DE4304728C2 - Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen Proben - Google Patents
Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure in biologischen ProbenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testbesteck zur
Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in biologischen. Proben,
wie Körperflüssigkeiten, Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten.
Ascorbinsäure stellt ein wasserlösliches Vitamin von großer
physiologischer Bedeutung dar. Ein Mangel an Vitamin C führt zu
einer abnormen Entwicklung von Bindegewebsstrukturen, zu Kapil
lardefekten oder - als klinisches Bild einer klassischen C-
Avitaminose - zu Skorbut. Am häufigsten sind jedoch
präskorbutische Zustände anzutreffen, wie rasche Ermüdbarkeit,
Appetitlosigkeit oder eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen.
Der tägliche Vitamin-C-Bedarf eines erwachsenen Menschen beträgt
einer WHO-Richtlinie zufolge 75 mg ("Die enzymatische Lebensmit
telanalytik", boehringer mannheim, Heft 7, S. 4).
Aber auch zu prophylaktischen und therapeutischen Zwecken werden
hohe Dosen an Vitamin C verabreicht, zumal die Mengen an
Ascorbinsäure, die im Körper nicht verstoffwechselt werden, über
den Harn ausgeschieden werden. Daher sind Ascorbinsäurebestim
mungen in Körperflüssigkeiten von erheblichem diagnostischen
Interesse.
Bestimmungsverfahren für Ascorbinsäure sind in großer Zahl
bekannt. Die Verfahren betreffen die Messung des
Ascorbinsäuregehaltes sowohl in Lebensmitteln als auch in
Körperflüssigkeiten (Übersichten: Methods Biochem. Analy. 1,
1960, S. 115; J. Schormüller: Die Bestandteile der Lebensmittel,
Springer-Verlag 1965, S. 1024-1025; DE 27 37 289, S. 2).
Iwata, T., et al. (J. Chromatogr. 344 (1985), 351-355) beschreiben eine HPLC-Methode mit
Hilfe eines Fluoreszenz-Detektors zur Bestimmung von Ascorbinsäure in menschlichem Serum:
Durch die Reaktion von Dehydroascorbinsäure mit 1,2-Diamino-4,5-Dimethoxybenzen entsteht
ein hoch-fluoreszierendes Produkt.
Eine Methode zur simultanen Bestimmung von wasserlöslichen Vitaminen, die auf der
Ionenpaarchromatographie und der Fluorometrie beruht, wird von der Firma Pharmaceutical
Co., Ltd. (JP 62-58116 A2) vorgeschlagen.
Neuere Testsysteme bestehen darin, daß Phosphormolybdatsalze in
Gegenwart von Ascorbinsäure zu Molybdänblau reduziert werden und
die Farbänderung gemessen wird (DE 23 09 794, DE 29 26 068, US-PS
3771 964) oder bestimmte Farbstoffe durch Reduktion entfärbt
werden (DE 28 34 743). Die enzymatische Bestimmung von
Ascorbinsäure beruht auf der Umsetzung zu Dehydroascorbinsäure in
Gegenwart des Enzyms Ascorbatoxidase und a) Messen der Sauer
stoffkonzentration (DE 28 24 694) oder b) Umsetzung der
Dehydroascorbinsäure mit einer Kupplungskomponente, wie
Phenylendiamine (DE 27 37 289).
Den beschriebenen Verfahren haften eine Reihe von Mängeln an,
z. B.
- - Störanfälligkeit wegen reduzierender Beimischungen
- - Langwierigkeit (Inkubation in Gegenwart eines Enzyms)
- - unzureichende Stabilität (ubiquitäres Problem der Enzymologie)
- - schlechte Genauigkeit (Farbstoffbildung ist zeit- und temperaturabhängig)
- - geringe Empfindlichkeit (photometrischer Nachweis).
Die photochemoluminometrische Bestimmung von Vitamin C ist nicht
beschrieben worden.
Bio- und Chemolumineszenzanalysen sowie Geräte zur Durchführung
dieser Meßmethoden sind in einer Reihe von Patentschriften
beschrieben worden, z. B. zur Bestimmung schwefelhaltiger
Verbindungen (US-PS 4352 779), der oxidativen Stabilität
von Polymeren (US-PS 4350 495), von Peroxidase in einem
Lumineszenz- oder luminometrischen Assay (DE 35 28 391), von
Proteinen, Hormonen, Arzneimitteln oder Viren mit Hilfe von
Immunoassays (US-PS 4604 364), von Verbindungen mit
primären Aminogruppen (US-PS 4758 520), von chimären
Proteinen (WO 89/09393), von Analyten, die mit anderen, zur
Teilnahmen an Chemolumineszenz-Reaktionen befähigten Molekülen,
z. B. Dioxetanen, verbunden sind (WO 88/00695; US-PS
4978 614; DE 39 21 609; WO 91/00511; WO
91/01492) oder von Spuren (Nanogrammbereich) von N-Nitroso
verbindungen (US-PS 5094 815).
Bekannt ist ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure in Körper
flüssigkeiten mit Hilfe der Photochemolumineszenz (DD-PS 3 00 328).
In der DD-PS 2 49 618, war ein Verfahren beschrieben
worden, nach dem sich die antiradikale Aktivität von einigen
Stoffen photochemoluminometrisch quantifizieren lädt. Es beruht
auf dem Phänomen des Leuchtens (Chemolumineszenz), das die
Reaktion zwischen photochemisch erzeugten Superoxidradikalen und
Luminol begleitet. Dabei wird die Dauer der durch Radikalfänger
bedingten Chemolumineszenzhemmung gemessen. Das dazu verwendete
Photochemoluminometer besteht nach DD-PS 2 49 618 aus einer reinen
Lichtquelle, einer Bestrahlungsküvette, einem Chemoluminometer
mit einer Durchflußküvette (modifiziert nach DD-PS 2 13 997)
und einer Mikroschlauchpumpe für die Überführung der bestrahlten
Lösung in die Meßküvette. Die Latenzdauer (Lagphase) der
Photochemolumineszenz (PCL) ist proportional der Menge der in die
Lösung gegebenen antiradikalisch wirkenden nichtenzymatischen
Substanzen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur
Bestimmung der Ascorbinsäure zu entwickeln.
Im Photochemolumineszenz(PCL)-Meßsystem können zwar Radikalfän
ger, wie z. B. Harnsäure, als reine Substanz quantifiziert werden
(DD-PS 3 00 328), für das klinisch relevante Vitamin C war eine
Bestimmung in Gemischen, wie z. B. im Blutplasma, wegen der
interferierenden Wirkungen mit anderen Radikalfängern nicht
möglich. Dabei standen folgende Hindernisse im Vordergrund:
- 1. der geringe Anteil der Ascorbinsäure an der gesamten antiradikalen Kapazität des Blutplasmas. Nach der selektiven Entfernung der Harnsäure mit Hilfe von Uratoxidase enthält die für die Messung notwendige Materialmenge soviel Proteine, die die Chemolumineszenz hemmen, daß eine direkte Messung nicht gelingt;
- 2. die zu geringe Differenz der Molekulargewichte von Harnsäure und von Ascorbinsäure. Der Versuch, mit Hilfe der Gelchromatographie das Material in mehrere Fraktionen der einzelnen Stoffe zu trennen, bringt keinen Erfolg, da die Molekulargewichte der Harnsäure (168) und der Ascorbinsäure (176) zu dicht beieinander liegen;
- 3. der Angriff der Uratoxidase auch auf die Ascorbinsäure. Zwar können die schwereren Proteine entfernt werden, doch während der nachfolgenden Anwendung der Uratoxidase werden beträchtliche, unkontrollierbare Mengen der Ascorbinsäure auto- bzw. mitoxidiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Testbesteck
zu entwickeln, das zur Bestimmung der Ascorbinsäure in
biologischen Proben geeignet ist.
Die Aufgaben der Erfindung wurden dadurch gelöst, daß die
störende Wirkung von Proteinen durch vorhergehende Fraktionierung
des zu untersuchenden Materials mit Hilfe der Gelchromatographie
beseitigt und der Großteil des Wassers, etwa 90%, in der
Reagenzpufferlösung durch ein organisches wasserlösliches
Lösungsmittel ersetzt wird.
Das Testbesteck zur Bestimmung der Ascorbinsäure beseht aus einem
organischen wasserlöslichen Lösungsmittel, einer 0,2 molaren
Karbonatlösung und aus Luminol. Als Karbonat findet vorzugsweise
Natriumkarbonat und als organisches Lösungsmittel vorzugsweise
Methanol, das Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält,
Verwendung. Zu dieser Lösung wird ein Eluat gegeben, das aus der
zu untersuchenden Probe nach Durchlauf einer Entsalzungssäule und
Eluierung mit PBS - Phosphate Buffer Saline - gewonnen wird.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die Lösung des
Problems des gleichzeitigen Vorhandenseins von Ascorbinsäure
neben Harnsäure darin liegt, daß ein Teil des Wassers im
Reagenzpuffer durch ein organisches wasserlösliches Lösungsmittel
ersetzt wird. In diesem System zeigen beide Säuren qualitativ
unterschiedliches Verhalten: Die Ascorbinsäure ist durch eine
typische Lag-Phase der Photochemolumineszenz gekennzeichnet. Nur
sie zeigt die typische Lag-Phase der PCL, die Harnsäure dagegen
nicht; sie hemmt lediglich die Intensität der PCL.
Ebenfalls überraschend kommt dazu, daß bei Verwendung geeigneter
Entsalzungssäulen sich die Peaks der beiden Säuren nur
geringfügig überschneiden, so daß der Einfluß der Harnsäure auf
die Genauigkeit der Vitamin-C-Bestimmung vernachlässigt werden
kann.
In der im PCL-Meßsystem zu untersuchenden Probe wird die Dauer
der Lag-Phase mit einer Eichkurve (Fig. 1) verglichen.
Das Ergebnis entspricht direkt der Konzentration der
Ascorbinsäure in der zu untersuchenden Probe, z. B. im Blutplasma,
mit einem Umrechnungsfaktor für das Gesamtvolumen des Eluats, das
sich auf das selbe Plasma bezieht.
1 ml Blutplasma wird in einer Entsalzungssäule der Firma Bio-Rad
mit PBS-Lösung eluiert. 100 mkl des Eluats werden nach Durchlauf
von 8 ml des Eluents im PCL-Meßsystem untersucht und die Dauer
der Lag-Phase mit einer Eichkurve (Fig. 1) verglichen.
Das Ergebnis entspricht direkt der Konzentration der
Ascorbinsäure im Blutplasma mit einem Umrechnungsfaktor für das
Gesamtvolumen des Eluats, das dem selben Plasma entspricht.
Ein Gewebestückchen von 100 mg, z. B. aus der Leberbiopsie, wird
in 1 ml PBS homogenisiert und anschließend bei 10000 g 10 Minuten
zentrifugiert (bzw. filtriert).
Der Überstand wird nach der Eiweißfällung bzw. Säulenchromatogra
phie (s. oben) direkt für die Messung verwendet.
Das notwendige Volumen ist gewebeartabhängig und wird nach einer
orientierenden Messung von 10 mkl präzisiert (Volumenerhöhung
bzw. Verdünnung).
Das Testbesteck besteht aus 6 Flaschen:
1 mal 40 ml 0,2 M Karbonatlösung
1 mal 50 ml Methanol p.a. mit einem pH-Wert von 10,8 durch Zugabe von 10 mg EDTA
4 mal 2 ml Luminollösung (3 mmol/l) in schwarzen Fläschchen (die Portionierung und die Abdunkelung sind wegen der hohen Lichtempfindlichkeit erforderlich).
1 mal 40 ml 0,2 M Karbonatlösung
1 mal 50 ml Methanol p.a. mit einem pH-Wert von 10,8 durch Zugabe von 10 mg EDTA
4 mal 2 ml Luminollösung (3 mmol/l) in schwarzen Fläschchen (die Portionierung und die Abdunkelung sind wegen der hohen Lichtempfindlichkeit erforderlich).
Der gesamte Meßvorgang wird folgendermaßen gestaltet:
2,2 ml der Methanollösung werden mit 200 mkl Puffer vermischt und 100 mkl der Probe (beim Leerwert reine PBS-Lösung) zugegeben.
2,2 ml der Methanollösung werden mit 200 mkl Puffer vermischt und 100 mkl der Probe (beim Leerwert reine PBS-Lösung) zugegeben.
Anschließend werden 25 mkl der Luminollösung eingespritzt, und
das Gemisch wird in das Photochemoluminometer gegeben.
Nach der Messung wird das Gerät 2mal mit Aquabidest und 1 mal
mit 1 ml reinem Methanol gespült.
Claims (7)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Ascorbinsäure
(Vitamin C) in biologischen Proben mit Hilfe der Messung ihrer
antiradikalen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß in einem
Photochemolumineszenz(PGL)-Meßsystem eine zu untersuchende Probe
gelchromatographisch fraktioniert und der Großteil des Wassers
durch ein organisches wasserlösliches Lösungsmittel ersetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biologische Probe aus Körperflüssigkeiten, wie Blutplasma, aus
Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten und das organische
Lösungsmittel aus einem niederen Alkohol, vorzugsweise aus
Methanol, besteht.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß Blutplasma in einer Entsalzungssäule mit PBS-(Phosphate
Buffer Saline)-Lösung eluiert, das Eluat im PCL-Meßsystem
untersucht und die Dauer der Lag-Phase mit einer Eichkurve
verglichen wird.
4. Testbesteck zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) in
biologischen Proben
mit Hilfe eines Photochemolumi
neszenz(PCL)-Meßsystems, bestehend aus Photosensibilisator,
basischer Pufferlösung und einen Hilfsstoff enthaltenden
wasserlöslichem organischen Lösungsmittel.
5. Testbesteck nach Anspruch 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die biologische Probe aus
Körperflüssigkeiten, z. B. Blutserum,
Gewebehomogenaten oder Zell-Lysaten besteht.
6. Testbesteck nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es
aus einer Luminollösung, einer Karbonatlösung und Dinatriumethy
lendiamintetraacetat (EDTA) enthaltendes Methanol besteht.
7. Testbesteck nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeich
net, daß es aus Luminollösungen mit 3 mmol/l Luminol, 0,2 molarer
Karbonatlösung und EDTA enthaltendes Methanol mit einem pH-Wert
von 10,8 besteht.
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