドエステル類、イミデートエステル類、イソ
チオシアナート類および他の確定された活性基類または
生体関連の分子類への結合を促進する活性基類を産生可
能な基類である。好適には、これらの基類が、適切な長
さの脂肪族鎖によってケミルミネサンス部分に連合され
る。
おいて、Ｒは、適切な結合反応の成分に対する共有結合
を可能とするために選択される。適切な結合基について
はよく記載されているが、本実施例においてな分子キネ
ティックス上および／または分光学的特性の所望の特性
が維持されるようにおよびまた最終標識試薬がその結合
反応への関与能力という観点からしてまで活性であるよ
うに、選択される。このような基には、Ｎ−ヒドロキシ
サクシイミドエステル類、イミデートエステル類、イソ
チオシアナート類および他の確定された活性基類または
生体関連の分子類への結合を促進する活性基類を産生可
能な基類である。好適には、これらの基類が、適切な長
さの脂肪族鎖によってケミルミネサンス部分に連合され
る。
さらに別の面では、蛍光アクセプター分子へのエネル
ギー移行を伴うケミルミネサンス反応を使用することも
同様に可能である。この１例として、フルオロセインに
ひとつの特異性を有する抗体およびローダミンに別の特
異性を有する抗体を標識することが可能である。これら
の抗体類は同時２サイトアッセイにおいて使用でき、そ
して、その末端は、パーオキシオキザレートケミルミネ
サンス系（過酸化水素／ビス−2,4−ジニトロフェニル
オキザレート）の導入によって定量される。放射線を伴
わないエネルギー変換が起こり、２つの異なる波長（フ
ルオロセインによる緑−黄色／ローダミンによる赤色）
の光の放出をもたらし、この発光の強度は、免疫化学反
応において結合した関連標識抗体の量に正比例してい
る。
ギー移行を伴うケミルミネサンス反応を使用することも
同様に可能である。この１例として、フルオロセインに
ひとつの特異性を有する抗体およびローダミンに別の特
異性を有する抗体を標識することが可能である。これら
の抗体類は同時２サイトアッセイにおいて使用でき、そ
して、その末端は、パーオキシオキザレートケミルミネ
サンス系（過酸化水素／ビス−2,4−ジニトロフェニル
オキザレート）の導入によって定量される。放射線を伴
わないエネルギー変換が起こり、２つの異なる波長（フ
ルオロセインによる緑−黄色／ローダミンによる赤色）
の光の放出をもたらし、この発光の強度は、免疫化学反
応において結合した関連標識抗体の量に正比例してい
る。
分析物−結合相手（試薬類）および結合反応類 下記の体系は、現在使用されている単一分析物の濃度
決定のために使用可能な結合相手または結合反応の例を
示したものである： 記号： 1a.2サイトイムノアッセイ 分析物に対してある（一定）の特異性の抗体類は、前
記の特定の分析物の異なる部分を認識し、２サイト免疫
複合体を形成させる。分析物に対して過剰濃度の試薬が
２サイト系で使用される。
決定のために使用可能な結合相手または結合反応の例を
示したものである： 記号： 1a.2サイトイムノアッセイ 分析物に対してある（一定）の特異性の抗体類は、前
記の特定の分析物の異なる部分を認識し、２サイト免疫
複合体を形成させる。分析物に対して過剰濃度の試薬が
２サイト系で使用される。
1b.競争的結合イムノアッセイ（標識付抗原） 1c.2サイト／競争的結合（標識付抗原）併用 1d.2サイト／競争的結合（標識化抗体）併用 競争的結合系においては、限定された試薬濃度が使用
されていることを銘記されたい。
されていることを銘記されたい。
2.オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
類 上記は、すべて分析物／結合相手複合体が非複合材料
から単離される不均質アッセイ系の例である。前記開示
された系類を均質アッセイに適用することも可能であ
る。
類 上記は、すべて分析物／結合相手複合体が非複合材料
から単離される不均質アッセイ系の例である。前記開示
された系類を均質アッセイに適用することも可能であ
る。
機器 光子計数機器は、光強度の測定のために使用できる。
検出機器は、識別可能なケミルミネサンス反応からの発
光を識別可能であるべきである。
検出機器は、識別可能なケミルミネサンス反応からの発
光を識別可能であるべきである。
1A キネティックス的識別 先の実施例において述べたように、本機器は、少なく
とも２つの時間枠内において光強度の測定値（好適に
は、時間当たりの光子計数として）を記録可能であり、
遅速および迅速反応類から生じる強度を無関係に測定で
きるようにするべきである。多くの例において２つのシ
グナル間に重なりがあるであろうが、時間枠と適切な選
択または前記重なりの数字的推定によって考慮に入れら
れる。
とも２つの時間枠内において光強度の測定値（好適に
は、時間当たりの光子計数として）を記録可能であり、
遅速および迅速反応類から生じる強度を無関係に測定で
きるようにするべきである。多くの例において２つのシ
グナル間に重なりがあるであろうが、時間枠と適切な選
択または前記重なりの数字的推定によって考慮に入れら
れる。
2.分光学的識別 ここでは、２種以上の波長強度を同時に測定すること
が必要である。これは、例えば、それぞれバンドパスフ
ィルターを設置した必要数の光電子増倍管を使用して他
を排除して１シグナルの測定を可能とすることによっ
て、達成される。これとは別に、単独の光電子増倍管
は、前記反応によって放出された光がまず最初に迅速ス
キャニングスペクトロメータまたはフィルター／チョッ
パー系を通過するように使用できる。光電子増倍管出力
をスキャニングまたはチョッピング周波数とシンクロナ
イズさせることで、異なる波長の独立した定量が可能と
なる。
が必要である。これは、例えば、それぞれバンドパスフ
ィルターを設置した必要数の光電子増倍管を使用して他
を排除して１シグナルの測定を可能とすることによっ
て、達成される。これとは別に、単独の光電子増倍管
は、前記反応によって放出された光がまず最初に迅速ス
キャニングスペクトロメータまたはフィルター／チョッ
パー系を通過するように使用できる。光電子増倍管出力
をスキャニングまたはチョッピング周波数とシンクロナ
イズさせることで、異なる波長の独立した定量が可能と
なる。
具体的実施例 1.標識抗体類の調製： a.ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）に対する４−（２
−カルボニルエチル）フェニル−10−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートで標
識された抗体類。
−カルボニルエチル）フェニル−10−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートで標
識された抗体類。
アクリジニウム標識は、下記のようにして合成した：
アクリジニウム−９−カルボン酸（5g）を、チオニルク
ロリド（15ml）とともに３時間、還流した。溶媒を減圧
下に除去し、生成物を無水ピリジン（35ml）中に懸濁し
た。４−ヒドロキシフェニルプロパン酸ベンジル（9nmo
l）を添加しかつ室温でこの溶液を一晩撹拌した。本混
合物を次に破砕水/1M塩酸（250ml）中に注ぎ、結果とし
て生成した沈澱物をろ過し、水で洗浄しそして減圧下に
乾燥した。このようにして得られた４−（２−ベンジル
オキシカルボニルエチル）フェニル−９−アクリジンカ
ルボキシレートをベンゼン／シクロヘキサンから再結晶
した。0.46gのこれを臭化水素／酢酸混合物（45/55w/
w、10ml）中に溶解し、かつ、本溶液を50−55℃で２時
間撹拌した。本溶液を水（100ml）中に注ぎ、結果とし
て生成した黄色固体をろ過し水で洗浄しかつ減圧下に乾
燥し、次に、アセトニトリル／クロロホルムから再結晶
し、４−（２−カルボニルエチル）フェニル−９−メチ
ルアクリジニンカルボキシレートを得た。Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミド（62mg）をジメチルホルムアミド（5m
l）中に上記アクリジンカルボキシレートとともに溶解
した。本混合物を−20℃まで冷却し、そして、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（123mg）を添加し、−20℃で
２時間、次に室温で１晩撹拌した。氷酢酸１滴を次に添
加して、本混合物をさらに30分放置した。ジシクロヘキ
シル尿素をろ過によって除去し、そして、酒精の蒸発に
よって得られた材料をベンゼン／シクロヘキサンから再
結晶し、４−（２−サクシイミジルオキシカルボニルエ
チル）フェニル−９−アクリジインカルボキシレートを
得た。本生成物（234mg）を無水クロロホルム（25ml）
中に溶解して、メチルフルオロスルホネート（0.5ml）
を添加した。室温で18時間撹拌後形成された沈澱物をろ
過して、無水ベンゼンで洗浄し、４−（２−サクシイミ
ジルオキシカルボニルエチル）フェニル−10−メチルア
クリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネ
ートを得た。ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対して作製し
たマウスモノクローナル抗体類（50μｇ）を0.15M塩化
カトリウム含有リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4、0.1
M、200μｌ）中に溶解した。上記アクリジニウムサクシ
イミジルエステル（0.5mg/ml）をアセトニトリルに溶解
し保存溶液とした。その10μｌを混合しながら上記抗体
溶液に添加した。室温で15分間、暗所でインキュベーシ
ョン後、リシン塩酸塩の上記緩衝液溶液（100μｌ、10m
g/ml）を添加しこの混合物をさらに５分間放置した。前
記混合物を、0.1％（wv）ウシ血清アルブミンおよび0.0
5％（w/v）アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水（pH
6.3、0.1M、0.01M NaCl）で平衡にしかつ溶出したファ
ルマシアセファデックス（Pharmacia Sephadex）G25−
Ｍカラム（30cm×0.6cm）にて精製した。0.5mlの分画を
採用し、そしてボイドボリューム分画類をプールし４℃
に保存した。
アクリジニウム−９−カルボン酸（5g）を、チオニルク
ロリド（15ml）とともに３時間、還流した。溶媒を減圧
下に除去し、生成物を無水ピリジン（35ml）中に懸濁し
た。４−ヒドロキシフェニルプロパン酸ベンジル（9nmo
l）を添加しかつ室温でこの溶液を一晩撹拌した。本混
合物を次に破砕水/1M塩酸（250ml）中に注ぎ、結果とし
て生成した沈澱物をろ過し、水で洗浄しそして減圧下に
乾燥した。このようにして得られた４−（２−ベンジル
オキシカルボニルエチル）フェニル−９−アクリジンカ
ルボキシレートをベンゼン／シクロヘキサンから再結晶
した。0.46gのこれを臭化水素／酢酸混合物（45/55w/
w、10ml）中に溶解し、かつ、本溶液を50−55℃で２時
間撹拌した。本溶液を水（100ml）中に注ぎ、結果とし
て生成した黄色固体をろ過し水で洗浄しかつ減圧下に乾
燥し、次に、アセトニトリル／クロロホルムから再結晶
し、４−（２−カルボニルエチル）フェニル−９−メチ
ルアクリジニンカルボキシレートを得た。Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミド（62mg）をジメチルホルムアミド（5m
l）中に上記アクリジンカルボキシレートとともに溶解
した。本混合物を−20℃まで冷却し、そして、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（123mg）を添加し、−20℃で
２時間、次に室温で１晩撹拌した。氷酢酸１滴を次に添
加して、本混合物をさらに30分放置した。ジシクロヘキ
シル尿素をろ過によって除去し、そして、酒精の蒸発に
よって得られた材料をベンゼン／シクロヘキサンから再
結晶し、４−（２−サクシイミジルオキシカルボニルエ
チル）フェニル−９−アクリジインカルボキシレートを
得た。本生成物（234mg）を無水クロロホルム（25ml）
中に溶解して、メチルフルオロスルホネート（0.5ml）
を添加した。室温で18時間撹拌後形成された沈澱物をろ
過して、無水ベンゼンで洗浄し、４−（２−サクシイミ
ジルオキシカルボニルエチル）フェニル−10−メチルア
クリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネ
ートを得た。ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対して作製し
たマウスモノクローナル抗体類（50μｇ）を0.15M塩化
カトリウム含有リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4、0.1
M、200μｌ）中に溶解した。上記アクリジニウムサクシ
イミジルエステル（0.5mg/ml）をアセトニトリルに溶解
し保存溶液とした。その10μｌを混合しながら上記抗体
溶液に添加した。室温で15分間、暗所でインキュベーシ
ョン後、リシン塩酸塩の上記緩衝液溶液（100μｌ、10m
g/ml）を添加しこの混合物をさらに５分間放置した。前
記混合物を、0.1％（wv）ウシ血清アルブミンおよび0.0
5％（w/v）アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水（pH
6.3、0.1M、0.01M NaCl）で平衡にしかつ溶出したファ
ルマシアセファデックス（Pharmacia Sephadex）G25−
Ｍカラム（30cm×0.6cm）にて精製した。0.5mlの分画を
採用し、そしてボイドボリューム分画類をプールし４℃
に保存した。
b.ヒトα−フェトプロティン（AEP）に対する４−（２
−イミジルエチル−）−2,6−ジメチル−10−メチルア
クリジニウム−９−カルボキシレートジクロリド標識抗
体類。
−イミジルエチル−）−2,6−ジメチル−10−メチルア
クリジニウム−９−カルボキシレートジクロリド標識抗
体類。
アクリジニウム標識は、下記のようにして合成した：
アクリジニウム−９−カルボン酸（2.5g）を、チオニル
クロリド（10ml）とともに３時間、還流した。本溶媒を
減圧下に除去し、生成物を無水ピリジン（25ml）中に懸
濁した。2,6−ジメチル−４−ヒドロキシフェニルプロ
ピオニトリル（1.3g）を添加しかつ室温でこの溶液を一
晩撹拌した。本混合物を次に破砕氷/1M塩酸（250ml）中
に注ぎ、かつ結果として生成した沈澱物をろ過し、水で
洗浄しそして減圧下に乾燥した。このようにして得られ
た４−（２−シアノエチル）−2,6−ジメチルフェニル
アクリジニウムカルボキシレートを無水クロロホルム
（15ml）中に溶解しかつメチルトリフルオロメチルスル
ホネート（0.5ml）を添加した。室温で１晩撹拌しかつ
ジエチルエーテル添付後形成された沈澱物をろ去し、そ
して無水ベンゼンで洗浄し、４−（２−シアノエチル）
−2,6−ジメチル−フェニル−10−メチル−９−アクリ
ジニウムカルボキシレートトリフルオロメチルスルホネ
ートを得、これを次に無水メタノール中に溶解した。
（69mg、10ml）。HC1ガスを窒素下に溶液中に通気し、
氷温度で２時間保存しかつさらに１時間放置した。形成
された結晶を乾燥窒素雰囲気下にろ過し、そして無水メ
タノールで洗浄し、４−（２−メチルオキシイミジルエ
チル）−2,6−ジメチルフェニル−10−メチルアクリジ
ニウム−９−カルボキシレートジクロリドを得た。
アクリジニウム−９−カルボン酸（2.5g）を、チオニル
クロリド（10ml）とともに３時間、還流した。本溶媒を
減圧下に除去し、生成物を無水ピリジン（25ml）中に懸
濁した。2,6−ジメチル−４−ヒドロキシフェニルプロ
ピオニトリル（1.3g）を添加しかつ室温でこの溶液を一
晩撹拌した。本混合物を次に破砕氷/1M塩酸（250ml）中
に注ぎ、かつ結果として生成した沈澱物をろ過し、水で
洗浄しそして減圧下に乾燥した。このようにして得られ
た４−（２−シアノエチル）−2,6−ジメチルフェニル
アクリジニウムカルボキシレートを無水クロロホルム
（15ml）中に溶解しかつメチルトリフルオロメチルスル
ホネート（0.5ml）を添加した。室温で１晩撹拌しかつ
ジエチルエーテル添付後形成された沈澱物をろ去し、そ
して無水ベンゼンで洗浄し、４−（２−シアノエチル）
−2,6−ジメチル−フェニル−10−メチル−９−アクリ
ジニウムカルボキシレートトリフルオロメチルスルホネ
ートを得、これを次に無水メタノール中に溶解した。
（69mg、10ml）。HC1ガスを窒素下に溶液中に通気し、
氷温度で２時間保存しかつさらに１時間放置した。形成
された結晶を乾燥窒素雰囲気下にろ過し、そして無水メ
タノールで洗浄し、４−（２−メチルオキシイミジルエ
チル）−2,6−ジメチルフェニル−10−メチルアクリジ
ニウム−９−カルボキシレートジクロリドを得た。
ヒトα−フェトプロティンに対して作製したマウスモ
ノクローナル抗体類（50μｇ）を0.15M塩化ナトリウム
含有リン酸ナトリウム緩衝液（pH9.5、0.1M、200μｌ）
中に溶解した。アセトニトリル中上記アクリジニウムサ
クシイミジルエステルをアセトニトリルに溶解し（0.5m
g/ml）保存溶液とした、その、190μｌを混合しながら
抗体溶液に添加した。室温で30分間、暗所でインキュベ
ーション後、リシン１塩酸塩の上記緩衝液溶液（100μ
ｌ、10mg/ml）を添加し、この混合物をさらに15分間放
置した。前記混合物を、上記のようにして精製した。
ノクローナル抗体類（50μｇ）を0.15M塩化ナトリウム
含有リン酸ナトリウム緩衝液（pH9.5、0.1M、200μｌ）
中に溶解した。アセトニトリル中上記アクリジニウムサ
クシイミジルエステルをアセトニトリルに溶解し（0.5m
g/ml）保存溶液とした、その、190μｌを混合しながら
抗体溶液に添加した。室温で30分間、暗所でインキュベ
ーション後、リシン１塩酸塩の上記緩衝液溶液（100μ
ｌ、10mg/ml）を添加し、この混合物をさらに15分間放
置した。前記混合物を、上記のようにして精製した。
2.固相抗体類の調製 ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびα−フェトプロティ
ンに対するモノクロナール抗体であって、上記の標識さ
れた抗体によって認識される抗原決定基とは異なる抗原
決定基をもつモノクローナル抗体類を、公知の方法を用
いて常磁性粒子に結合させた。
ンに対するモノクロナール抗体であって、上記の標識さ
れた抗体によって認識される抗原決定基とは異なる抗原
決定基をもつモノクローナル抗体類を、公知の方法を用
いて常磁性粒子に結合させた。
3.ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびヒトα−プロティン
の“同時”イムノケミルミノメトリックアッセイ 固相抗体懸濁液（800μg/ml）を等容量混合した。標
識抗体溶液（10ng/ml抗hCG、50ng/ml抗AFP）を等容量混
合した。希釈緩衝液は抗体精製緩衝液（上記）と同一で
あった。較正のための標準混合物は、公知濃度のhCGお
よびAFPを含むウマ血清中を含有する溶液で構成されて
いた。２本の12×75mmポリスチレン試験管にそれぞれ患
者血清試料50μｌを入れた。また標準試験管は、上記適
切な標準物質50μｌを用いてそれぞれ２本用意した。標
識抗体混合物100μｌを添加し、次に固相抗体混合物100
μｌを添加した。各試験管の内容物を混合し、室温で１
時間放置した洗浄溶液1ml（1.76g/1オルソリン酸二水素
ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、0.5％（w/w）アジ
化ナトリウム（sodiumaxide）、0.5％ウシ血清アルブミ
ン、１％（v/v）トリトン（Triton）Ｘ−100）を添加
後、固相の沈澱を促進するために磁気ラックに試験管を
配置した。上清をデカントし捨て、さらに洗浄緩衝液1m
lを添加後、試験管内容物を混合した。さらに沈澱／デ
カント操作を行い、そして、この試験管をルミノメータ
に配置した。
の“同時”イムノケミルミノメトリックアッセイ 固相抗体懸濁液（800μg/ml）を等容量混合した。標
識抗体溶液（10ng/ml抗hCG、50ng/ml抗AFP）を等容量混
合した。希釈緩衝液は抗体精製緩衝液（上記）と同一で
あった。較正のための標準混合物は、公知濃度のhCGお
よびAFPを含むウマ血清中を含有する溶液で構成されて
いた。２本の12×75mmポリスチレン試験管にそれぞれ患
者血清試料50μｌを入れた。また標準試験管は、上記適
切な標準物質50μｌを用いてそれぞれ２本用意した。標
識抗体混合物100μｌを添加し、次に固相抗体混合物100
μｌを添加した。各試験管の内容物を混合し、室温で１
時間放置した洗浄溶液1ml（1.76g/1オルソリン酸二水素
ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、0.5％（w/w）アジ
化ナトリウム（sodiumaxide）、0.5％ウシ血清アルブミ
ン、１％（v/v）トリトン（Triton）Ｘ−100）を添加
後、固相の沈澱を促進するために磁気ラックに試験管を
配置した。上清をデカントし捨て、さらに洗浄緩衝液1m
lを添加後、試験管内容物を混合した。さらに沈澱／デ
カント操作を行い、そして、この試験管をルミノメータ
に配置した。
4.光強度の測定 光放出の測定は、製造業者推奨の操作を用いてチバコ
ーニングマジックライトアナライザー（Chiba Corning
Magic Lite Analyzer）中で行った。ソフトウェアを操
作して、時間に対して光強度を明確に連続的に積分でき
た。それぞれhCGおよびAFP抗体類による光放出に対応し
それによって試料中のhCGおよびAFP濃度に０−１および
１−２秒の範囲で分離積分を行った。AFPシグナルによ
るhCGシグナルの干渉によって一部重なりがあったの
で、補正が必要であった。このことは、図２でわかるよ
うに、あらかじめ測定した０−１秒間の積分に対する２
秒時の光強度の関係を用いて、０−１秒積分に対するAF
P寄与を推定することによって、達成された。
ーニングマジックライトアナライザー（Chiba Corning
Magic Lite Analyzer）中で行った。ソフトウェアを操
作して、時間に対して光強度を明確に連続的に積分でき
た。それぞれhCGおよびAFP抗体類による光放出に対応し
それによって試料中のhCGおよびAFP濃度に０−１および
１−２秒の範囲で分離積分を行った。AFPシグナルによ
るhCGシグナルの干渉によって一部重なりがあったの
で、補正が必要であった。このことは、図２でわかるよ
うに、あらかじめ測定した０−１秒間の積分に対する２
秒時の光強度の関係を用いて、０−１秒積分に対するAF
P寄与を推定することによって、達成された。
［hCG］》［AFP］であるとき、第二時間帯における残
留hCGシグナルは有意に寄与し、したがって、ｘの測定
を変動させた。このことは実際には問題ではなく、例え
ば標識抗体類の特異的活性の操作によって、相対的アッ
セイ最適化によって最小とすることができた。
留hCGシグナルは有意に寄与し、したがって、ｘの測定
を変動させた。このことは実際には問題ではなく、例え
ば標識抗体類の特異的活性の操作によって、相対的アッ
セイ最適化によって最小とすることができた。
相対濃度が極端である場合でさえも正確さが必要であ
る状況においては、繰り返しまたは同時等式計算が可能
なより複雑なソフトウェアを使用することによって、相
互の重なりを明確にする。
る状況においては、繰り返しまたは同時等式計算が可能
なより複雑なソフトウェアを使用することによって、相
互の重なりを明確にする。
重なりが重大な問題である場合、それらの相対的キネ
ティックスにおける特性に大きな差異を生じる代替え標
識類を検索しなければならない。
ティックスにおける特性に大きな差異を生じる代替え標
識類を検索しなければならない。
参考文献類 1.I.Hemmil,S.Holttinen,K.Pettersson,T.Lvgren,
クリニカルケミストリ（Chinical Chemistry）33（198
7）2281 2.B.Edwards,A.Sparks,J.C.Voyta,I.Bronsteinジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）５（1990）１ 3.K.V.Wood,Y.A.Lam,W.D.McElroy,H.H.Seligerジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）４（1989）31 4.F.McCapra,アカウンツ・オブ・ケミカルリサーチ（Ac
counts of Chemical Research）９（1976）201 5.F.McCapraら，ジャーナル・オブ・バイオルミネサン
ス・エンド・ケミルミネサンス（Journal of Biolumine
scence and Chemiluminescence）４（1989）51 6.B.Edwards,A.Sparks,J.C.Voyta,I.Bronsteinジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）５（1990）１ 7.M.M.Rauhut,L.J.Ballyky,B.G.Robertsら，ジャーナル
・オブ・ザ・アメリカンケミカルソサイアティ（Journa
l of the American Chemical Society）89（1967）651
5。
クリニカルケミストリ（Chinical Chemistry）33（198
7）2281 2.B.Edwards,A.Sparks,J.C.Voyta,I.Bronsteinジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）５（1990）１ 3.K.V.Wood,Y.A.Lam,W.D.McElroy,H.H.Seligerジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）４（1989）31 4.F.McCapra,アカウンツ・オブ・ケミカルリサーチ（Ac
counts of Chemical Research）９（1976）201 5.F.McCapraら，ジャーナル・オブ・バイオルミネサン
ス・エンド・ケミルミネサンス（Journal of Biolumine
scence and Chemiluminescence）４（1989）51 6.B.Edwards,A.Sparks,J.C.Voyta,I.Bronsteinジャーナ
ル・オブ・バイオルミネサンス・エンド・ケミルミネサ
ンス（Journal of Bioluminescence and Chemiluminesc
ence）５（1990）１ 7.M.M.Rauhut,L.J.Ballyky,B.G.Robertsら，ジャーナル
・オブ・ザ・アメリカンケミカルソサイアティ（Journa
l of the American Chemical Society）89（1967）651
5。
8.K.D.Gundermann,トピックス・イン・カラントケミス
トリ（Topics in Current Chemistry）46（1974）61 9.米国特許第3689391号（Ullman）。
トリ（Topics in Current Chemistry）46（1974）61 9.米国特許第3689391号（Ullman）。
10.米国特許第4277437号（Maggio）。
11.米国特許第3817837号（Rubenstein）。
上記に述べた対象は、本文で参考として引用してい
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウッドヘッド、ジェームス、スチュアー ト イギリス国 ラグラン エヌピー５ ２ エルディ ウォーレイジ ロード スト ーンウォール コテージ （番地なし) (72)発明者 ウィークス、イアン イギリス国 カーディフ シーエフ３ ９ディジェイ ペニーラン ラヴェンス コート クロース 13 (56)参考文献 特開 昭57−19661（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−146155（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−35371（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/532,21/76
Claims (29)
- 【請求項１】液体試験試料中の２個以上の個々の分析物
の特異的結合測定方法において： ａ）前記試料を、それぞれ特異的標識を持つ２種以上の
試薬と接触させ、前記各試薬が、 ｉ）個々の分析物と特異的結合対を形成する部分、及び ii）少なくとも１つの標識された前記特異的結合対を形
成するために、前記部分と共有結合または非共有結合で
接合された、異なる特異的の発光性標識を持ち、 ｂ）各前記の標識された特異的結合対を、前記標識を持
つ試薬から物理的または化学的に区別し、 ｃ）各前記分析物の存在または量の尺度として、標識さ
れた特異的結合対から発光を、発生させかつ測定するか
らなり、 標識類の各々が、少なくともひとつの別の前記標識類か
ら識別可能な放出極大をもって発光するか、或いは前記
発光の発生後の識別可能な時間においてピークエネルギ
ーを放出すること、 を特徴とする前記結合測定方法。 - 【請求項２】前記標識類の少なくともひとつが、アクリ
ジニウム化合物類、フェナントリジウム化合物類、フタ
ールヒドラジド類、オキザレートエステル類、ジオキセ
タン類、及びジオキセタノン類から成る群から選ばれる
ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記標識類から光が放出される前に、少な
くともひとつの標識類がアクリドンを形成することを特
徴とする請求の範囲第２に記載の方法。 - 【請求項４】前記標識類の少なくともひとつが、アリー
ルアクリジニウムエステルであることを特徴とする請求
の範囲第２に記載の方法。 - 【請求項５】光の放出が前記識別可能な時間にわたって
起こすように、少なくともひとつの前記標識のアリール
環が、電子求引基及び電子供与基から成る群から無関係
に別々に選ばれる化学基でひとつ以上の位置において置
換されていることを特徴とする請求の範囲第４項に記載
の方法。 - 【請求項６】光の放出が前記識別可能な時間にわたって
起こるように、少なくともひとつの前記標識のアクリジ
ニウム環が電子求引基及び電子共与基のから成る群から
無関係に別々に選ばれる化学基でひとつ以上の位置にお
いて置換されていることを特徴とする請求の範囲第４項
に記載の方法。 - 【請求項７】前記電子求引基が、ハロゲンであることを
特徴とする請求項の範囲第５項または第６項に記載の方
法。 - 【請求項８】前記電子共与基が、メチル基及びメトキシ
基から成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲
第５項または第６項に記載の方法。 - 【請求項９】前記標識類の少なくともひとつが、必要に
応じて置換されたジフェニルアントラセンであることを
特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記標識類の少なくともひとつが、別の
分子からのエネルギー移動により光を放出できる蛍光性
分子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の
方法。 - 【請求項１１】前記特異的の結合相手が、ホルモン類、
ビタミン類、補因子類、核酸類、抗原類、抗体類、ハプ
テン類、配位子類、酵素類、及び酵素基質類から成る群
から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項、第４
項、第５項、または第６項に記載の方法。 - 【請求項１２】前記異なる特定の標識された特異的結合
対の少なくとも２つに含まれる標識類が、実質的に同時
に光を放出するようにしたことを特徴とする請求の範囲
第１項、第４項、第５項、または第６項に記載の方法。 - 【請求項１３】前記標識された特異的結合対から放出さ
れる光の強度が、異なる時間的期間にわたって検出さ
れ、この異なる時間的期間が前記検出の開始点と前記発
光の期間に関して重複してもよいことを特徴とする請求
の範囲第１項または第４項に記載の方法。 - 【請求項１４】少なくとも２つの前記標識された特異的
な結合対から放出される光が、異なる波長領域にわたっ
て検出されることを特徴とする請求の範囲第１項または
第４項に記載の方法。 - 【請求項１５】前記試料を少なくとも３つの特異的な標
識された試薬と接触させる、少なくとも２つの前記試薬
に接合された標識類によって放出される光が、異なる波
長領域にわたる検出によって識別可能であり、かつ時間
全体にわたる光の強度の変化によって識別可能であるこ
とを特徴とする請求の範囲第１項または第４項に記載の
方法。 - 【請求項１６】前記発光が異なる光濾過手段によって異
なる波長領域にわたって濾過され、濾過された光を検出
することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１７】前記異なる標識類の第１の標識が、電子
求引基で置換されたアクリジニウムエステルであり、か
つ前記異なる標識類の第２の標識が、電子供与基で置換
されたアクリジニウムエステルであり、そして前記標識
からの発光が同時誘発のとき、前記第１標識からの発光
が、前記第２標識からの発光を上回る時間にわたって起
こり、発光が前記識別可能な時間にわたって起こるよう
に前記基が選択されることを特徴とする請求の範囲第４
項に記載の方法。 - 【請求項１８】前記標識類からの発光誘発のとき、前記
異なる標識類の第１の標識が、第１の波長で光を放出す
るアクリジニウムエステルであり、かつ前記異なる標識
類の第２の標識が、前記第１の標識よりも大きい電子共
役度を持つアクリジニウムエステルであって、第１の波
長よりも長い第２の波長で発光することを特徴とする請
求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項１９】前記第１標識が400から500nmまでの波長
領域に発光極大をもち、かつ前記第２標識が500から700
nmまでの波長領域に発光極大をもつことを特徴とする請
求の範囲第18項に記載の方法。 - 【請求項２０】前記標識がそれぞれ前記特異的の結合相
手共有結合または非共有結合で接合することを特徴とす
る請求の範囲第１項または第４項に記載の方法。 - 【請求項２１】前記異なる標識類の２つ以上が、それぞ
れアリールアクリジニウムエステルであることを特徴と
する請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項２２】前記特異的に標識された特異的の結合対
が、イムノアッセイ結合反応、レセプター結合反応及び
核酸ハイブリダイゼーション反応から成る群から選ばれ
る相互作用によって特異的の結合相手と結合された分析
物から成ることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の
方法。 - 【請求項２３】前記特定の標識された試薬の少なくとも
２つが、それぞれ化学ルミネセンス型標識から成ること
を特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２４】それぞれ特異的標識を持った２個以上の
試薬を用いる、試験試料中の２種以上の分析物の検出用
キットにおいて、前記各試薬が、 （ｉ）個々の分析物と特異的に結合対を形成する部分、
及び （ii）前記結合対の部分に接合され、前記標識からの光
の放出によって検出可能である異なる特異的標識を持
ち、 標識類の各々は、別個でかつ明瞭な放出で発光するか、
或いは前記発光の発生後に別個でかつ明瞭な時間枠内で
前記標識類の少なくとも別の１つからピークエネルギー
を放出するものであり、前記試薬類を、前記分析物を含
む試験試料と接触させ、各前記分析物の存在または量を
発光の開始後に測定すること、 を特徴とする分析物の検出用キット。 - 【請求項２５】前記標識類の各々が、アクリジニウム化
合物類、フェナントリジウム化合物類、フタールヒドラ
ジド類、オキザレートエステル類、ジオキセタン類及び
ジオキセタノン類から成る群から選ばれることを特徴と
する請求の範囲第24項に記載のキット。 - 【請求項２６】前記異なる標識類の２つの以上がアリー
ルアクリジニウムエステルであることを特徴とする請求
の範囲第25項に記載のキット。 - 【請求項２７】前記結合対要素が、核酸及びタンパク質
から成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第
24項に記載のキット。 - 【請求項２８】前記異なる標識類の第１の標識が、電子
求引基で置換されたアクリジニウムエステルであり、か
つ前記異なる標識類の第２の標識が、電子供与基で置換
されたアクリジニウムエステルであり、そして前記標識
類からの発光が同時誘発のとき、前記第１標識からの発
光が、前記第２の標識からの発光を上回る時間にわたっ
て起こり、発光が前記識別可能な時間にわたって起こる
ように前記基が選択されることを特徴とする請求の範囲
第26項に記載のキット。 - 【請求項２９】前記標識類からの発光の誘発のとき、前
記異なる標識類の第１の標識が、第１波長で光を放出す
るアクリジニウムエステルであり、かつ前記異なる標識
類の第２標識が、前記第１標識よりも大きい電子共役度
を持つアクリジニウムエステルであって、第１波長より
も長い第２波長で発光することを特徴とする請求の範囲
第24項に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8914563A GB2233450B (en) | 1989-06-24 | 1989-06-24 | Detecting or quantifing multiple analytes with luminescent reagents |
| GB8914563.5 | 1989-06-24 | ||
| PCT/GB1990/000957 WO1991000511A1 (en) | 1989-06-24 | 1990-06-21 | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506403A JPH04506403A (ja) | 1992-11-05 |
| JP3021038B2 true JP3021038B2 (ja) | 2000-03-15 |
Family
ID=10659023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2509047A Expired - Lifetime JP3021038B2 (ja) | 1989-06-24 | 1990-06-21 | 標識技術を用いた複数分析物の検出または定量 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0478626B2 (ja) |
| JP (1) | JP3021038B2 (ja) |
| AT (1) | ATE133257T1 (ja) |
| DE (1) | DE69024955T3 (ja) |
| DK (1) | DK0478626T3 (ja) |
| ES (1) | ES2081991T3 (ja) |
| GB (1) | GB2233450B (ja) |
| WO (1) | WO1991000511A1 (ja) |
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1990
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