DE4304728C2

DE4304728C2 - Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Proben

Info

Publication number: DE4304728C2
Application number: DE19934304728
Authority: DE
Inventors: Igor Dr Popov; Gudrun Dr Lewin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-02-13
Filing date: 1993-02-13
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2013-02-14
Also published as: DE4304728A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in biologischen. Proben, wie Körperflüssigkeiten, Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten.

Ascorbinsäure stellt ein wasserlösliches Vitamin von großer physiologischer Bedeutung dar. Ein Mangel an Vitamin C führt zu einer abnormen Entwicklung von Bindegewebsstrukturen, zu Kapil lardefekten oder - als klinisches Bild einer klassischen C- Avitaminose - zu Skorbut. Am häufigsten sind jedoch präskorbutische Zustände anzutreffen, wie rasche Ermüdbarkeit, Appetitlosigkeit oder eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen. Der tägliche Vitamin-C-Bedarf eines erwachsenen Menschen beträgt einer WHO-Richtlinie zufolge 75 mg ("Die enzymatische Lebensmit telanalytik", boehringer mannheim, Heft 7, S. 4).

Aber auch zu prophylaktischen und therapeutischen Zwecken werden hohe Dosen an Vitamin C verabreicht, zumal die Mengen an Ascorbinsäure, die im Körper nicht verstoffwechselt werden, über den Harn ausgeschieden werden. Daher sind Ascorbinsäurebestim mungen in Körperflüssigkeiten von erheblichem diagnostischen Interesse.

Bestimmungsverfahren für Ascorbinsäure sind in großer Zahl bekannt. Die Verfahren betreffen die Messung des Ascorbinsäuregehaltes sowohl in Lebensmitteln als auch in Körperflüssigkeiten (Übersichten: Methods Biochem. Analy. 1, 1960, S. 115; J. Schormüller: Die Bestandteile der Lebensmittel, Springer-Verlag 1965, S. 1024-1025; DE 27 37 289, S. 2).

Iwata, T., et al. (J. Chromatogr. 344 (1985), 351-355) beschreiben eine HPLC-Methode mit Hilfe eines Fluoreszenz-Detektors zur Bestimmung von Ascorbinsäure in menschlichem Serum: Durch die Reaktion von Dehydroascorbinsäure mit 1,2-Diamino-4,5-Dimethoxybenzen entsteht ein hoch-fluoreszierendes Produkt.

Eine Methode zur simultanen Bestimmung von wasserlöslichen Vitaminen, die auf der Ionenpaarchromatographie und der Fluorometrie beruht, wird von der Firma Pharmaceutical Co., Ltd. (JP 62-58116 A2) vorgeschlagen.

Neuere Testsysteme bestehen darin, daß Phosphormolybdatsalze in Gegenwart von Ascorbinsäure zu Molybdänblau reduziert werden und die Farbänderung gemessen wird (DE 23 09 794, DE 29 26 068, US-PS 3771 964) oder bestimmte Farbstoffe durch Reduktion entfärbt werden (DE 28 34 743). Die enzymatische Bestimmung von Ascorbinsäure beruht auf der Umsetzung zu Dehydroascorbinsäure in Gegenwart des Enzyms Ascorbatoxidase und a) Messen der Sauer stoffkonzentration (DE 28 24 694) oder b) Umsetzung der Dehydroascorbinsäure mit einer Kupplungskomponente, wie Phenylendiamine (DE 27 37 289).

Den beschriebenen Verfahren haften eine Reihe von Mängeln an, z. B.

- Störanfälligkeit wegen reduzierender Beimischungen
- Langwierigkeit (Inkubation in Gegenwart eines Enzyms)
- unzureichende Stabilität (ubiquitäres Problem der Enzymologie)
- schlechte Genauigkeit (Farbstoffbildung ist zeit- und temperaturabhängig)
- geringe Empfindlichkeit (photometrischer Nachweis).

Die photochemoluminometrische Bestimmung von Vitamin C ist nicht beschrieben worden.

Bio- und Chemolumineszenzanalysen sowie Geräte zur Durchführung dieser Meßmethoden sind in einer Reihe von Patentschriften beschrieben worden, z. B. zur Bestimmung schwefelhaltiger Verbindungen (US-PS 4352 779), der oxidativen Stabilität von Polymeren (US-PS 4350 495), von Peroxidase in einem Lumineszenz- oder luminometrischen Assay (DE 35 28 391), von Proteinen, Hormonen, Arzneimitteln oder Viren mit Hilfe von Immunoassays (US-PS 4604 364), von Verbindungen mit primären Aminogruppen (US-PS 4758 520), von chimären Proteinen (WO 89/09393), von Analyten, die mit anderen, zur Teilnahmen an Chemolumineszenz-Reaktionen befähigten Molekülen, z. B. Dioxetanen, verbunden sind (WO 88/00695; US-PS 4978 614; DE 39 21 609; WO 91/00511; WO 91/01492) oder von Spuren (Nanogrammbereich) von N-Nitroso verbindungen (US-PS 5094 815).

Bekannt ist ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Körper flüssigkeiten mit Hilfe der Photochemolumineszenz (DD-PS 3 00 328). In der DD-PS 2 49 618, war ein Verfahren beschrieben worden, nach dem sich die antiradikale Aktivität von einigen Stoffen photochemoluminometrisch quantifizieren lädt. Es beruht auf dem Phänomen des Leuchtens (Chemolumineszenz), das die Reaktion zwischen photochemisch erzeugten Superoxidradikalen und Luminol begleitet. Dabei wird die Dauer der durch Radikalfänger bedingten Chemolumineszenzhemmung gemessen. Das dazu verwendete Photochemoluminometer besteht nach DD-PS 2 49 618 aus einer reinen Lichtquelle, einer Bestrahlungsküvette, einem Chemoluminometer mit einer Durchflußküvette (modifiziert nach DD-PS 2 13 997) und einer Mikroschlauchpumpe für die Überführung der bestrahlten Lösung in die Meßküvette. Die Latenzdauer (Lagphase) der Photochemolumineszenz (PCL) ist proportional der Menge der in die Lösung gegebenen antiradikalisch wirkenden nichtenzymatischen Substanzen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Ascorbinsäure zu entwickeln.

Im Photochemolumineszenz(PCL)-Meßsystem können zwar Radikalfän ger, wie z. B. Harnsäure, als reine Substanz quantifiziert werden (DD-PS 3 00 328), für das klinisch relevante Vitamin C war eine Bestimmung in Gemischen, wie z. B. im Blutplasma, wegen der interferierenden Wirkungen mit anderen Radikalfängern nicht möglich. Dabei standen folgende Hindernisse im Vordergrund:

1. der geringe Anteil der Ascorbinsäure an der gesamten antiradikalen Kapazität des Blutplasmas. Nach der selektiven Entfernung der Harnsäure mit Hilfe von Uratoxidase enthält die für die Messung notwendige Materialmenge soviel Proteine, die die Chemolumineszenz hemmen, daß eine direkte Messung nicht gelingt;
2. die zu geringe Differenz der Molekulargewichte von Harnsäure und von Ascorbinsäure. Der Versuch, mit Hilfe der Gelchromatographie das Material in mehrere Fraktionen der einzelnen Stoffe zu trennen, bringt keinen Erfolg, da die Molekulargewichte der Harnsäure (168) und der Ascorbinsäure (176) zu dicht beieinander liegen;
3. der Angriff der Uratoxidase auch auf die Ascorbinsäure. Zwar können die schwereren Proteine entfernt werden, doch während der nachfolgenden Anwendung der Uratoxidase werden beträchtliche, unkontrollierbare Mengen der Ascorbinsäure auto- bzw. mitoxidiert.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Testbesteck zu entwickeln, das zur Bestimmung der Ascorbinsäure in biologischen Proben geeignet ist.

Die Aufgaben der Erfindung wurden dadurch gelöst, daß die störende Wirkung von Proteinen durch vorhergehende Fraktionierung des zu untersuchenden Materials mit Hilfe der Gelchromatographie beseitigt und der Großteil des Wassers, etwa 90%, in der Reagenzpufferlösung durch ein organisches wasserlösliches Lösungsmittel ersetzt wird.

Das Testbesteck zur Bestimmung der Ascorbinsäure beseht aus einem organischen wasserlöslichen Lösungsmittel, einer 0,2 molaren Karbonatlösung und aus Luminol. Als Karbonat findet vorzugsweise Natriumkarbonat und als organisches Lösungsmittel vorzugsweise Methanol, das Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält, Verwendung. Zu dieser Lösung wird ein Eluat gegeben, das aus der zu untersuchenden Probe nach Durchlauf einer Entsalzungssäule und Eluierung mit PBS - Phosphate Buffer Saline - gewonnen wird.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die Lösung des Problems des gleichzeitigen Vorhandenseins von Ascorbinsäure neben Harnsäure darin liegt, daß ein Teil des Wassers im Reagenzpuffer durch ein organisches wasserlösliches Lösungsmittel ersetzt wird. In diesem System zeigen beide Säuren qualitativ unterschiedliches Verhalten: Die Ascorbinsäure ist durch eine typische Lag-Phase der Photochemolumineszenz gekennzeichnet. Nur sie zeigt die typische Lag-Phase der PCL, die Harnsäure dagegen nicht; sie hemmt lediglich die Intensität der PCL.

Ebenfalls überraschend kommt dazu, daß bei Verwendung geeigneter Entsalzungssäulen sich die Peaks der beiden Säuren nur geringfügig überschneiden, so daß der Einfluß der Harnsäure auf die Genauigkeit der Vitamin-C-Bestimmung vernachlässigt werden kann.

In der im PCL-Meßsystem zu untersuchenden Probe wird die Dauer der Lag-Phase mit einer Eichkurve (Fig. 1) verglichen.

Das Ergebnis entspricht direkt der Konzentration der Ascorbinsäure in der zu untersuchenden Probe, z. B. im Blutplasma, mit einem Umrechnungsfaktor für das Gesamtvolumen des Eluats, das sich auf das selbe Plasma bezieht.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

1 ml Blutplasma wird in einer Entsalzungssäule der Firma Bio-Rad mit PBS-Lösung eluiert. 100 mkl des Eluats werden nach Durchlauf von 8 ml des Eluents im PCL-Meßsystem untersucht und die Dauer der Lag-Phase mit einer Eichkurve (Fig. 1) verglichen.

Das Ergebnis entspricht direkt der Konzentration der Ascorbinsäure im Blutplasma mit einem Umrechnungsfaktor für das Gesamtvolumen des Eluats, das dem selben Plasma entspricht.

Beispiel 2

Ein Gewebestückchen von 100 mg, z. B. aus der Leberbiopsie, wird in 1 ml PBS homogenisiert und anschließend bei 10000 g 10 Minuten zentrifugiert (bzw. filtriert).

Der Überstand wird nach der Eiweißfällung bzw. Säulenchromatogra phie (s. oben) direkt für die Messung verwendet.

Das notwendige Volumen ist gewebeartabhängig und wird nach einer orientierenden Messung von 10 mkl präzisiert (Volumenerhöhung bzw. Verdünnung).

Beispiel 3

Das Testbesteck besteht aus 6 Flaschen:
1 mal 40 ml 0,2 M Karbonatlösung
1 mal 50 ml Methanol p.a. mit einem pH-Wert von 10,8 durch Zugabe von 10 mg EDTA
4 mal 2 ml Luminollösung (3 mmol/l) in schwarzen Fläschchen (die Portionierung und die Abdunkelung sind wegen der hohen Lichtempfindlichkeit erforderlich).

Der gesamte Meßvorgang wird folgendermaßen gestaltet:
2,2 ml der Methanollösung werden mit 200 mkl Puffer vermischt und 100 mkl der Probe (beim Leerwert reine PBS-Lösung) zugegeben.

Anschließend werden 25 mkl der Luminollösung eingespritzt, und das Gemisch wird in das Photochemoluminometer gegeben.

Nach der Messung wird das Gerät 2mal mit Aquabidest und 1 mal mit 1 ml reinem Methanol gespült.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in biologischen Proben mit Hilfe der Messung ihrer antiradikalen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Photochemolumineszenz(PGL)-Meßsystem eine zu untersuchende Probe gelchromatographisch fraktioniert und der Großteil des Wassers durch ein organisches wasserlösliches Lösungsmittel ersetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe aus Körperflüssigkeiten, wie Blutplasma, aus Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten und das organische Lösungsmittel aus einem niederen Alkohol, vorzugsweise aus Methanol, besteht.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Blutplasma in einer Entsalzungssäule mit PBS-(Phosphate Buffer Saline)-Lösung eluiert, das Eluat im PCL-Meßsystem untersucht und die Dauer der Lag-Phase mit einer Eichkurve verglichen wird.

4. Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in biologischen Proben mit Hilfe eines Photochemolumi neszenz(PCL)-Meßsystems, bestehend aus Photosensibilisator, basischer Pufferlösung und einen Hilfsstoff enthaltenden wasserlöslichem organischen Lösungsmittel.

5. Testbesteck nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die biologische Probe aus Körperflüssigkeiten, z. B. Blutserum, Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten besteht.

6. Testbesteck nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Luminollösung, einer Karbonatlösung und Dinatriumethy lendiamintetraacetat (EDTA) enthaltendes Methanol besteht.

7. Testbesteck nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeich net, daß es aus Luminollösungen mit 3 mmol/l Luminol, 0,2 molarer Karbonatlösung und EDTA enthaltendes Methanol mit einem pH-Wert von 10,8 besteht.